Test MeRIP-qPCR do wykrywaniapoziomówmodyfikacji specyficznego RNA w komórkach osteosarcoma

Binghan Yan; Junli Chang; Suxia Guo; Peng Zhao; Fulai Zhao; Chujie Zhou; Junjie Tong; Xinyu Zhang; Yuping Hong; Mengchen Yin; Xingyuan Sun; Yanping Yang

doi:10.3791/69880

Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Test MeRIP-qPCR do wykrywania^poziomówmodyfikacji specyficznego RNA w komórkach osteosarcoma

861 wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/69880

⸱

30 grudnia 2025

Binghan Yan^*¹^,² , Junli Chang^*¹^,² , Suxia Guo¹^,² , Peng Zhao¹^,² , Fulai Zhao¹^,² , Chujie Zhou¹^,² , Junjie Tong¹^,² , Xinyu Zhang¹^,² , Yuping Hong¹^,² , Mengchen Yin¹^,² , Xingyuan Sun¹^,² , Yanping Yang¹^,²

¹Longhua Hospital, Shanghai University of Traditional Chinese Medicine, ²Key Laboratory of Theory and Therapy of Muscles and Bones, Ministry of Education

^* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Protokół ten oferuje szczegółowe podejście do oceny poziomów modyfikacji m^6Aspecyficznego RNA za pomocą MeRIP-qPCR.

Streszczenie

Modyfikacja epitranskryptomiczna RNA odgrywa kluczową rolę w inicjacji i rozwoju różnych nowotworów, wśród których N 6-metyladenozyna (m⁶A) jest najbardziej powszechną i funkcjonalnie zróżnicowaną modyfikacją. Przedstawiamy tutaj uprościony i powtarzalny protokół wykorzystujący MeRIP-qPCR do oceny poziomów modyfikacji m^6Aspecyficznych transkryptów w komórkach osteosarcoma. W tym badaniu wyodrębniono całkowite RNA, po czym nastąpiła inkubacja z konkretnym przeciwciałem przeciw m⁶A do modyfikacji immunocapture RNA^m6A. Następnie RNA zostało rozfragmentowane, a wzbogacenie fragmentów m⁶A-zmodyfikowanych RNA osiągnięto za pomocą magnetycznych kulek białka G. Wzbogacone RNA było uwalniane przez trawienie proteinazy K i oczyszczane przez kulki wiążące RNA. Na koniec RNA poddano odwrotnej transkrypcji oraz ilościowej reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR) w celu oceny poziomu m^6Aw genach kandydatów. Wyniki wykazały, że ta metoda skutecznie rozróżnia różnice metylacji i stanowi wiarygodne narzędzie do badania funkcjonalnych mechanizmów modyfikacji^m6Aw komórkach osteosarcoma. Podsumowując, MeRIP-qPCR oferuje proste i bardzo szczegółowe podejście do badania modyfikacji m^6Aw komórkach kostniaraka. Protokół ten ma duży potencjał w wyjaśnianiu sieci regulacyjnych m^6Aoraz identyfikacji nowych celów terapeutycznych.

Wprowadzenie

Najnowsze badania epitrankryptomu pokazują, że modyfikacja RNA N 6-metyladenozyny (m⁶A), czyli metylacja pozycji N⁶na adenozynie, jest najliczniejszą znaną wrodzoną modyfikacją chemiczną mRNA w komórkach eukariotycznych¹. m⁶A uczestniczy w szerokim zakresie procesów biologicznych, w tym w stabilności mRNA, splicingu, eksportu jądrowego oraz efektywności translacji². Co ważne, coraz więcej dowodów sugeruje, że zaburzenia regulacji modyfikacji^m6Aprzyczyniają się do inicjacji i rozwoju różnych nowotworów, w tym osteosarcoma, wysoce agresywnego złośliwego guza kości, kt....