Artykuł metodologiczny

Standaryzowana metoda wykrywania tunelujących nanorurek w ludzkich komórkach skóry do zastosowań inżynierii tkankowej

790 wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/69883

⸱

13 stycznia 2026

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Savaid Stomatology School, Hangzhou Medical College, 2Engineering Laboratory for Biomaterials and Tissue Regeneration, Ningbo Stomatology Hospital, 3Ningbo Savaid Stomatology and Otolaryngology Medical Institute, Ningbo ENT Hospital, 4Department of Urology, the Affiliated People's Hospital of Ningbo University

W tym artykule

Podsumowanie

Przedstawiono tutaj ustandaryzowany protokół wizualizacji tunelujących nanorurek między ludzkimi keratynocytami naskórnymi a fibroblastami dermalnymi za pomocą znakowania błonowego i F-aktynowego za pomocą obrazowania konfokalnego stosu z, z opcjonalnym współbarwieniem α-tubuliny, umożliwiającym powtarzalne wykrywanie i charakteryzację cytoszkieletu dla zastosowań inżynierii tkankowej.

Streszczenie

Tunelujące nanorurki (TNT) to cienkie, na bazie aktyny kanały międzykomórkowe, które umożliwiają dalekosiężny transfer organelli i ładunku sygnalizacyjnego. Chociaż szeroko opisywane w wielu typach komórek, ich obecność w ludzkich komórkach skóry nie została dobrze opisana. Niniejszy artykuł opisuje ustandaryzowany protokół wykrywania i charakteryzowania TNT in vitro pomiędzy ludzkimi keratynocytami naskórnymi a włóknistymi skórami. Metoda obejmuje przygotowanie współhodowli komórek pierwotnych, delikatne utrwalanie w celu zachowania delikatnych TNT, znakowanie błonowe aglutininą zarodków pszenicy, barwienie F-aktyną falloidyną oraz systematyczne obrazowanie stosu Z za pomocą odwróconej mikroskopii konfokalnej w celu odróżnienia TNT zawieszonych nad podłożem od przylegających filopodii. Opcjonalne immunobarwienie dla α-tubuliny pozwala ocenić włączenie mikrotubul. TNT definiuje się przez trzy cechy: cienkie, proste wypustki łączące dwie lub więcej komórek, obecność F-aktyny oraz ciągłość między parami komórek w sekcjach optycznych szeregowych. Reprezentatywne wyniki wykazują TNT łączące pary skóra-skóra, naskórka-naskórka oraz skóra-naskórka, o zmiennym składzie cytoszkieletu (F-aktyna sama lub F-aktyna plus α-tubulina). Kluczowe kroki obejmują delikatne utrwalanie, użycie świeżych odczynników oraz zdobycie wystarczającej liczby z-płaszczyzn, aby uniknąć błędnej klasyfikacji, natomiast powszechne artefakty to pęknięcie TNT i niepełne barwienie. Te zoptymalizowane kroki umożliwiają powtarzalne wykrywanie TNT w systemach komórek skóry i stanowią podstawę metodologiczną do przyszłych badań nad komunikacją pośredniczoną za pomocą TNT w biologii i regeneracji skóry.

Wprowadzenie

Tunelujące nanorurki (TNT) to nanoskalowe, aktynowe kanały umożliwiające bezpośredni międzykomórkowy transfer organelli i cząsteczek sygnałowych. Zazwyczaj mają długość 6-100 μm i średnicę 50-500 nm, niektóre osiągają grubośćnawet 700 nm. W przeciwieństwie do pustych wypustek błony, TNT zawierają włókna cytoszkieletowe, najczęściej F-aktynę, która zapewnia sztywność strukturalną i wspiera transport mitochondrialny 2,3,4. W hodowli dwuwymiarowej TNT definiuje się przez trzy cechy: cienkie (20-700 nm), proste wypustki zawieszone nad podłożem łączące dwie lub więcej komórek; obecność filamentów F-aktyny; oraz możliwość przeładunku ładunku.

Od pierwszej identyfikacji w komórkach PC-12 przez Rustoma i in.5, TNT były badane w wielu układach, w tym układachukładów sercowo-naczyniowych 6, odporności7 iukładów oddechowych 8, nabłonku rogówki9, guzach10 oraz układzie nerwowym11,12. Przyczyniają się one do procesów fizjologicznych i patologicznych, takich jak sygnalizacja immunologiczna, apoptoza, transport materiałów oraz angiogeneza 13,14,15. TNT mogą pośredniczyć w długodystansowym transferze różnorodnych ładunków, w tym mitochondriów, siatkówki endoplazmatycznej, kwasów nukleinowych, jonów, a nawet wirusów 5,16,17.

Skóra jest narządem strukturalnie złożonym, a naskórek i skóra skórna polegają na stałej komunikacji dla homeostazy, gojenia ran i regeneracji kończyn 18,19,20. Chociaż TNT zostały opisane w wielu tkankach, w tym w układzie odpornościowym, nerwowym oraz nabłonku rogówki 7,9,12, ich obecność w ludzkich komórkach skóry nie została opisana w opublikowanej literaturze. Opierając się na ramach metodologicznych opisanych przez Sáenz-de-Santa-María i in.21, przedstawiamy ustandaryzowany i zoptymalizowany protokół wykrywania TNT między keratynocytami naskórka a fibroblastami skórnymi22, wykorzystując barwienie immunofluorescencyjne w połączeniu z odwróconą mikroskopią konfokalną.

W porównaniu z alternatywnymi metodami wykrywania TNT, protokół ten oferuje praktyczną równowagę między czułością a dostępnością. Obrazowanie żywymi komórkami może rejestrować dynamikę TNT, ale jest ograniczone przez fototoksyczność oraz krótkotrwałość TNT 1,23. Mikroskopia elektronowa dostarcza szczegółów ultrastrukturalnych, ale często nie zachowuje długich rozpięć TNT i nie jest praktyczna do rutynowej analizy pierwotnych komórek skóry24,25. Systemy nanorurek oparte na reporterze umożliwiają śledzenie w czasie rzeczywistym, ale wymagają manipulacji genetycznej, która zazwyczaj jest nieefektywna w przypadku pierwotnych keratynoocytów i fibroblastów24,26. Dla porównania, niniejszy protokół wykorzystuje standardową mikroskopię immunofluorescencyjną i konfokalną, umożliwiając powtarzalną detekcję TNT w niezależnie przygotowanych hodowlach komórek skóry, zachowując jednocześnie kompatybilność z delikatnymi komórkami pierwotnymi.

Metoda ta jest szczególnie odpowiednia do analizy próbek stałych, gdzie interesujący jest skład cytoszkieletu i częstość występowania TNT. Ponieważ tronie jest bardzo delikatne, kluczowe są ograniczenia związane z unieruchomieniem i obsługą TNT, a podejście to nie jest w stanie uchwycić dynamiki TNT w czasie rzeczywistym. Niemniej jednak, dla laboratoriów pracujących z pierwotnymi komórkami ludzkiej skóry, ten ustandaryzowany workflow zapewnia dostępny i spójny sposób wizualizacji TNT oraz wspiera dalsze badania ich potencjalnych funkcji w inżynierii tkankowej i regeneracji.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszystkie komórki skóry użyte w tym badaniu były wcześniej zamrożonymi komórkami pierwotnymi wyizolowanymi z ludzkich tkanek skóry pozyskanymi jako odrzucone próbki napletka podczas procedur obrzezania, i zostały w pełni zdeidentyfikowanejako 22. Pozyskanie próbek skóry ludzkiej przeprowadzono w Katedrze Urologii Szpitala Ludowego Uniwersytetu Ningbo, a protokół badania został zatwierdzony przez komisję etyki instytucjonalnej (Protokół nr 2024104; data zatwierdzenia: 30 października 2024).

1. Identyfikacja TNT w ludzkiej pierwotnej skórze, keratynocytach naskórkowych i fibroblastach skórnych

  1. Przygotowanie roztworu
    1. Przygotuj roztwór utrwalający 1 (200 μL), dodając 4% PFA (100 μL), 2,5% glutaraldehydu (4 μL), 1 M HEPES (40 μL) oraz 1x PBS (56 μL). Przygotuj świeże i podgrzej do 37 °C przed użyciem.
    2. Przygotuj roztwór utrwalający 2 (200 μL), dodając 8% PFA (100 μL), 1 M HEPES (0,4 μL), 1x PBS (99,6 μL). Przygotuj świeże i podgrzej do 37 °C przed użyciem.
    3. Przygotuj roztwór utrwalający 3 (200 μL), dodając 8% PFA (100 μL), 2,5% glutaraldehydu (4 μL) oraz 1x PBS (96 μL). Przygotuj świeże i podgrzej do 37 °C przed użyciem.
  2. Hodowla komórkowa
    1. Rozmrażaj i hoduj ludzkie keratynocyty naskórkowe oraz fibroblasty skórne w naczyniach o średnicy 60 mm, używając odpowiedniego podłoża wzrostowego. Uzupełnij hodowle keratynocytów Y-27632 w końcowym stężeniu 5 μM podczas resuscytacji. Utrzymuj hodowle w temperaturze 37 °C w nawilżonym inkubatorze do osiągnięcia ~80% konfluentności.
    2. Usuń podłoże i krótko umyj komórki 1 mL 1x PBS (używanego do utrzymania pH fizjologicznego i osmolarności podczas mycia). Aspiruj PBS.
    3. Dodaj 1 ml 0,05% trypsyny-EDTA, rozprowadz równomiernie i inkubuj w 37 °C przez 1,5-2,5 minuty.
    4. Delikatnie zawieszaj komórki przez pipetowanie. Dodaj 2 mL podłoża wzrostowego, przelej do probówki 15 mL i wiruj w 200 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
    5. Usuń supernatant i ponownie zawiesij granulat w 1-2 mL medium. Liczenie komórek za pomocą automatycznego licznika.
    6. Zasiej 12 000 fibroblastów skórnych lub 20 000 keratynocytów w każdej jamie szkiełka komorowego z 8 dołkami w końcowej objętości 400 μL. Po wysiewaniu dobrze potrząśnij komorą, aby równomiernie rozłożyć komórki. Inkubować przez ~24 godziny w temperaturze 37 °C.
    7. Po około 24 godzinach inkubacji obserwuj zbieg komórek pod mikroskopem. Jeśli osiągnie ~80%, przejdź do kolejnych etapów fiksacji.
  3. Fiksacja
    1. Gdy hodowle osiągną ~80% konfluencję, delikatnie dodaj kilka kropel roztworu utrwalacza 1 bezpośrednio do komory, aby prefiksować komórki. Inkubuj przez 4 minuty w temperaturze pokojowej. Upewnij się, że utrwalacz rozprowadza się równomiernie, nie zakłócając komórek.
      UWAGA: Obchodzić się ostrożnie, aby uniknąć zakłóceń TNT. Ponieważ roztwory utrwalające zawierają toksyczne składniki, takie jak PFA i glutaraldehyd, zawsze noś rękawice ochronne, odzież ochronną i maseczkę, a obchodz się z nimi w okapie oparowym. Pamiętaj, aby dokładnie umyć ręce po zabiegu. Zbieraj PFA i utrwalające odpady utrwalające glutaraldehyd osobno w oznaczonych pojemnikach do utylizacji substancji niebezpiecznych.
    2. Aspiruj prefiksator i zamień go na 140 μL świeżego roztworu utrwalacza 1, zapewniając pokrytie całej studni. Inkubuj przez 15 minut w temperaturze 37 °C.
    3. Usuń Roztwór Utrwalający 1 i dodaj 140 μL Roztworu Utrwalającego 2. Inkubuj przez 15 minut w temperaturze 37 °C. Upewnij się, że roztwór całkowicie pokrywa komórki, aby utrzymać równomierne utrwalenie.
    4. Usuń utrwalający, a następnie dodaj 140 μL 100 mM NH₄Cl, aby schłodzić pozostałe aldehydy. Inkubuj przez 10-30 minut w temperaturze pokojowej.
    5. Przepłukuj próbki 3 razy 1x PBS przez 30 sekund w temperaturze pokojowej, delikatnie pipetując wzdłuż ściany komory, aby nie zmyć komórek ani nie rozbić TNT.
  4. Barwienie błonowe i cytoszkieletowe
    1. Inkubuj komórki 140 μL konjugatu 1:300 (v/v) WGA (aglutininy z kiełków pszenicy)-fluoru Alexa, który oznacza glikoproteiny błony plazmatycznej do wizualizacji TNT pochodzących z błony, w 1x PBS przez 20 minut w ciemności i temperaturze pokojowej.
      UWAGA: Kolejne kroki muszą być wykonane w ciemnym środowisku.
    2. Umyj 3 razy z 1 PBS (po 30 sekund każdy). Inkubować 140 μL sprzężonej falloidyny rozcieńczonej w 1:250 (v/v) w 1% BSA przez 30 minut w ciemności i temperaturze pokojowej.
    3. Umyj 3 razy z 1 PBS (po 30 sekund każdy). Inkubuj z 140 μL roztworu DAPI przez 5 minut w temperaturze pokojowej w ciemności.
    4. Umyj 3 razy z 1× PBS. Dodaj 2-3 krople medium mocujących, inkubuj przez 20 minut w temperaturze pokojowej i przechowuj co najmniej 20 minut w ciemności w temperaturze 4 °C aż do wykonania obrazowania.
  5. Obrazowanie
    1. Uzyskuj obrazy za pomocą odwróconego mikroskopu konfokalnego z obiektywem 40x. Wybierz losowe pola i zbieraj stosy Z (10-20 warstw) od dołu do góry komórek. Szczegółowe parametry mikroskopu używane do akwizycji obrazu przedstawiono poniżej:
      Konfokalny mikroskop laserowy skanujący: ZEISS LSM 900
      Linie laserowe: Ścieżka 1 (561 nm, 4,0%), Ścieżka 2 (488 nm, 16,0%), Ścieżka 3 (405 nm, 60,0%)
      Wzmocnienie detektora: 525 V
      Rozmiar kroku Z: 20 sekcji optycznych (całkowita głębokość: 5,32 μm)

2. Współhodowla komórek naskórnych i skórnych

  1. Przygotuj keratinocyty i fibroblasty zgodnie z krokami 1.2.1-1.2.5.
  2. Zasiać 10 000 keratynocytów i 6 000 fibroblastów na komorę w dołku 400 μL podłoża. Po wysiewaniu dobrze potrząśnij komorą, aby równomiernie rozłożyć komórki. Inkubować przez 24 godziny w temperaturze 37 °C.
  3. Po około 24 godzinach inkubacji obserwuj zbieg komórek pod mikroskopem. Jeśli osiągnie ~80%, przejdź do kolejnych etapów fiksacji.
  4. Utrwal i barwił błony zgodnie z krokami 1.3-1.4.
  5. Przepuszcza komórki 0,1% Triton X-100, aby umożliwić dostęp przeciwciał do celów wewnątrzkomórkowych, przez 3 minuty w temperaturze pokojowej, a następnie 3x myje się 1x PBS.
    UWAGA: 0,1% Triton X-100 powinien być świeżo przygotowany przed użyciem.
    UWAGA: Triton X-100, szkodliwy dla organizmów wodnych, również musi być wyrzucany jako odpady chemiczne i nigdy nie wylewany do odpływu.
  6. Blokuj z 140 μL 2% BSA w PBS, aby zmniejszyć wiązanie przeciwciał niespecyficznych na 20 minut w temperaturze pokojowej.
    UWAGA: 2% BSA powinno być świeżo przygotowane przed użyciem.
  7. Inkubuj przez noc w temperaturze 4 °C z przeciwciałem antycytokeratyny 5 rozcieńczonym w 1:200 (v/v) w 2% BSA.
  8. Przemyj 3x 1x PBS, a następnie inkubuj z przeciwciałem wtórnym sprzężonym z Alexa Fluor 594 przez 1-2 godziny w temperaturze pokojowej w ciemności.
  9. Umyj 3 razy z 1× PBS. Barw jąder DAPI i obraz, zgodnie z krokami 1.4.5-1.5.2.

3. Identyfikacja składników cytoszkieletowych TNT

  1. Hodowla komórkowa
    1. Hoduj i utrwalaj komórki zgodnie z krokami 1.2-1.3. Przepuszczać z 0,1% Triton X-100 przez 3 minuty w temperaturze pokojowej, a następnie przeprać 1x PBS.
    2. Blokuj z 2% BSA przez 20 minut w temperaturze pokojowej. Inkubuj przez noc w temperaturze 4 °C z przeciwciałem przeciw α-tubulina.
    3. Przemyj 3x 1x PBS i inkubuj z przeciwciałem wtórnym sprzężonym z fluorem Alexa przez 1-2 godziny w temperaturze pokojowej w ciemności.
      UWAGA: Kolejne kroki muszą być wykonane w ciemnym środowisku.
    4. Myj 3 razy 1 razem PBS. Oznaczenie F-aktyny falloidyną i obrazem zgodnie z krokami 1.4.3-1.5
  2. Współkultywacja komórek
    1. Przygotuj kokultury zgodnie z krokami 2.1-2.2. Napraw roztworem utrwalacza 3 przez 15 minut w temperaturze pokojowej.
    2. Zastąpić 140 μL 100 mM NH4Cl i inkubować przez 10-30 minut w temperaturze pokojowej. Myj 3 razy 1 razem PBS.
    3. Najpierw zidentyfikować komórki naskórkowe poprzez permeabilizację, blokowanie i barwienie immunobarwne CK5 dokładnie zgodnie z krokami 2.4-2.8.
    4. Następnie wykonaj immunobarwienie α-tubuliną zgodnie z krokami 3.1.2-3.1.4.
    5. Na koniec barw F-aktynę falloidyną i kontynuuj obrazowanie zgodnie z krokami 1.4.2-1.5.2.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Korzystając z tego ustandaryzowanego protokołu, tunelujące nanorurki (TNT) zostały pomyślnie zidentyfikowane w ludzkich komórkach skóry zarówno w warunkach pojedynczej, jak i współhodowlanej. Aby zweryfikować specyficzność przeciwciał, przed analizami eksperymentalnymi przeprowadzono zarówno pozytywne, jak i ujemne barwienia kontrolne dla wszystkich przeciwciał, jak pokazano na Rysunku Uzupełniającym 1, Rysunku Uzupełniającym 2, Rysunku Uzupełniającym 3 oraz Rysunku Uzupełniającym 4. Rep...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Kluczowym krokiem w tym protokole jest zachowanie TNT podczas utrwalania i barwienia, ponieważ struktury te są niezwykle delikatne i łatwo ulegają uszkodzeniu. Delikatne obchodzenie się podczas stabilizacji, odpowiednie wyczucie czasu oraz użycie świeżych utrwalających są niezbędne do zachowania integralności TNT. Zastosowanie obrazowania konfokalnego stosu Z jest równie istotne, aby odróżnić TNT zawieszone powyżej podłoża od filopodiów lub innych przyczepnych wypustków, które w przeciwnym razie mogłyby prowadzić do błęd...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają konkurujących interesów finansowych do zgłoszenia.

Podziękowania

Projekt ten został sfinansowany przez Narodową Fundację Nauk Przyrodniczych Chin (grant nr 82273554). Autorzy dziękują Laboratorium Biomateriałów i Regeneracji Tkanek w Szpitalu Stomatologicznym w Ningbo za nieustanne wsparcie oraz dziękują zarówno obecnym, jak i byłym członkom zespołu za cenne rozmowy. Autorzy dziękują także nauczycielowi Feng Li z Centrum Badań i Eksperymentów Hangzhou Medical College za hojną pomoc i silne wsparcie ułatwiające dostęp do mikroskopu konfokalnego.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Rurka 15 mLKIRGENKG2611Bezpłodny, wolny od RNazy/DNAZ i pirogeniczny
37 i stopni; Inkubator CThermo Scientific51032877Inkubator CO2 o temperaturze 37 stopni zapewnia idealne warunki in vitro.
Actin-Tracker Red-RhodaminaBeyotimeC2207Sonda Actin-Tracker Red-Rhodamine to falloidyna oznaczona fluorescencyjnym barwnikiem Rhodamine, o maksymalnej długości fali wzbudzenia 540nm i maksymalnej długości emisji 565nm.
Alexa Fluor sprzężony aglutyniną z kiełków pszenicznych (WGA)Sondy molekularneW11261  Alexa Fluor 488 Sprzężony
Przeciwciało antyalfa-tubulinoweAbcamab7291Przeciwciało anty-alfa Tubulina - Load Control (ab7291) to mysie monoklonalne przeciwciało wykrywające alfa-tubulinę. Odpowiedni dla człowieka, myszy, szczura.
Przeciwciało antycytokeratyna 5 & nie;Abcamab52635Przeciwciało anty-cytokeratyna 5 - Marker cytoszkieletowy (ab52635) to przeciwciało monoklonalne dla królika wykrywające cytokeratynę 5. Odpowiedni dla człowieka, myszy, szczura.
Aqua-Poly/MontażNauki polinaukowe18606Rozpuszczalne w wodzie, niefluorescujące medium montażowe opracowane do montażu sekcji z roztworów wodnych. Przydatne w technikach immunofluorescencyjnym, ponieważ wzmacnia i zatrzymuje fluorescencyjne barwy.
Automatyczny licznik komórek komórkowychCountstarIC1000Automatyczny licznik komórek do szybkiego i precyzyjnego liczenia komórek
Wirówka stołowaBIORIDGETD5Wirówka stołowa do szybkiego i efektywnego oddzielania próbek w warunkach laboratoryjnych
Szafa bezpieczeństwa biologicznegoThermo Scientific1379Szafka bezpieczeństwa biologicznego to sterylne urządzenie zabezpieczające, które chroni operatorów, próbki i środowiska przed zagrożeniami biologicznymi poprzez filtrowanie patogenów przenoszonych w powietrzu i zapobieganie zanieczyszczeniu krzyżowemu podczas pracy mikrobiologicznej.
Albumina surowicy bydła (BSA)YOBIBIOU5010-10gBSA to globulina w surowicy bydła, zawierająca 583 reszty aminokwasowe o masie cząsteczkowej 66,430 kDa i punktie izoelektrycznym 4,7
Talerz do hodowli komórek (60x15 mm)Eppendorf30701119Hodowla tkankowa jest poddana bezpłodności, wolna od wykrywalnych pirogenów, RNazy i DNAZA, DNA.
Komora Cellvis Slide-8CellvisC8-1.5H-NZaprojektowany do obrazowania o wysokiej rozdzielczości, takiego jak mikroskopia konfokalna.
Roztwór barwienia DAPIBeyotimeC1006-10 mLRoztwór barwienia DAPI nadaje się do barwienia jądrowego wszystkich powszechnych komórek i tkanek.
IgG H& IgG dla kóz przeciwmyszy L (Alexa Fluor 405)  Abcamab175660IgG H& IgG dla kóz przeciwmyszy L (Alexa Fluor 405) to przeciwciało wtórne o maksymalnej długości fali absorpcji 401nm i maksymalnej emisji 421nm.
IgG H& Kozy przeciwkrólikowe L sprzężony z Alexa Fluor 405Abcamab175652IgG H& Kozy przeciwkrólikowe L (Alexa Fluor 405) to przeciwciało wtórne o maksymalnej długości fali absorpcji 401nm i maksymalnej emisji 421nm.
IgG H& Kozy przeciwkrólikowe L sprzężony z Alexa Fluor 594Abcamab150080IgG H& przeciwkrólikowy IgG & IgG L (Alexa Fluor 594) to przeciwciało wtórne o maksymalnej długości fali absorpcji 590 nm i maksymalnej emisji 617 nm.
Odwrócony konfokalny mikroskop fluorescencyjnyLeicaTCS SP8 XLaserowy skaningowy mikroskop konfokalny Leica SP8 X zapewnia niezrównane obrazowanie o wysokiej rozdzielczości z zaawansowanymi możliwościami wykrywania fluorescencji i analizy komórek na żywo.
Odwrócony konfokalny mikroskop fluorescencyjnyAndorBC43Andor BC43 to kompaktowy, wysokoobrotowy mikroskop konfokalny, oferujący obrazowanie 10 razy szybsze niż tradycyjne systemy, z możliwością obrazowania 2D/3D jednym kliknięciem
NH4Cl MedChemExpressHY-Y1269 Chlorek amonu jako związek polarny regulujący pH.
Falloidyna koniuguje Oregon GreenTM488Technologie życiaO7466Kolor: zielony. Zakres długości fal wzbudzenia: 496/520.
Fosforanowa sól fizjologiczna (PBS)Niech żyją biologie komórekC3582-0500Jego funkcją jest utrzymanie pH ośrodka w zakresie fizjologicznym oraz utrzymanie równowagi ciśnienia osmotycznego wewnątrz i na zewnątrz komórki.
Triton-X 100SolarbioT8200-100mlJest to wszechstronny niejonowy surfaktant stosowany do odnawiania składników membranowych w łagodnych warunkach denaturacji.
Roztwór trypsyny-EDTAGIBCO25300054Ze względu na swoją siłę trawienną trypsyna jest szeroko stosowana do dysocjacji komórek, rutynowego przekazywania hodowli komórek oraz dysocjacji tkanek pierwotnych.
Y-27632MedChemExpressHY-10071Y-27632 jest doustnie aktywnym, konkurencyjnym ATP-inhibitorem ROCK-I i ROCK-II

Bibliografia

  1. Austefjord, M. W., Gerdes, H. H., Wang, X. Tunneling nanotubes: Diversity in morphology and structure. Commun Integr Biol. 7 (1), e27934(2014).
  2. Liu, Z., Sun, Y., Qi, Z., Cao, L., Ding, S. Mitochondrial transfer/transplantation: an emerging therapeutic approach for multiple diseases. Cell Biosci. 12 (1), 66(2022).
  3. Yang, F., et al. Tunneling Nanotube-Mediated Mitochondrial Transfer Rescues Nucleus Pulposus Cells from Mitochondrial Dysfunction and Apoptosis. Oxid Med Cell Longev. 2022, 3613319(2022).
  4. Yang, C., et al. Mitochondria transfer from early stages of erythroblasts to their macrophage niche via tunnelling nanotubes. Br J Haematol. 193 (6), 1260-1274 (2021).
  5. Rustom, A., Saffrich, R., Markovic, I., Walther, P., Gerdes, H. H. Nanotubular highways for intercellular organelle transport. Science. 303 (5660), 1007-1010 (2004).
  6. Alarcon-Martinez, L., et al. Pericyte dysfunction and loss of interpericyte tunneling nanotubes promote neurovascular deficits in glaucoma. Proc Natl Acad Sci U S A. 119 (7), 2110329119(2022).
  7. Zhu, C., Shi, Y., You, J. Immune Cell Connection by Tunneling Nanotubes: The Impact of Intercellular Cross-Talk on the Immune Response and Its Therapeutic Applications. Mol Pharm. 18 (3), 772-786 (2021).
  8. Zhang, F., et al. TFAM-Mediated mitochondrial transfer of MSCs improved the permeability barrier in sepsis-associated acute lung injury. Apoptosis. 28 (7-8), 1048-1059 (2023).
  9. Jiang, D., et al. Mitochondrial transfer of mesenchymal stem cells effectively protects corneal epithelial cells from mitochondrial damage. Cell Death Dis. 7 (11), e2467(2016).
  10. Zheng, Y., et al. Tunneling nanotubes mediate KRas transport: Inducing tumor heterogeneity and altering cellular membrane mechanical properties. Acta Biomater. 185, 312-322 (2024).
  11. Dilsizoglu Senol, A., et al. α-Synuclein fibrils subvert lysosome structure and function for the propagation of protein misfolding between cells through tunneling nanotubes. PLoS Biol. 19 (7), e3001287(2021).
  12. Scheiblich, H., et al. Microglia rescue neurons from aggregate-induced neuronal dysfunction and death through tunneling nanotubes. Neuron. 112 (18), 3106-3125.e8 (2024).
  13. Solimando, A. G., et al. Tunneling nanotubes between bone marrow stromal cells support transmitophagy and resistance to apoptosis in myeloma. Blood Cancer J. 15 (1), 3(2025).
  14. Korenkova, O., et al. Tunneling nanotubes enable intercellular transfer in zebrafish embryos. Dev Cell. 60 (4), 524-534 (2025).
  15. Ma, L., et al. Dynamic three-dimensional culture enhances tunneling nanotubes-mediated mitochondrial transfer in mesenchymal stromal cells to accelerate wound healing. J Nanobiotechnol. 23 (1), 559(2025).
  16. Sahinbegovic, H., et al. Intercellular Mitochondrial Transfer in the Tumor Microenvironment. Cancers (Basel). 12 (7), 12071787(2020).
  17. Gurke, S., Barroso, J. F., Gerdes, H. H. The art of cellular communication: tunneling nanotubes bridge the divide. Histochem Cell Biol. 129 (5), 539-550 (2008).
  18. Kobielak, K., Pasolli, H. A., Alonso, L., Polak, L., Fuchs, E. Defining BMP functions in the hair follicle by conditional ablation of BMP receptor IA. J Cell Biol. 163 (3), 609-623 (2003).
  19. Nowak, J. A., Polak, L., Pasolli, H. A., Fuchs, E. Hair follicle stem cells are specified and function in early skin morphogenesis. Cell Stem Cell. 3 (1), 33-43 (2008).
  20. Woo, W. M., Zhen, H. H., Oro, A. E. Shh maintains dermal papilla identity and hair morphogenesis via a Noggin-Shh regulatory loop. Genes Dev. 26 (11), 1235-1246 (2012).
  21. Sáenz-de-Santa-María, I., Henderson, J. M., Pepe, A., Zurzolo, C. Identification and Characterization of Tunneling Nanotubes for Intercellular Trafficking. Curr Protoc. 3 (11), e939(2023).
  22. Liu, Z., et al. A Simplified and Efficient Method to Isolate Primary Human Keratinocytes from Adult Skin Tissue. J Vis Exp. (138), e57784(2018).
  23. Dupont, M., Souriant, S., Lugo-Villarino, G., Maridonneau-Parini, I., Vérollet, C. Tunneling Nanotubes: Intimate Communication between Myeloid Cells. Front Immunol. 9, 43(2018).
  24. Gerdes, H. H., Rustom, A., Wang, X. Tunneling nanotubes, an emerging intercellular communication route in development. Mech Dev. 130 (6-8), 381-387 (2013).
  25. Sartori-Rupp, A., et al. Correlative cryo-electron microscopy reveals the structure of TNTs in neuronal cells. Nat Commun. 10 (1), 342(2019).
  26. Dagar, S., Pathak, D., Oza, H. V., Mylavarapu, S. V. S. Tunneling nanotubes and related structures: molecular mechanisms of formation and function. Biochem J. 478 (22), 3977-3998 (2021).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Kokultura keratynocyt w i fibroblast wbarwienie F aktynyaglutynina z zarodnik w pszenicymikroskopia konfokalnadelikatna fiksacjaimmunobarwienie alfa tubulinykomunikacja kom rek sk ry

Powiązane artykuły