Artykuł badawczy
* These authors contributed equally
Protokół ten umożliwia integrację sekwencjonowania nowej generacji oraz wielokolorowej immunofluorescencji w celu profilowania gruczolakoraka płuc. Celem jest analiza związku między heterogenicznością genomową a gęstością komórek immunologicznych infiltrujących guz. To wielowymiarowe podejście ułatwia kompleksową ocenę mikrośrodowiska guza w celu oceny prognosycznej po operacji.
Rokowanie gruczolakoraka płuc (LUAD) tradycyjnie ocenia się za pomocą etapu przerzutów guz-węzła (TNM), które nie uwzględnia stanu odpornościowego pacjenta. Protokół ten integruje profilowanie genomowe oraz analizę mikrośrodowiska immunologicznego, aby ułatwić bardziej kompleksową ocenę prognostyczną po operacji. Metoda polega na retrospektywnej analizie tkanek nowotworowych osadzonych w parafinie, wykorzystując dwie główne techniki. Najpierw następna generacja sekwencjonowania (NGS) jest wykonywana za pomocą spersonalizowanego panelu 37-genowego, aby zidentyfikować mutacje w genach napędzających i wariantach o niepewnym znaczeniu. Po drugie, multipleksowa immunofluorescencja (mIF) jest wykorzystywana do celowania w markery takie jak HLA-DR, CD68, CD163, CD206, PD-L1 i PanCK. Umożliwia to ilościowe określenie rozkładu przestrzennego i gęstości dla konkretnych subpopulacji komórek odpornościowych w różnych regionach guza. To zintegrowane podejście umożliwia jednoczesną ocenę heterogeniczności genomowej oraz cech komórek odpornościowych infiltrujących guz. Uzyskane dane identyfikują konkretne kombinacje profili mutacyjnych — takich jak status EGFR — oraz gęstość komórek odpornościowych. Te zintegrowane kombinacje umożliwiają badanie ich wspólnego wpływu na przeżycie pacjentów, oferując obiecujące podejście do rozwoju przyszłych modeli prognostycznych raka płuc. Protokół ten demonstruje solidną metodę charakteryzowania złożonych cech biologicznych mikrośrodowiska guza LUAD.
LUAD jest najczęstszym podtypem raka płuc, jednak średni 5-letni wskaźnik przeżycia pozostaje niski, wynoszący około 15%1. Obecna ocena prognostyczna opiera się głównie na systemie stadowania TNM; Jednak ta metoda często pomija ogólny stan odpornościowy pacjenta, co może ograniczać jej dokładność predykcyjną. Dowody sugerują, że zarówno heterogeniczność genomowa, jak i mikrośrodowisko guza (TME) odgrywają kluczową rolę w nowotworze i postępie choroby LUAD 2,3.
W ostatnich latach przejście od tradycyjnego sekwencjonowania Sangera do NGS umożliwiło wysokoczułą, jednoczesną analizę wielu genów napędowych, takich jak EGFR, TP53 i KRAS 4,5. Chociaż NGS dostarcza wysokorozdzielczej mapy zmian genetycznych, same dane genomowe nie są w stanie uchwycić złożonych interakcji komórkowych i organizacji przestrzennej w ramach TME.
Aby sprostać tym złożonościom, mIF oferuje znaczące przewagi w porównaniu z tradycyjnymi metodami profilowania odpornościowego. Podczas gdy immunohistochemia pojedynczego pleksu (IHC) ogranicza się do jednego markera na przekrój, mIF umożliwia jednoczesne wykrywanie wielu markerów białkowych, zachowując jednocześnie architekturę przestrzenną tkanki. W przeciwieństwie do sekwencyjnego IHC, które może powodować degradację tkanek, lub cytometrii przepływowej i sekwencjonowania RNA objętościowego, które skutkują utratą lokalizacji przestrzennej i rozdzielczości pojedynczych komórek 6,7,8, mIF w połączeniu z anotacją regionów przestrzennych umożliwia in situ, wieloparametrową charakterystykę krajobrazu odpornościowego9.
Protokół ten ustanawia połączony workflow integrujący ukierunkowane NGS, mIF oraz ocenę regionów przestrzennych (obejmującą całą tkankę, granicę guza i rdzeń guza). Takie wielowymiarowe podejście jest niezbędne do zbadania współzależności między zmianami genomowymi a gęstością komórek odpornościowych — zależności, której podejścia jednomodalne często nie potrafią oddać. Poprzez ocenę tych zintegrowanych cech, protokół ten zapewnia uzupełniającą strategię charakteryzacji cech biologicznych LUAD oraz oferuje bardziej solidne ramy dla pooperacyjnej stratyfikacji prognosycznej.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
To badanie retrospektywne zostało zatwierdzone przez Komitet Etyki Medycznej Szpitala Kunming Yan'an (nr zatwierdzenia 2021-140-01). Wszyscy uczestnicy uzyskali świadomą zgodę.
Projekt badania i zbieranie próbek
Do grupy włączono 63 pacjentów z patologicznie lub histologicznie potwierdzonym LUAD, którzy przeszli resekcję chirurgiczną w latach 2015–2021. Kryteria wykluczenia obejmowały otrzymanie neoadiuwantowej chemioterapii, radioterapii lub immunoterapii przed operacją. Dodatkowo z analizy wykluczono pacjentów z jednoczesnymi nowotworami, ciężkimi chorobami współwystępującymi, niską jakością tkanek lub niekompletną dokumentacją kliniczną. Bloki nowotworowe z parafiną utrwaloną formaliną (FFPE) zostały przetworzone w sekcje o grubości 1 mm do deparafinizacji. Jak pokazano w procesie pracy (Rysunek 1), próbki te przeszły zintegrowaną analizę z użyciem mIF i docelowego NGS. To połączone podejście umożliwia jednoczesną ocenę zmian genomowych i cech mikrośrodowiska immunologicznego, dostarczając wielowymiarowych ram do charakteryzacji biologii nowotworów.
Dalsze działania
Leki celowane, immunoterapia oraz postęp choroby lub zgonu były śledzone telefonicznie, a szczegółowe informacje o stanie przeżycia, postępie lub nawrocie choroby, leczeniu adiuwantowym po operacji oraz ewentualnych nowo zdiagnozowanych chorobach. Czas obserwacji zakończył się w lipcu 2023 roku, a ostatecznym punktem obserwacji był postęp choroby lub śmierć. Przeżycie ogólne definiowano jako czas od rozpoczęcia operacji do śmierci pacjenta. Nie straciliśmy pacjentów na kontrolę. Minimalny czas obserwacji wynosił 21 miesięcy.
Przygotowanie i sekwencjonowanie biblioteki NGS
Ekstrakcja DNA z przekrojów tkanek FFPE
Pobierz przekroje tkanek FFPE (o grubości 3–10 μm) z preparatów patologicznych. Umieść fragmenty w sterylnych rurkach mikrowirówki. Dodaj ksylen do każdej probówki i inkubuj przez 5–10 minut w temperaturze pokojowej, aby usunąć parafinę. Wiruj w 12 000 x g przez 5 minut i ostrożnie wyrzucaj supernatant. Powtórz terapię ksylenową 1 raz, aby zapewnić całkowitą deparafinizację. Myj pellet kolejno 100% etanolem 2 razy, aby usunąć pozostałości ksylenu. Susz pellet na powietrzu w temperaturze pokojowej, aż resztki etanolu całkowicie wyparują. Dodaj odpowiedni bufor lizowy i proteinazę K (dostępne w zestawie do ekstrakcji DNA) i inkubuj w temperaturze 56 °C przez 1–3 godziny (lub noc, jeśli to konieczne), aż tkanka zostanie całkowicie zlikwidowana. Wykonaj dodatkową inkubację w temperaturze 90 °C przez 1 godzinę, aby odwrócić sieciowanie formaliny. Ekstrakcja genomowego DNA za pomocą komercyjnego zestawu do ekstrakcji DNA FFPE (patrz Tabela materiałów) zgodnie z instrukcjami producenta. Jakość DNA z próbek FFPE jest często fragmentowana; dlatego jakość DNA powinna spełniać minimalne progi integralności (np. DIN ≥ 5), aby zapewnić pomyślne przygotowanie biblioteki do docelowych NGS.
Ilościowa i normalizacja DNA
Ilościowo określ DNA metodą fluorometryczną, aby zapewnić dokładny pomiar stężenia. Normalizować próbki DNA do końcowego stężenia około 5–10 ng/μL, używając buforu Tris-HCl (pH 8,5). Stopniowo wykonuj kroki rozcieńczania, jeśli to konieczne, aby zapewnić dokładność i stabilność stężenia DNA.
Przygotowanie biblioteki i wzbogacenie celów
Przygotuj biblioteki sekwencjonujące z wykorzystaniem hybrydowego, ukierunkowanego NGS na DNA wyodrębnionym z tkanki FFPE10. Wykonaj wzbogacenie celów za pomocą spersonalizowanego panelu sondowego obejmującego egzonowe obszary wybranych genów związanych z rozwojem guza. Ocena jakości biblioteki i rozkładu rozmiaru fragmentów za pomocą standardowych metod (np. systemów opartych na elektroforezie), jeśli jest to konieczne.
Pulowanie i sekwencjonowanie bibliotek
Ilościowo określ każdą bibliotekę za pomocą testu fluorometrycznego. Biblioteki pulowe w stężeniach równomolowych zgodnie z wymaganiami zestawu sekwencjonowania. Załaduj biblioteki z pulą na platformę sekwencjonowania Illumina i wykonuj sekwencjonowanie według wzoru sekwencjonowania parowego 150 bp.
Przetwarzanie danych i wykrywanie wariantów
Odczyty sekwencjonowania surowego były przetwarzane przy użyciu standardowych potoków bioinformatycznych, w tym przycinania adapterów, filtrowania jakości oraz dopasowania do ludzkiego genomu referencyjnego (GRCh37/hg19). Wskaźniki kontroli jakości były następujące: > kwartał 25%, średnia głębokość sekwencjonowania > 2500x, wskaźnik trafienia > 65%, a kara bazowa Fold 80 ≤ 2. Kontrola jakości i wyrównanie: Surowe dane FASTQ przeszły kontrolę jakości za pomocą FastQC i Trim Galore (lub Trimmomatic), aby usunąć zanieczyszczenia adapterami i sekwencje niskiej jakości. Czyste odczyty były wyrównywane z ludzkim genomem referencyjnym GRCh37 (hg19) za pomocą nakładki Burrows-Wheeler (BWA). Przetwarzanie po wyrównaniu: Sortowanie, oznaczanie duplikatów oraz rekalibracja podstawowego wyniku jakości (BQSR) zostały wykonane przy użyciu Picarda i Genome Analysis Toolkit (GATK), aby zminimalizować liczbę fałszywie pozytywnych wywołań. Wywołanie wariantów: Polimorfizmy pojedynczych nukleotydów linii germin (SNP) oraz InDels zostały wykryte za pomocą BWA MEM (0.7.16a - r1181). Somatyczne SNV i InDely zostały zidentyfikowane poprzez podejście konsensusowe, wykorzystujące Mutect2 i VarScan2. Mutacje niskoczęstotliwościowe zostały dodatkowo ocenione za pomocą modelu statystycznego Freebayesa (v 1.3.2). Adnotacje i filtrowanie: Warianty były anotowane za pomocą ANNOVAR, integrując dane z gnomAD, ClinVar i COSMIC. Warianty linii zarodkowej odróżniano od mutacji somatycznych poprzez filtrowanie wysokoczęstotliwościowych populacji SNP oraz ocenę częstości alleli wariantów (VAF). Progi VAF: Dla zdarzeń klonalnych (np. ROS1 i ALK) zastosowano próg VAF ≥5%, natomiast próg 1% zastosowano do mutacji genów (np. EGFR), aby zapewnić wykrywanie zmian o niskiej częstotliwości, co było możliwe dzięki wysokiej średniej głębokości sekwencjonowania >500x. Mutacje linii zarodczej zostały odróżnione od mutacji somatycznych na podstawie danych z projektu 1000 Genomes (1000G) oraz lokalnej bazy danych zdrowych osób Han Chińczyków ustanowionej w naszym laboratorium. Ocena patogenności wykrytych wariantów somatycznych została przeprowadzona zgodnie z ramami AMP/ASCO/CAP11, które udoskonalają klasyfikację dowodów dla wariantów somatycznych poprzez wielopoziomowe, oparte na dowodach podejście. Warianty patogenne/prawdopodobnie patogeniczne (P/LP) są zachowywane, a ich klasyfikacja opiera się na kryteriach Tier I/II, wymagających dowodów A/B (FDA zatwierdzenie, badania kliniczne) lub C/D (prekliniczne/studia przypadków) do oceniania. Tier III (VUS) nie posiada jednoznacznych dowodów, natomiast Tier IV wskazuje na łagodne warianty poprzez częstotliwość populacji (np. gnomAD) lub badania funkcjonalne; Te mutacje są wykluczone z późniejszych analiz. Ocena patogenności wykrytych wariantów linii germinalnej została przeprowadzona zgodnie z wytycznymi ACMG/AMP12. W badaniu odnotowano warianty patogennych (P), prawdopodobnie patogennych (LP) oraz niepewnych istotnych (VUS). W analizach końcowych uwzględniono tylko warianty o wysokim poziomie zaufania, spełniające kryteria kontroli jakości (QUAL ≥1; głębokość pokrycia >10 dla mutacji linii zarodkowej i głębokość pokrycia >500x dla mutacji somatycznej)
Przygotowanie próbki z tkanki FFPE
Przygotowanie sekcji parafinowych
Pociń bloki tkanek FFPE na sekcje o grubości 3 μm za pomocą mikrotomu. Unieś fragmenty na wodzie w kąpieli wodnej o temperaturze 40–45 °C, aby spłaszczyć tkankę. Montaż sekcji na klejących szkiełkach mikroskopowych i susz w temperaturze pokojowej. Umieść preparaty w suszarni o temperaturze 65 °C na 1 godzinę, aby zapewnić solidne przyleganie tkanek do preparatów i stopić nadmiar parafiny.
Deparafinizacja i nawodnienie
Umieść szkiełka w stojaku do bejcowania i zanurz je w roztworze oczyszczającym I na 5 minut. Przenosi preparaty kolejno do roztworu II i roztworu III, każdy po 5 minut, aby całkowicie rozpuścić parafinę. Przelej szkiełka do 100% etanolu na 3 minuty, aby usunąć resztki odczynnika klarnego. Rehydratuj przekroje tkanek za pomocą serii ethanolu o stopniu: 95% etanolu przez 3 minuty i 80% etanolu przez 3 minuty. Płukam 2 razy w wodzie destylowanej, zostawiając 3 minuty między płukaniami. Ksylen i etanol używane podczas deparafinizacji były przetwarzane w chemicznym okapu spalinowym ze względu na ich lotność i toksyczność. Wszystkie roztwory odpadów zawierające rozpuszczalniki organiczne były zbierane oddzielnie i utylizowane zgodnie z wytycznymi instytucjonalnymi dotyczącymi utylizacji odpadów niebezpiecznych.
Przegroda do bejcowania HE
Barwienie hematoksyliny i eozyny
Zanurz szkiełka po deparafinizacji i rehydratacji w roztworze hematoksyliny na 5–10 minut w temperaturze pokojowej. Płukam pod bieżącą wodą z kranu przez 5 minut. Różnicuj wsuwanie się 1% alkoholu solnego przez kilka sekund (3–10 s). Natychmiast spłuknij w bieżącej wodzie z kranu. Niebieskie jądra przez zanurzenie szkiełek w wodzie z kranu lub roztworze niebieskiego przez 5 minut. Zanurz szkiełka w roztworze eozyny na 1–3 minuty w temperaturze pokojowej. Jeśli trzeba, krótko spłukaj w wodzie destylowanej.
Odwodnienie i oczyszczanie
Suszenie przechodzi przez etanol z klasą: 80% etanolu przez 1 minutę; 95% etanolu przez 1 minutę, a 100% etanolu dwa razy przez 1 minutę. Przezroczyste preparaty w ksylenie I–II, 2–5 minut każdy.
Montaż
Nałóż kroplę neutralnego balsamu. Delikatnie załóż pokrywkę, aby uniknąć powstawania pęcherzyków powietrza. Pozwól szkiełkom wyschnąć w temperaturze pokojowej przed wykonaniem obrazowania.
Wielowarstwowe barwienie immunofluorescencyjne przekrojów tkanek FFPE
Przeprowadzono sekwencyjne multipleksowe barwienie immunofluorescencyjne, aby wykryć wiele markerów immunologicznych i nowotworowych na tym samym przekroju tkanki. Takie podejście umożliwia wizualizację in situ różnorodnych populacji komórek, zachowując jednocześnie kontekst przestrzenny13. Pobieranie antygenów: Napełnij słoik do barwienia buforem antygenowym. Włóż słoik do mikrofalówki i podgrzej na dużej mocy przez 3-5 minut, aż roztwór zacznie się gotować. Ostrożnie przenieś preparaty po deparafinizacji i nawodnieniu do podgrzanego bufora pobierania, upewniając się, że przekroje tkanek są całkowicie zanurzone. Ciepło ślizga się z niską mocą mikrofalową przez 15 minut, aby umożliwić efektywne odmaskowanie antygenów. Po podgrzaniu pozwól zjeżdżalniom naturalnie schłodzić w temperaturze pokojowej przez 30 minut. Przełóż szkiełka do lodowatej wody na 5 minut, aby zatrzymać proces pobierania antygenów.
Płukanie i przygotowanie bariery hydrofobowej
Płucz ślizgi 1 razy wodą destylowaną, aby usunąć pozostałości bufora pobierania. Użyj hydrofobowego długopisu barierowego, aby narysować okrąg wokół każdego fragmentu tkanki. Ponownie krótko przepłukam wodą destylowaną. Wash slide 2x z buforem TBST. Po każdym myciu umieść szkiełki poziomo na 3 minuty, aby dokładnie usunąć bufor.
Blokowanie
Nałóż bufor blokujący, aby całkowicie pokryć przekrój tkanki (~100 μL na preparat). Inkubuj preparaty w nawilżonej komorze w temperaturze pokojowej przez 15 minut.
Inkubacja przeciwciał pierwotnych
Usuń bufor blokujący, delikatnie stukając krawędzią suwaka o chłonny papier. Pierwotne przeciwciała przeciwko HLA-DR, CD68, CD163, CD206, PD-L1 i PanCK zostały zastosowane przy optymalnych rozcieńczeniach roboczych w zakresie od 1:100 do 1:400. Nałóż ~100 μL rozcieńczonego roztworu przeciwciał pierwotnych na każdy przekrój tkanki. Inkubuj preparaty w nawilżonej komorze: 37 °C przez 1 godzinę lub 4 °C przez noc dla zwiększenia czułości.
Pranie
Wash slide 3 razy z buforem TBST, po 3 minuty za każdym washem. Po każdym płukaniu umieszczaj zjeżdżalnie poziomo, aby umożliwić odpływ buforowy.
Wtórna inkubacja przeciwciał
Przygotuj roztwór przeciwciał wtórnych, rozcieńczając bufor TBST w stosunku 1:3. Na każde szkiełko należy nałożyć około 100 μL wtórnego roztworu przeciwciał. Inkubacja zsuwa się w temperaturze 37 °C przez 10 minut w nawilżonej komorze. Wash slide 3 razy z TBST, po 3 minuty za każdym washem.
Wzmacnianie sygnału fluorescencyjnego
Rozcieńcz fluorescencyjną reagentę wzmacniającą w proporcji 1:100 w buforze wzmacniającym. Na każde szkiełko należy nałożyć 100 μL rozcieńczonego odczynnika. Inkubuj preparaty w temperaturze pokojowej przez 10 minut w ciemności, aby zapobiec fotobieleniu. Wash slide 3 razy z TBST, po 3 minuty za każdym washem.
Pobieranie antygenów między markerami
Wykonaj mikrofalowe pobieranie antygenów zgodnie z opisanem. Po podgrzaniu chłodne przesuwa się kolejno: 5 minut w ciepłej wodzie i 5 minut w lodowatej wodzie.
Sekwencyjne barwienie dodatkowych markerów
Powtarzaj pierwotne i wtórne kroki inkubacji przeciwciał dla każdego dodatkowego markera przeciwciał. Upewnij się, że pobieranie antygenów jest przeprowadzane po barwieniu każdego markera, zanim przejdziesz do kolejnego przeciwciała.
Jądrowe barwienie przeciwbarwne
Wash slide raz z buforem TBST. Nałóż barwnik nuklearny DAPI. Inkubuj w temperaturze pokojowej przez 5 minut w ciemności. Płucz ślizgi 3 razy wodą destylowaną. Określenie punktu końcowego: Jądra powinny być wyraźnie zabarwione pod mikroskopią fluorescencyjną.
Barcowanie tylko na końcowym markerze
Rozprowadź roztwór biotyny rozcieńczony w 1:200 w buforze wzmacniającym, inkubuj przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Wash slide 3x z buforem TBST. Wykonaj pobranie antygenu zgodnie z opisaniem. Wash slide 3x z buforem TBST. Stosuj endogenny odczynnik blokujący biotynę, inkubuj w temperaturze 37 °C przez 30 minut. Nałóż barwnik barwiący w skali 1:100 w TBST i inkubuj przez 30 minut w temperaturze pokojowej w ciemności. Płucz ślizgi 1 razy z TBST i pozwól odprowadzić 3 minuty.
Montaż
Dodaj kroplę medium antyfade Mounting Medium na część tkanki. Ostrożnie załóż na zjeżdżalni slip. Pozwól preparatom wyschnąć przed zdjęciami.
Pozyskiwanie obrazów sekcji H&E i mIF
Całe obrazy preparatów (WSI) przekrojów tkanek barwionych H&E i mIF FFPE zostały wykonane za pomocą skanera szkiełek. Skanowanie w świetle pola jasnym wykonywano dla sekcji H&E, natomiast skanowanie fluorescencyjne stosowano dla sekcji mIF. Cel: 20x powiększenie do przeglądu skanowania; Powiększenie 40x do obrazowania regionalnego o wysokiej rozdzielczości. Ustawienia wzbudzenia i emisji: Zoptymalizowane dla każdego fluoroforu zgodnie ze specyfikacjami producenta. Czas naświetlenia i wzmocnienie: Automatycznie regulowane przez oprogramowanie obrazujące, aby zapewnić odpowiednią intensywność sygnału bez nasycenia.
kontrola jakości mIF i wycenialność obrazu
Aby zapewnić wiarygodność wyników mIF, przed klasyfikacją tkanek i ilościową ilością komórek za pomocą cyfrowego systemu patologii HALO wdrożono rygorystyczny protokół kontroli jakości. Usuwanie artefaktów i ewaluacyjne definiowanie obszaru: Obrazy całych slajdów (WSI) zostały skrupulatnie przeanalizowane, aby ręcznie wykluczyć obszary zawierające fałdy tkanek, artefakty barwienia oraz niespecyficzne sygnały tła. Ten krok był niezbędny, aby zapobiec fałszywie pozytywnym sygnałom i zapewnić dokładność analizy przestrzennej. Po tym badaniu średnio 80% (zakres: 50%–95%) powierzchni tkanek we wszystkich próbkach zostało wyznaczonych jako region ewalecyjny mIF. Weryfikacja patologiczna i podział: Aby dokładnie wyznaczyć przedziały guza i stromalne, przekroje mIF zostały porównane z sąsiednimi sekcjami seryjnymi barwionymi H&E. Adnotacje były niezależnie przeglądane przez dwóch doświadczonych patologów, a wszelkie rozbieżności rozwiązano konsensusem. Próbki o powierzchni tkanki nowotworowej mniejszą niż 30% zostały wykluczone z badania, aby zachować rygorystykę analityczną. Walidacja po kwantyfikacji: Po automatycznym fenotypowaniu i ilościowości komórek, patologowie ponownie ocenili przestrzenne wzorce rozkładu i ekspresji subpopulacji komórek odpornościowych. Przegląd ten zapewnił, że cyfrowe dane ilościowe są zgodne z leżącymi u podstaw cechami histomorfologicznymi, co gwarantowało wiarygodność i dokładność wyników.
Cyfrowa analiza patologii i adnotacje regionowe
Panoramiczne zeskanowane obrazy zostały zaimportowane do cyfrowej platformy analizy obrazów patologicznych w celu przetwarzania. Do segmentacji i identyfikacji komórek użyto wtyczki HALO AI Nuclei Seg-Plugin. Korzystając z barwienia H&E jako odniesienia, ręcznie zanotowano następujące obszary zainteresowania (ROI): Cały region guza (WSIT); Granica guza (TB); Rdzeń guza (TC). Pozytywne wykrywanie sygnału zostało określone na podstawie progów intensywności fluorescencji oraz oczekiwanej podkomórkowej lokalizacji każdego markera. To podejście specyficzne dla przedziałów zastosowano, aby zminimalizować zakłócenia tła i poprawić dokładność identyfikacji komórek odpornościowych. Gęstość komórek odpornościowych została zmierzona jako liczba komórek markerowych dodatnich w wybranych obszarach guza. Zrównaj obrazy mIF z odpowiadającymi adnotacjami pochodzącymi z H&E opartymi na morfologii tkanek. Pacjenci zostali podzieleni na grupy o wysokiej i niskiej gęstości zgodnie z medianą gęstości komórek odpornościowych dla każdego markera.
Analiza statystyczna
Do analizy zastosowano oprogramowanie SPSS 17.0. Dane o rozkładzie normalnym wyrażano jako średnią ± odchylenie standardowe, a dane ilościowe o rozkładzie nienormalnym jako medianę (zakres kwantyli 25%-75%). Korelacja między typem mutacji genu, gęstością komórek odpornościowych oraz cechami klinicznymi została przeanalizowana za pomocą modelu regresji hazardów proporcjonalnych Coxa przy użyciu modelu lifelines pythona. W zależności od wielkości próby i tego, czy dane odpowiadały rozkładowi normalnemu, do porównania zmiennych ciągłych użyto testu Studenta lub testu Mann-Whitney U. Test rangi znakowej Wilcoxona był używany do porównania zmiennych rangi. Test chi-kwadrat, czyli test dokładny Fishera, został wybrany do analizy nieuporządkowanych zmiennych kategorycznych według wielkości próby i teoretycznej częstotliwości. Test Spearmana lub test Pearsona był używany do analizy korelacji. Ogólny wskaźnik przeżycia pacjentów uzyskano metodą Kaplana-Meiera, a do testów zastosowano test Log-rank. Krzywe przetrwania były rysowane za pomocą języka R opartego na oprogramowaniu RStudio. Wartość p <0,10 została uznana za statystycznie istotną.
Praktyczne zastosowanie i ograniczenia
Aby niezawodnie wdrożyć ten zintegrowany przepływ pracy, bloki tkankowe FFPE muszą spełniać rygorystyczne standardy jakości, w tym idealną komórkowość nowotworu na poziomie ≥30% oraz brak rozległej martwicy lub istotnych artefaktów tkankowych. Sukces techniczny mIF w dużej mierze zależy od zachowania tkanek; Czynniki takie jak nadmierne utrwalenie, nadmierne uszkodzenia czy wysoka autofluorescencja tła mogą prowadzić do niewystarczającej penetracji przeciwciał i nieoptymalnej intensywności sygnału. Ponadto należy wziąć pod uwagę kilka wewnętrznych ograniczeń tego badania. Po pierwsze, analiza opiera się na retrospektywnej, jednoośrodkowej kohorcie 63 pacjentów, co może ograniczać moc statystyczną i szeroką uogólnialność wyników na inne populacje. Po drugie, zakres oceny ogranicza się do stałego panelu NGS z 37 genami oraz określonego zestawu markerów odpornościowych (HLA-DR, CD68, CD163, CD206, PD-L1 i PanCK; Tabela uzupełniająca 1). Jak zauważono w źródłach, choć to połączone podejście zapewnia bardziej solidne ramy dla stratyfikacji prognosycznej, konieczne są większe badania prospektywne, wieloośrodkowe, aby dalej weryfikować te powiązania i udoskonalać użyteczność predykcyjną zidentyfikowanych biomarkerów.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Cechy kliniczne pacjentów z gruczolakorakiem płuc
W tym badaniu zebrano łącznie 63 pacjentów, u których zdiagnozowano LUAD i którzy przeszli zabieg chirurgicznyw naszym szpitalu w latach 2015–2021 spełniających kryteria włączenia. Charakterystyki kliniczne uwzględnionych pacjentów przedstawiono w Tabeli 1. Wśród pacjentów zapisanych mediana wieku wynosiła 60 lat (47-73 lata), w tym 30/63 pacjentów mężczyzn (46,2%) oraz 33/63 kobiety (53,8%). Było 23 z 63 pacjentów z histori...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Zintegrowane profilowanie immunologiczne genomowe i przestrzennie rozstrzygnięte LUAD
Badanie to demonstruje zintegrowany przepływ pracy łączący ukierunkowany NGS i mIF do charakteryzacji wielowymiarowego krajobrazu LUAD. Nasze wyniki genomowe są zgodne z wcześniejszą literaturą, szczególnie dotyczącą etnicznych różnic częstotliwości mutacji. Zaobserwowany wskaźnik mutacji EGFR (około 40%-60%) jest zgodny z zgłaszanymi częstościami w populacjach azjatyckich, które są istotnie wyższe niż w k...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Autorzy deklarują brak relacji handlowych ani finansowych, które mogłyby być uznane za potencjalny konflikt interesów.
Prace te zostały wsparte przez Projekt Planu Medycznego i Zdrowotnego Nauk i Technologii Prowincji Zhejiang (2022KY1237); Projekt Funduszu Badań Naukowych Departamentu Edukacji Yunnanu (2025Y0387); Kluczowy Program Badań i Rozwoju Yunnanu (202403AC100002).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Zestaw AlphaTSA Multiplex IHC | alphaxbio Technology Co., Ltd. | AXT36025011 | Barwienie immunofluorescencyjne multipleksowe |
| Medium montażowe antyfade | Leagene Technology Co., Ltd. | IH0252, Lot0525A17 | Barwienie immunofluorescencyjne multipleksowe |
| CD163 | Beijing Zhongshan Golden Bridge Biotechnology Co. Ltd | ZM0428 | RRID: AB_3714707; Barwienie immunofluorescencyjne multipleksowe |
| CD206 | Abcam, Inc | Cat# 5307-1 | RRID: AB_10896526; Barwienie immunofluorescencyjne multipleksowe |
| CD68 | Beijing Zhongshan Golden Bridge Biotechnology Co. Ltd | ZM0060 | RRID: AB_2904190; Barwienie immunofluorescencyjne multipleksowe |
| Spersonalizowany panel genów nowotworowych | TWIST Co., Ltd. | Przygotowanie biblioteki NGS | |
| Deparafinizacja Buffe | QIAGEN Co., Ltd. | 19093 | Ekstrakcja DNA, barwienie HE; Multipleksowe barwienie immunofluorescencyjne z przekrojów tkanek FFPE |
| Dynabead M-270 streptavidin | Thermo Co., Ltd. | 65602 | Przygotowanie biblioteki NGS |
| Fluorometr | ThermoFisher Scientific Co., Ltd. | QUBIT 4.0 | Przygotowanie biblioteki NGS |
| Cyfrowa platforma do analizy obrazów patologicznych HALO | Indica Labs, Inc., Albuquerque | Wersja 3.6.4134 | Barwienie HE i analiza immunofluorescencji multiplex |
| Zestaw do barwienia hematoksylin-eozyny | Wuhan elabscience Technology Co., Ltd. | E-IR-R117 | Barwienie HE |
| Zestaw DNA HiPure FFPE | Guangzhou Magen Biotechnology Co., Ltd. | D6323 | Ekstrakcja DNA z przekrojów tkanek FFPE |
| HLA-DR | HUABIO Co., Ltd. | ET1610-66 | RRID: AB_3069950; Barwienie immunofluorescencyjne multipleksowe |
| Sekwencer DNA Illumina | Illumina, Inc | 550DX | Sekwencjonowanie |
| Balsam neutralny | Pekin Solarbio Science & Technology Co., Ltd. | G8590 | Barwienie HE |
| Panck | Beijing Zhongshan Golden Bridge Biotechnology Co. Ltd | ZM0069 | RRID: AB_2941997; Barwienie immunofluorescencyjne multipleksowe |
| PD-L1 | Systemy badawczo-rozwojowe | Katalog # AF1019 | RRID:AB_354540; Barwienie immunofluorescencyjne multipleksowe |
| Bufor TBST | abclonla Technology Co., Ltd. | RM00013 | Barwienie HE i barwienie immunofluorescencyjne multiplex |
| UN-Blocker | Homgen Co., Ltd. | Przygotowanie biblioteki NGS | |
| VAHTS DNA Clean Beads | Vazyme Co., Ltd. | N411 | Przygotowanie biblioteki NGS |
| VAHTS uniersal DNA library Prep kit for illumina | Vazyme Co., Ltd. | ND610 | Przygotowanie biblioteki NGS |
| System obrazowania całego slajdu | ZEISS Co., Ltd. | ZEISS AXIOSCAN 7 version3.3 | Barwienie HE i analiza immunofluorescencji multiplex |
| xGen Hybrydyzacja i zestaw do mycia | IDT Co., Ltd. | 1080577 | Przygotowanie biblioteki NGS |
Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE
Poproś o pozwolenie