Test MeRIP-qPCR do wykrywaniapoziomówmodyfikacji specyficznego RNA w komórkach osteosarcoma

Podsumowanie

Protokół ten oferuje szczegółowe podejście do oceny poziomów modyfikacji m^6Aspecyficznego RNA za pomocą MeRIP-qPCR.

Streszczenie

Modyfikacja epitranskryptomiczna RNA odgrywa kluczową rolę w inicjacji i rozwoju różnych nowotworów, wśród których N 6-metyladenozyna (m⁶A) jest najbardziej powszechną i funkcjonalnie zróżnicowaną modyfikacją. Przedstawiamy tutaj uprościony i powtarzalny protokół wykorzystujący MeRIP-qPCR do oceny poziomów modyfikacji m^6Aspecyficznych transkryptów w komórkach osteosarcoma. W tym badaniu wyodrębniono całkowite RNA, po czym nastąpiła inkubacja z konkretnym przeciwciałem przeciw m⁶A do modyfikacji immunocapture RNA^m6A. Następnie RNA zostało rozfragmentowane, a wzbogacenie fragmentów m⁶A-zmodyfikowanych RNA osiągnięto za pomocą magnetycznych kulek białka G. Wzbogacone RNA było uwalniane przez trawienie proteinazy K i oczyszczane przez kulki wiążące RNA. Na koniec RNA poddano odwrotnej transkrypcji oraz ilościowej reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR) w celu oceny poziomu m^6Aw genach kandydatów. Wyniki wykazały, że ta metoda skutecznie rozróżnia różnice metylacji i stanowi wiarygodne narzędzie do badania funkcjonalnych mechanizmów modyfikacji^m6Aw komórkach osteosarcoma. Podsumowując, MeRIP-qPCR oferuje proste i bardzo szczegółowe podejście do badania modyfikacji m^6Aw komórkach kostniaraka. Protokół ten ma duży potencjał w wyjaśnianiu sieci regulacyjnych m^6Aoraz identyfikacji nowych celów terapeutycznych.

Wprowadzenie

Najnowsze badania epitrankryptomu pokazują, że modyfikacja RNA N 6-metyladenozyny (m⁶A), czyli metylacja pozycji N⁶ na adenozynie, jest najliczniejszą znaną wrodzoną modyfikacją chemiczną mRNA w komórkach eukariotycznych¹. m⁶A uczestniczy w szerokim zakresie procesów biologicznych, w tym w stabilności mRNA, splicingu, eksportu jądrowego oraz efektywności translacji². Co ważne, coraz więcej dowodów sugeruje, że zaburzenia regulacji modyfikacji^m6Aprzyczyniają się do inicjacji i rozwoju różnych nowotworów, w tym osteosarcoma, wysoce agresywnego złośliwego guza kości, który dotyka głównie nastolatków i młodych dorosłych³.

Badanie modyfikacji m^6Awymaga solidnych i wiarygodnych metodologii. Opracowano kilka metod wykrywania poziomów modyfikacji m⁶A, w tym m⁶A punktowego blota, m⁶A ELISA oraz MeRIP-seq. Test kropkowy^m6A jest prosty i opłacalny, jednak cierpi na ograniczoną czułość i słabą ilościowość. Zapewnia poziom modyfikacji^m6Acałkowitego RNA, zamiast poziomu modyfikacji^m6Adla konkretnego RNA⁴. m⁶A ELISA oferuje stosunkowo wygodne i wysokoprzepustowe wykrywanie; jednak reaktywność krzyżowa i niska dokładność pozostają poważnymi problemami, a także nie ma możliwości ujawniania modyfikacji specyficznych dla transkrypcji lub lokalizacji⁵. MeRIP-seq umożliwia mapowanie^m6Ana cały transkryptom; jednak jego wymagania dotyczące dużych ilości RNA, stosunkowo niskiej rozdzielczości i zależności od przeciwciał ograniczają precyzję i powtarzalność MeRIP-seq⁶. Dla porównania, MeRIP-qPCR łączy immunoprecipitację z ilościowym PCR, zapewniając wyższą czułość i swoistość do celowanego wykrywania^m6Ana specyficznym RNA⁷. Metoda ta umożliwia czułe i celowane wykrywanie różnicowego wzbogacenia m6A w genach kandydatów, co czyni ją szczególnie odpowiednią do badań walidacyjnych w badaniach raka związanych z m6A. Ta metoda stanowi opłacalną i dostępną alternatywę dla laboratoriów mających na celu badanie mechanizmów regulacyjnych pośredniczonych przez m6A.

Przedstawiliśmy szczegółowy protokół (Rysunek 1) do oceny poziomów modyfikacji c-Myc^m6A w komórkach kostnoowocaka, używając MeRIP-qPCR jako przykładu. MeRIP-qPCR, opierający się na wzbogaceniu metylowanych fragmentów RNA opartym na przeciwciałach, a także w połączeniu z transkrypcją odwrotną i ilościowym PCR, ocenia obecność i względną obfitość^m6Aw specyficznym RNA. Wykazaliśmy, że to podejście skutecznie rozróżnia różnice metylacji c-Myc i stanowi wiarygodną podstawę do badania funkcjonalnej roli m^6Aw komórkach osteosarcoma. Niniejsze badanie podkreśla potencjał MeRIP-qPCR jako praktycznego i specyficznego narzędzia do badań nad modyfikacją m^6Aw osteosarcomie oraz tworzy podstawy do identyfikacji nowych celów terapeutycznych.

Protokół

1. Przygotowanie RNA

UWAGA: Ekstrakcja RNA przeprowadza się za pomocą zestawu do ekstrakcji RNA. Pracuj w czystej szafie biobezpieczeństwa podczas pracy z komórkami i odczynnikami RNA. Noszenie odpowiedniego sprzętu ochronnego (fartuch laboratoryjny, rękawiczki, okulary ochronne). Przed uruchomieniem schłodź wirówkę do 4 °C.

1. Przygotujcie komórki.
   1. Wyjmij podłoże hodowlowane z naczynia o wysokości 3,5 cm i delikatnie umyj komórki za pomocą schłodzonego PBS. Dodaj odpowiednią objętość buforu lizy RNA bezpośrednio do naczynia, aby całkowicie zlizować komórki i delikatnie pipetować, aby ujednolicić.
   2. Przenieś zawiesinę ogniwową do rurki mikrowirówki o pojemności 1,5 mL.
   3. Wirówka w 1000 × g przez 5 minut w 4 °C.
      UWAGA: Upewnij się, że wirnik jest wyważony, a pokrywa dobrze zamknięta.
   4. Po wirowaniu ostrożnie wyjmij rurkę mikrowirówki.
   5. Całkowicie zasysaj supernatant pipetą o pojemności 1 mL, nie naruszając granulatu na dnie.
      UWAGA: Nie dotykaj osadu ogniwa końcówką pipety.
2. Komórki lizu.
   1. Dodaj 300 μL buforu lizy do pelletu komórkowego.
   2. Dokładnie wymieszaj, odwracając probówkę 30 razy, aż roztwór będzie przezroczysty i lepki, bez widocznych grudek.
   3. Inkubuj probówkę w temperaturze pokojowej przez 2 minuty.
3. Wytrącają RNA.
   1. Dodaj 300 μL 100% etanolu do lizatu (równa objętość buforu lizy).
   2. Delikatnie pipetuj w górę i w dół od razu (około 8-10 razy), żeby w pełni się wymieszać.
4. Wykonaj wiązanie kolumn RNA.
   1. Włóż kolumnę oczyszczającą RNA do dostarczonej probówki zbiorczej 2 mL.
   2. Przelej całą mieszankę do kolumny oczyszczającej.
      UWAGA: Unikaj dotykania białej błony w centrum.
   3. Zamknij nakrętkę i zatwórz w wirówce przy 12 000 × g przez 1 minutę.
   4. Wyrzuć dolną ciecz i delikatnie stuknąć probówkę do góry nogami o chłonny papier, aby usunąć resztki płynu.
   5. Zwróć kolumnę oczyszczającą do probówki.
5. Płucz zanieczyszczenia.
   1. Do kolumny oczyszczającej dodaj 500 μL buforu płukania (wody wolnej od nukleazy).
      UWAGA: Unikaj dotykania białej błony w centrum.
   2. Wiruj w 12 000 × g przez 1 minutę i wyrzucaj ciecz o niższej wartości.
   3. Ponownie wiruj w 12 000 × g przez 1 minutę, aby usunąć pozostałości płynu.
   4. Przełóż kolumnę oczyszczającą do czystej rurki mikrowirówki o pojemności 1,5 mL.
   5. Otwórz pokrywę i pozwól kolumnie stać przez 2 minuty w temperaturze pokojowej.
6. RNA elute.
   1. Włóż kolumnę oczyszczającą do nowej rurki mikrowirówki o pojemności 1,5 mL.
   2. Dodaj 25 μL Buforu Elution bezpośrednio na środek błony.
   3. Inkubuj w temperaturze pokojowej przez 5 minut.
   4. Wiruj w 12 000 × g przez 1 minutę, aby zebrać RNA w dolnej tubce.
   5. Ponownie nałóż eluat na membranę i ponownie wiruj przy 12 000 × g przez 1 minutę, aby zmaksymalizować wydajność.
      UWAGA: Zawsze dodaj bufor elution bezpośrednio na środek membrany kolumny. Unikaj dodawania go do ściany bocznej, ponieważ może to uniemożliwić rozpuszczenie RNA i znacznie zmniejszyć wydajność RNA. Nie przebijaj membrany końcówką pipety.
7. Zmierz stężenie RNA.
   1. Przepłucz port próbki spektrofotometru 1,5 μL Buforu Elution.
   2. Użyj 1,5 μL Bufora Elution jako pustego elementu. Potwierdź, że odczyt jest bliski zera.
   3. Załaduj 1,5 μL próbki RNA i zmierz stężenie.
   4. Ocena jakości próbek RNA za pomocą spektrofotometru (A260/A280 = 1,8-2,2, A260/A230 = 2,0-2,5) oraz elektroforezy żelowej agarozy.

2. Immunoprecipitacja metylowanego RNA (MeRIP)

1. Przygotowanie mieszaniny immunocapturek
   1. Zdobądź nową sondę PCR o pojemności 0,2 mL.
   2. Dodaj składniki zgodnie z Tabelą 1 (przykład dla jednej reakcji).
2. Immunocapture
   1. Mocno zamknij nakrętkę rurki. Umieść rurkę PCR na rotatorze lub rolującym shakerze.
   2. Inkubuj w temperaturze pokojowej przez 90 minut.
      UWAGA: Upewnij się, że roztwór jest mieszany cały czas i delikatnie.
3. Rozszczepienie RNA
   1. Po inkubacji do każdej probówki należy dodać 10 μL Nuclear Digestion Enhancer (NDE) oraz 2 μL Chemie Mix Cleavage Enzyme Mix (CEM).
   2. Mieszaj delikatnie, pipetując pipetami 5 do 6 razy.
   3. Inkubuj w temperaturze pokojowej przez 4 minuty.
   4. Przygotowanie kontroli RNA wejściowego
      1. Aby zapewnić spójność między immunoprecypitacją (IP) a próbkami wejściowymi, przetwarzaj część RNA równolegle jako kontrolę wejściową.
      2. Przenieś 1 μg całkowitego RNA (10% wejścia) z każdej próbki do osobnej probówki PCR. Dodaj 20 μL buforu wychwytującego immuno (ICB), 1,5 μL NDE, 1 μL CEM i inkubuj w temperaturze pokojowej przez 2 minuty.
4. Wzbogacenie magnetyczne i płukanie
   1. Umieść rurkę PCR na stojaku magnetycznym.
   2. Pozwól rurce stać przez 2 minuty, aż roztwór stanie się przezroczysty, a kulki zostaną zatrzymane na ściance rurki.
   3. Ostrożnie zasysaj i odrzucaj supernatant, nie naruszając koralików.
   4. Trzymaj tubkę na magnetycznym stojaku i dodaj 150 μL Wash Buffer (WB).
   5. Zdejmij rurkę ze stojaka magnetycznego i delikatnie przechyl ją do góry nogami, aby całkowicie zawieszyć kulki.
   6. Wróć rurkę do stojaka magnetycznego. Poczekaj 1-2 minuty, aż roztwór się wysunę, potem odrzuć supernatant.
   7. Powtórz krok mycia trzy razy.
   8. Przemyj kulki ponownie 150 μL buforu trawienia białek (PDB) tą samą metodą.
5. Uwalnianie i odzyskiwanie wzbogaconego RNA
   1. Przygotuj roztwór roboczy do trawienia białek, mieszając proteinazę K i PDB w proporcji 1:9. (Do każdej reakcji przygotuj 20 μL: 2 μL proteinazy K + 18 μL PDB).
   2. Po ostatnim umyciu zdejmij rurkę z magnetycznego stojaku.
   3. Dodaj 20 μL świeżo przygotowanego roztworu roboczego do trawienia białka do granulki i delikatnie wymieszaj.
   4. Umieść rurkę PCR w cyklerze termicznym i inkubuj w temperaturze 55 °C przez 15 minut.
   5. Umieść rurkę PCR z powrotem na stojaku magnetycznym. Poczekaj, aż roztwór się rozwinie (około 2 minuty).
   6. Ostrożnie przelej cały supernatant (około 20 μL) do nowej rurki PCR o pojemności 0,2 mL.
      UWAGA: RNA jest teraz w supernatancie. Usuń paciorki.
6. Oczyszczanie RNA
   1. Dodaj 20 μL roztworu oczyszczającego RNA (RPS) do każdej probówki, ujemnej i wejściowej probówki.
   2. Dodaj 160 μL 100% etanolu.
   3. Vortex RNA Binding Beads do ich ponownego zawieszenia.
   4. Dodaj 2 μL kulek wiążących RNA z zawieszoną zawieszoną do każdej probówki.
   5. Dokładnie wymieszaj w górę i w dół co najmniej 10 razy.
   6. Inkubuj w temperaturze pokojowej przez 5 minut, aby umożliwić wiązanie RNA.
   7. Umieść rurkę na stojaku magnetycznym. Poczekaj, aż roztwór się rozwinie (około 2 minuty).
   8. Ostrożnie wyrzucaj supernatant, nie naruszając koralików.
   9. Trzymaj rurkę na magnetycznym stojaku i dodaj 150 μL świeżo przygotowanego etanolu 90%. Inkubuj przez 30 sekund.
   10. Wyrzuć 90% etanolu. Powtórz mycie 90% etanolem jeszcze raz (w sumie dwa razy).
   11. Usuń rurkę ze stojaka magnetycznego.
   12. Dodaj 13 μL Bufora Elution do suszonych kulek.
   13. Inkubuj w temperaturze pokojowej przez 5 minut, aby wydzielić RNA.
   14. Umieść rurkę z powrotem na stojaku magnetycznym. Poczekaj, aż roztwór się rozwinie (około 2 minuty).
   15. Ostrożnie przelej cały supernatant (około 13 μL) do nowej rurki PCR wolnej od RNazy.
   16. Użyj natychmiast lub przechowuj RNA w temperaturze -20 °C.

3. RT-qPCR

1. Odwrotnie transkrybować RNA wzbogacone o m⁶A do cDNA
   1. Do transkrypcji odwrotnej używaj oczyszczonego RNA z grupy^m6A-IP, wejściowej lub IgG.
   2. Przygotuj reakcję transkrypcji odwrotnej (RT).
      UWAGA: Zapewnij równe wejście RNA we wszystkich grupach, aby umożliwić wiarygodne porównania w dalszej analizie qPCR.
2. Wzmacnianie qPCR
   1. Przygotuj reakcje qPCR przy użyciu chemii SYBR Green. Dodaj 10 μL SYBR Green Master Mix (2×), 0,5 μL zapalnika do przodu (10 μM), 0,5 μL zapalnika odwrotnego (10 μM), 7 μL_ddH2O oraz 2 μL cDNA do każdej probówki, dokładnie wymieszaj i krótko wiruj przed załadowaniem do instrumentu qPCR.
      UWAGA: Ustaw trzy studnie replikacyjne dla każdej próbki cDNA (Input, IgG, m⁶A-IP). Lista spłonników znajduje się w Tabeli 2 .
   2. Uruchom program qPCR.
      1. Wykonaj reakcje qPCR na cyklerze termicznym w czasie rzeczywistym za pomocą następującego programu: ustaw początkową denaturację na 95 °C przez 30 s; Uruchom 40 cykli, w tym denaturację w 95 °C przez 15 s, wyżarzanie w 58 °C przez 10 s oraz przedłużenie w 72 °C przez 30 s.
      2. Po amplifikacji przeprowadź analizę krzywej stopu, ustawiając denaturację na 95 °C przez 15 sekund, chłodząc na 60 °C przez 1 minutę, a następnie stopniowo podnosząc temperaturę do 95 °C z tempem narastania 0,5 °C/s z ciągłym nabijaniem fluorescencji, aby potwierdzić specyficzność produktów amplifikowanych.
3. Analiza danych
   1. Przeanalizuj wartości Ct grupy docelowej i kontrolnej.
   2. Oblicz wzbogacenie za pomocą jednej z następujących metod:
      1. Metody 1: Metoda procentowa inputu
         %Input = 2^{[Ct(Input)−Ct(IP)]} × DF × 100%
         UWAGA: Ct (Input) i Ct (IP) reprezentują wartości progowe cyklu próbek wejściowych i IP, a współczynnik rozcieńczenia (DF) to odwrotność frakcji wejściowej użytej dla qPCR (np. jeśli 10% całkowitego RNA zostało użyte jako Input, to DF = 10).
      2. Metody 2: Metoda porównawcza CT (metoda 2^^-ΔΔCt )
         ΔCt_sample=Ct_IP−Ct_IgG
         Ct=ΔCt_traktowane−_{ΔCt kontrola}, Fold=2^−ΔΔCt.
         UWAGA: Utrzymuj równomierne ilości RNA, konfigurację reakcji i efektywność podkładu we wszystkich próbkach.

Wyniki

Przedstawiamy tutaj reprezentatywny wynik analizy MeRIP-qPCR, poziom modyfikacji^m6A c-Myc w komórkach hFOB1.19 i 143B. Jak pokazano na Rysunku 2, wzbogacenie c-Myc przeciwciałem przeciw^{m6 A}było istotnie wyższe w porównaniu z kontrolą IgG, która wykazywała jedynie poziomy tła, co sugeruje, że przeciwciało przeciw^m6A jest zarówno skuteczne, jak i specyficzne. Zaobserwowaliśmy również, że poziom modyfikacji^m6Ac-Myc był istotnie wyższy w 143B niż w kom...

Dyskusja

MeRIP-qPCR stał się cennym narzędziem do badania modyfikacji RNA m⁶A o szerokich zastosowaniach. Jest szczególnie przydatna przy walidacji wyników sekwencjonowania o wysokiej przepustowości oraz precyzyjnym lokalizowaniu miejsc modyfikacji w określonych obszarach genów docelowych podczas badań mechanistycznych. Ponadto metoda ta może być łatwo wdrażana w większości laboratoriów biologii molekularnej dzięki stosunkowo niskim kosztom i prostocie operacyjnej, co czyni ją efektywnym i praktycznym podejściem do bad...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
100% etanol	Shanghai Titan Scientific Co., Ltd., Ameryka	1158566
143B	ATCC, Ameryka	ATCC CRL-8303TM
2& razy; SYBR Green qPCR Mix	Beijing Qihengxing Biotechnology Co., Ltd., Chiny	FS-Q1002
Denovix DS-11	Denovix	DS-11	Spektrofotometr
Medium DMEM	WISENT CORPORATION, Chiny	319-005-CL
DMEM/F-12 medium	Gibco, Ameryka	11320033
EpiQuik CUT& Zestaw do wzbogacania RNA (MeRIP) RUN m6A	Epigentek, Ameryka	P-9018-24
Serum bydlęce płodowe	WISENT CORPORATION, Chiny	086-150
hFOB1.19	Bank Komórkowy Chińskiej Akademii Nauk, Chiny	GNHu14
m6Zestaw do testów metylacji RNA	Abcam, Anglia	ab185912
Zestaw do transkrypcji odwrotnej mikroRNA	EZBioscience-EZB, Ameryka	A0010CGQ
System czasu rzeczywistego	BIO-RAD, Ameryka	CFX96
Zestaw do ekstrakcji RNA	EZBioscience-EZB, Ameryka	B0004DP
Enzym ekspresowy trypLE	Gibco, Ameryka	12604021