Przedstawiamy tutaj protokół półilościowej oceny globalnych poziomów M⁶A za pomocą punktowego blotu. Całkowite RNA jest ekstrahowane, denaturowane, naznaczane na nylonowej membranie, badane przeciwciałem przeciw m⁶A i wizualizowane za pomocą chemiluminescencji. Intensywność sygnału, zmierzona za pomocą analizy szarości ImageJ, odzwierciedla względną obfitość metylacji, zapewniając powtarzalny przepływ pracy w badaniach.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Test punktowy do wykrywania globalnych poziomów modyfikacji N 6-metyladenozyny RNA
* These authors contributed equally
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
N 6-metyladenozyna (m⁶A) jest najliczniejszą wewnętrzną modyfikacją w eukariotycznym RNA przekaźnikowym (mRNA) i pełni rolę kluczowego regulatora ekspresji genów po transkrypcji. Metody badania m⁶A mogą być stosowane na wielu poziomach rozdzielczości, w tym globalnej ilościowości, wykrywaniu specyficznym dla nukleotydów oraz analizie wybranych interesujących nas transkrypcji. Wśród nich test punktowy stanowi proste, szybkie i opłacalne podejście do półilościowej oceny globalnych poziomów modyfikacji m⁶A. W tym teście komórki najpierw są przetwarzane w celu wyodrębnienia całkowitego RNA, które następnie jest rozcieńczane i denaturowane. Próbki RNA są naznaczane na nylonowej membranie, badane przeciwciałem przeciw m⁶A i wizualizowane za pomocą chemiluminescencji, przy czym natężenie sygnału wskazuje na względną obfitość metylacji. Na koniec kwantyfikacja i porównanie natężeń sygnału przeprowadza się poprzez pomiar wartości w skali szarości za pomocą ImageJ. W porównaniu z metodami sekwencjonowania lub opartymi na spektrometrii mas, punkt blot wymaga minimalnej wiedzy instrumentacyjnej i technicznej, co czyni go szczególnie odpowiednim do rutynowych badań przesiewowych, wstępnych badań funkcjonalnych oraz analiz porównawczych. Protokół ten zapewnia szczegółowy i powtarzalny sposób wdrażania testu m⁶A z kropką zarówno w badaniach podstawowych, jak i translacyjnych.
Wprowadzenie
N 6-metyladenozyna (m⁶A) jest najczęstszą wewnętrzną modyfikacją w eukariotycznym RNA przekaźnikowym (mRNA) i odgrywa istotną rolę w regulacji po transkrypcji, w tym w stabilności, splicingu, degradacji, translacji i eksportu 1,2,3. Dysregulacja modyfikacji m⁶A została powiązana z różnymi procesami fizjologicznymi i patologicznymi, w tym inicjowaniem, progresją i przerzutami guza 4,5. W przypadku osteosarcoma zaobserwowano podwyższone poziomy M⁶A zarówno w liniach komórkowych, jak i tkankach, co sugeruje rolę nieprawidłowej metylacji RNA w biologii choroby 6,7. Dlatego systematyczna ocena globalnej obfitości m⁶A, wraz ze zmianami w transkrypcjach i szlakach regulacyjnych związanych z osteosarcomą, jest niezbędna dla wyjaśnienia mechanizmów biologicznych i klinicznych implikacji metylacji RNA w osteosarcomie.
Dostępnych jest kilka metod analitycznych do badania modyfikacji m⁶A 8,9. Do pomiaru globalnych poziomów M⁶A stosuje się chromatografię cieczową ze spektrometrią mas/spektrometrią mas (LC-MS/MS)10 oraz testy immunosorbentne powiązane z enzymami (ELISA)11. Pierwszy oferuje wysoką czułość, ale wymaga specjalistycznego sprzętu i wiedzy, podczas gdy drugi daje względne m6poziomów A i wiąże się z wyższymi kosztami niż test punktowy (dot blot). MeRIP-qPCR umożliwia ukierunkowaną ocenę konkretnych transkrypcji, ale jest silnie zależny od efektywności immunoprecipitacji12. MeRIP-seq13, m⁶A-seq 14 oraz m⁶A-SAC-seq15 to podejścia oparte na sekwencjonowanju, które mogą precyzyjnie mapować miejsca metylacji m⁶A; jednak są drogie i wymagają rozległej analizy bioinformatycznej.
Badanie m⁶A dot blot oferuje prostą, szybką i opłacalną metodę określania globalnych poziomów modyfikacji m⁶A w RNA. Jako półilościowy immunoagram, jego główną zaletą jest uzyskanie ogólnego obrazu obfitości m⁶A bez potrzeby specjalistycznego sprzętu czy złożonej analizy bioinformatycznej. Dzięki temu test m⁶A dot blot jest cennym narzędziem do rutynowych badań przesiewowych, wstępnej walidacji funkcjonalnej oraz badań klinicznych, a także praktycznym uzupełnieniem zaawansowanych metod sekwencjonowania i opartych na spektrometrii mas. Obecny protokół oferuje szczegółowy, krok po kroku przepływ pracy, zapewniający powtarzalne wykrywanie i szeroką zastosowalność.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
UWAGA: Protokół jest podzielony na trzy sekcje: przygotowanie RNA, test kropkowego oraz ilościowość. Tabela materiałów podsumowuje wymagane materiały, Tabela uzupełniająca 1 szczegółowo opisuje formuły odczynników, a Rysunek 1 ilustruje proces eksperymentalny.
1. Przygotowanie RNA
- Przygotowanie komórek
- Usuń 143B komórki z stabilnym SNHG21-knockdownem (shSNHG21), komórki kontrolne negatywnie (shCtrl) oraz komórki poddane 3-deazadenozynie (3-DAA; [100 μM, 24 h]) oraz kwas meclofenaminowy (MA; [100 μM, 24 h]) z inkubatora 37 °C.
- Sprawdź, czy konfluencja komórek wynosi około 80-90% i czy komórki są w dobrym stanie pod mikroskopem.
- Usuń podłoże hodowlane, a następnie dwukrotnie przepłucz komórki 1 mL PBS.
- Usuń PBS, a następnie dodaj 1 ml trypsyny na naczynie o pojemności 6 cm.
- Delikatnie wstrząśnij, aby równomiernie rozprowadzić trypsynę i inkubuj przez 1 minutę.
- Usuń trypsynę, a następnie dodaj 1 ml podłoża zawierającego 10% FBS, aby zakończyć trawienie.
- Pipetuj zawiesinę komórkową kilkakrotnie, aby rozproszyć komórki.
- Przenieś zawiesinę ogniwa do mikrowirówki wolnej od RNazy 1,5 mL.
UWAGA: Oznacz tubkę przed użyciem. Kroki 1.1.3 do 1.1.8 muszą być wykonywane w warunkach sterylnych. - Wiruj w 1000 × g przez 3 minuty, a następnie całkowicie usuń supernatant.
- Ekstrakcja RNA
UWAGA: Ekstrakcja RNA przeprowadza się za pomocą zestawu do oczyszczania RNA EZ-press.- Dokładnie dodaj 600 μL buforu lizyzowego (obecnego w zestawie do oczyszczania RNA) do pelletu i wiru, aby całkowicie zlizować komórki, i pozostawij go na 5 minut.
UWAGA: Do izolacji RNA używa się około 2 × 106 komórek . - Dodaj równą ilość 100% etanolu i dokładnie przeprowadź wiry.
- Dodaj 600 μL mieszaniny do kolumny spinowej złożonej z probówki zbiorczej.
UWAGA: Przed użyciem zmontuj kolumnę wirowaną i probówkę zbiorczą, a przed użyciem oznacz tubę. - Wiruj w 12 000 × g przez 1 minutę i wyrzuć płyn do probówki.
UWAGA: Unikaj kontaktu między dnem kolumny a cieczą lub operatorem. - Powtórz powyższe kroki 1.2.3-1.2.4 dla pozostałej mieszanki.
- Dodaj 500 μL buforu płukania (obecnego w zestawie do oczyszczania RNA) do każdej kolumny spinowej, pozwól jej stać w temperaturze pokojowej przez 1 minutę.
- Wiruj w 12 000 × g przez 1 minutę i wyrzucaj płyn do probówki.
- Ponownie wiruj pustą kolumnę na 12 000 × g przez 1 minutę, aby usunąć pozostałości płynu.
- Przełóż kolumnę spinową do nowej probówki wolnej od RNazy 1,5 mL, otwórz pokrywkę i susz na powietrzu przez 2 minuty.
UWAGA: Oznacz tubkę przed użyciem. - Do środka kolumny spinowej należy dodać 25-50 μL buforu elucijnego (wody wolnej od enzymów).
- Inkubuj w temperaturze pokojowej przez 2 minuty.
- Wirówka w 12 000 × g przez 1 minutę, aby wyeludować RNA.
- Usuń kolumnę spinową i umieść RNA w lodzie.
UWAGA: Przechowuj RNA w temperaturze -80 °C do czasu użycia.
- Dokładnie dodaj 600 μL buforu lizyzowego (obecnego w zestawie do oczyszczania RNA) do pelletu i wiru, aby całkowicie zlizować komórki, i pozostawij go na 5 minut.
- Rozcieńczenie RNA
- Pomiar stężenia RNA w komórkach 143B shSNHG21, 143B komórkach shCtrl oraz komórkach poddanych 3-DAA i MA za pomocą spektrofotometru DS-11.
- Przygotuj 1 μg całkowitego RNA z każdej linii komórkowej.
- Seryjnie rozcieńczaj RNA do 400 ng, 200 ng i 100 ng wodą poddawaną dietylopirowęglanowi (DEPC).
UWAGA: Dostosowuj gradient koncentracji w razie potrzeby.
- Denaturacja RNA
- Próbki RNA rozcieńczone ciepło w temperaturze 95 °C przez 3 minuty.
- Natychmiast przelej próbki do lodu, aby ostygły.
UWAGA: Denaturowane RNA można przechowywać w temperaturze 4 °C do 1 tygodnia.
2. Dot blot
- Wykrywanie RNA
- Przetnij dodatnio naładowaną membranę nylonową do pożądanego rozmiaru.
- Narysuj linie odniesienia i oznacz membranę nazwą próbki.
- Dokładnie wymieszaj RNA poprzez delikatne wirowanie lub pipetowanie.
- Umieść 1-2 μL każdej próbki RNA na wyznaczonych miejscach na błonie.
UWAGA: Zawsze używaj końcówek pipet bez RNazy. Unikaj bezpośredniego kontaktu między końcówką pipety a membraną. Pozwól RNA naturalnie dyfundować na błonie. Używaj nowej końcówki pipety do każdej próbki. Nie przekraczaj 2 μL na plamę, aby zapobiec nieregularnej dyfuzji.
- Sieciowanie RNA
- Susz membranę na powietrzu przez 3 minuty.
- Wykonaj sieci RNA poprzez napromieniowanie błony w radioaktywze UV na częstotliwości 254 nm, 120 mJ/cm².
UWAGA: Inkubuj błonę w 37 °C przez 30 minut jako alternatywę. - Przemyj membranę 10 mL 1x TBST na platformie bujającej przez 5 minut, aby usunąć niezwiązane RNA.
- Blokowanie błon
- Przygotuj roztwór 5% BSA.
UWAGA: Przygotuj ten roztwór świeżo przed użyciem. - Inkubuj membranę w roztworze blokującym w temperaturze pokojowej przez 2 godziny.
- Przygotuj roztwór 5% BSA.
- Inkubacja przeciwciał
- Inkubuj błonę przeciwciałem przeciw m⁶A przez noc w temperaturze 4 °C.
UWAGA: Rozcieńcz przeciwciała w skali 1:1000 w roztworze 5% BSA przed użyciem. Inkubuj membranę na bujanej platformie delikatnie potrząsając (50 obr./min). - Umyć membranę trzy razy 10 mL 1x TBST na platformie bujającej przez 10 minut.
- Inkubuj błonę przeciwciałem wtórnym sprzężonym z nadoksydazą chrzanu (HRP) przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
UWAGA: Rozcieńcz przeciwciała w skali 1:1000 w roztworze 5% BSA przed użyciem. - Umyć membranę trzy razy 10 mL 1x TBST na platformie bujającej przez 10 minut.
- Inkubuj błonę przeciwciałem przeciw m⁶A przez noc w temperaturze 4 °C.
- Detekcja chemiluminescencji
- Równomiernie nakładaj chemiluminescencyjny podłoże HRP kropelo na błonę.
UWAGA: Inkubuj membranę z podłożem przez 1 minutę w temperaturze pokojowej, delikatnie kołysząc się. - Wykrywaj sygnał za pomocą systemu obrazowania chemiluminescencyjnego.
- Użyj funkcji automatycznej ekspozycji w systemie obrazowania chemiluminescencyjnego jako wstępnego pre-skanu.
UWAGA: Akceptuj automatyczne tempo tylko wtedy, gdy najjaśniejszy sygnał jest nasycony mniej niż 65%; W przeciwnym razie zmniejsz ekspozycję o połowę i ponownie ją nabierz, aż sygnał szczytowy spadnie w granicach 30-60%.
- Równomiernie nakładaj chemiluminescencyjny podłoże HRP kropelo na błonę.
- Barwienie błękitu metylenowego (MB)
- Inkubuj błonę w roztworze barwienia MB przez 1 minutę.
- Przemyj membranę trzy razy 10 mL 1x TBST na bujanej platformie przez 5 minut i zrób obraz jako kontrolę ładowania.
UWAGA: Barw tę samą membranę, co chemiluminescencja. Unikaj naruszania osadów w roztworze barwiącym. Noś odzież ochronną i maseczkę, ponieważ MB jest trudna do zdjęcia. - Usuń membranę z wyciskaniem po zdjęciu za pomocą roztworu zawierającego 1% SDS na platformie kołyszącej przez 15 minut, aby ułatwić dokumentację lub ewentualne ponowne badanie.
3. Ilościowość
- Pomiar wartości w skali szarości
- Zaimportuj obraz do oprogramowania ImageJ.
- Przekonwertuj obraz na format 8-bitowy, używając Image > Type > 8-bit.
- Odejmij tło za pomocą procesu > odejmij tło.
UWAGA: Promień: 50,0 pikseli, sprawdź tło światła. - Użyj narzędzia Prostokąt , aby wybrać obszar analizy.
- Zdefiniuj pasy kolejno za pomocą Analizuj > Gels > Wybierz pierwszy pas.
- Generuj profile intensywności za pomocą Analyze > Gels > Plot Lanes i mierz szczyty.
- Zmierz wartości w skali szarości odpowiednio m⁶A i MB.
- Skopiuj dane do tabeli do analizy.
- Porównaj natężenia sygnału, aby ocenić globalne poziomy modyfikacji m⁶A.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Aby rygorystycznie zweryfikować skuteczność testu punktowego i zbadać rolę SNHG21 w regulacji globalnego poziomu m6A , komórki 143B zostały poddane farmakologicznym zaburzeniom, które albo hamują, albo wzmacniają metylacjęm6A , oraz monitorowano obfitośćm6A w obu kierunkach.
Kwantyfikacja kropkowej obfitości globalnej m6 A
Najpierw oceniliśmy zdolność tego testu do wykrywania obniżek poziomum6A poprzez hamowanie metylacjim6A
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
W tym badaniu obniżenie poziomu SNHG21 w komórkach osteosarcoma 143B spowodowało obniżenie intensywności sygnału m⁶A, co pokazuje wartość tego testu do oceny, czy modyfikacje genetyczne wpływają na metylację RNA. Dodatkowo ten test służy jako narzędzie do wielu zastosowań, w tym: 1) Badań funkcjonalnych i walidacji mechanistycznej: Test ten może być wykorzystywany do szybkich, wstępnych badań przesiewowych, aby ustalić, czy globalne poziomy M⁶A są powiązane z konkretnymi procesami biologicznymi, takimi jak różnicowanie k...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie zgłaszają konfliktów interesów.
Podziękowania
Prace te były wspierane grantami od National Nature Science Foundation (82174408, 82374477 i 82474535). Rysunek 1 został stworzony z BioRender.com.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| 3-dezaadenozyna (3-DAA) | MCE | HY-W013332A | 1 mg |
| Przeciwciało monoklonalne przeciw m6A | Proteintech | 68055-1-Ig | 50 μ L |
| Albumina surowicy bydła (BSA, frakcja V) | BioFroxx | 4240GR100 | 100 g |
| System obrazowania ChemiDoc MP | BIO RAD | 12003154 | |
| Wysoka glukoza w DMEM | WISENT | 319-005-CL | 500 mL |
| Spektrofotometr DS-11 | DeNOVIX | DS-11 | |
| Zestaw do oczyszczania RNA EZ-press | EZB | B0004DP | 100 przygotowań |
| FBS – Jakość doskonałej | WISENT | 086-150 | 500 mL |
| Kozi anty-myszy IgG (H+L) sprzężony z HRP | Beyotime | A0216 | 1 mL |
| Immobilon Western chemiluminescencyjny podłoże HRP | Millipore | WBKLS0500 | 2 & razy; 250 mL |
| Kwas meklofenamiczny (MA) | MCE | HY-117275 | 1 mg |
| Roztwór barwienia błękitu metylenowego | Solarbio | G1300 | 0,1%, 100 mL |
| Membrana transferowa nylonowa | LABSELECT | TM-NY-XS-45 | 7,4 & razy; 8,5 cm, 0,45 μ m, 10 PCS/WOREK |
| Bufor PBS (gotowy do użycia suchy proszek) | biosharp | BL601A | pH: 7,2-7,4, 2 L/worek |
| Siarczan dodecylosiarczan sodu (SDS) | Sigma | L5750-500G | 500 g |
| Proszek do mieszanki buforowej TBS | Sangon | A510025-0001 | 1EA (243,9 g proszku) |
| Enzym ekspresowy trypLE | Gibco | 12604-021 | 1&razy, 500 mL |
| Tween-20 | Sangon | A600560-0500 | 500 mL |
| Krzyżowiec UV | UVP | CL-1000 |
Bibliografia
- Wang, X., et al. N6-methyladenosine-dependent regulation of messenger RNA stability. Nature. 505 (7481), 117-120 (2014).
- Zhang, Z., Wei, W., Wang, H., Dong, J. N6-methyladenosine-sculpted regulatory landscape of noncoding RNA. Front Oncol. 11 (1), 743990(2021).
- Hsu, P. J., et al. The RNA-binding protein FMRP facilitates the nuclear export of N6-methyladenosine-containing mRNAs. J Biol Chem. 294 (52), 19889-19895 (2019).
- Chen, X. -Y., Zhang, J., Zhu, J. -S. The role of m6A RNA methylation in human cancer. Mol Cancer. 18 (1), 103(2019).
- Li, Y., et al. Molecular characterization and clinical relevance of m6A regulators across 33 cancer types. Mol Cancer. 18 (1), 137(2019).
- Hu, Y., Zhao, X. Role of m6A in osteoporosis, arthritis and osteosarcoma (review). Exp Ther Med. 22 (3), 926(2021).
- Zhang, Y., et al. N6-methyladenosine (m6A) modification in osteosarcoma: expression, function and interaction with noncoding RNAs-an updated review. Epigenetics. 18 (1), 2260213(2023).
- Zhu, W., et al. Detection of N6methyladenosine modification residues (review). Int J Mol Med. 43 (6), 2267-2278 (2019).
- Wang, Y., Jia, G. Detection methods of epitranscriptomic mark N6-methyladenosine. Essays Biochem. 64 (6), 967-979 (2020).
- Stejskal, S., et al. Global analysis by LC-MS/MS of N6-methyladenosine and inosine in mRNA reveal complex incidence. RNA. 31 (4), 514-528 (2025).
- Ensinck, I., et al. m6A-ELISA, a simple method for quantifying N6-methyladenosine from mRNA populations. RNA. 29 (5), 705-712 (2023).
- Liu, J., et al. m6A mRNA methylation regulates AKT activity to promote the proliferation and tumorigenicity of endometrial cancer. Nat Cell Biol. 20 (9), 1074-1083 (2018).
- Zhang, M., Li, Q., Xie, Y. A Bayesian hierarchical model for analyzing methylated RNA immunoprecipitation sequencing data. Quant Biol (Beijing). 6 (3), 275-286 (2018).
- Dominissini, D., et al. Topology of the human and mouse m6A RNA methylomes revealed by m6A-seq. Nature. 485 (7397), 201-206 (2012).
- Mishra, T., Phillips, S., Zhao, Y., Wilms, B., He, C., Wu, L. Epitranscriptomic m6A modifications during reactivation of HIV-1 latency in CD4+ T cells. mBio. 15 (11), e0221424(2024).
- Li, J., et al. METTL16 promotes lipid metabolic reprogramming and colorectal cancer progression. Int J Biol Sci. 21 (11), 4782-4797 (2025).
- Ren, F., Cai, Y., Song, Y. OTUD7B stabilization by METTL14-mediated m6A methylation drives HIF-1α expression in esophageal squamous cell carcinoma. Oncol Res. 33 (8), 2055-2074 (2025).
- Chen, Y., et al. WTAP facilitates progression of hepatocellular carcinoma via m6A-HuR-dependent epigenetic silencing of ETS1. Mol Cancer. 18 (1), 127(2019).
- Gu, Y., et al. Upregulation of circGDI2 inhibits tumorigenesis by stabilizing the expression of RNA m6A demethylase FTO in oral squamous cell carcinoma. Noncoding RNA Res. 10 (1), 140-152 (2025).
- Ura, Y., et al. Quantitative dot blot analyses of blood-group-related antigens in paired normal and malignant human breast tissues. Int J Cancer. 50 (1), 57-63 (1992).
- Reed, K. C., Mann, D. A. Rapid transfer of DNA from agarose gels to nylon membranes. Nucleic Acids Res. 13 (20), 7207-7221 (1985).
- Herrin, D. L., Schmidt, G. W. Rapid, reversible staining of northern blots prior to hybridization. Biotechniques. 6 (3), 196-200 (1988).
- Rio, D. C., Ares, M., Hannon, G. J., Nilsen, T. W. RNA: A Laboratory Manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor. NY. (2010).
- Sambrook, J., Russell, D. W. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. , 3rd ed, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY. (2001).
- Helm, M., Motorin, Y. Detecting RNA modifications in the epitranscriptome: Predict and validate. Nat Rev Genet. 18 (5), 275-291 (2017).
- Meyer, K. D., Jaffrey, S. R. The dynamic epitranscriptome: N6-methyladenosine and gene expression control. Nat Rev Mol Cell Biol. 15 (5), 313-326 (2014).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
