Terapeutyczne działanie granulek przeciwspazmatycznych Gualou Guizhi na spastyczność i PANoptozę w modelu szczura z urazem rdzenia kręgowego

Podsumowanie

Niniejsze badanie ocenia wpływ granulek przeciwspazmatycznych Gualou Guizhi (GLGZ) na spastyczność wywołaną urazem rdzenia kręgowego (SCI) za pomocą metod behawioralnych, biomechanicznych, obrazowych i histologicznych oraz bada mechanizmy związane z PANoptozą.

Streszczenie

Spastyczność mięśni po urazie rdzenia kręgowego (SCI) poważnie wpływa na jakość życia, a skuteczne leczenie jest ograniczone. Gualou Guizhi Antispasmodic Granules (GLGZ), opracowana w szpitalu formuła tradycyjnej medycyny chińskiej (TCM), może łagodzić skurcze. Celem tego badania było ocenienie skuteczności GLGZ w spastyczności indukowanej przez SCI oraz jej związku z PANoptosis (nowatorską programowaną śmiercią komórek obejmującą apoptozę, nekroptozę i pirostozę).

Użyto samców szczurów Sprague-Dawley o wadze 180-200 g. SCI zostało wywołane metodą Allena i spadku ciężaru. Udane szczury modelowe zostały losowo przypisane do grupy modelowej lub jednej z grup dawk GLGZ: wysoka, średnia lub niska. Szczury fałszywe przechodziły laminektomię bez urazu rdzenia kręgowego. Interwencje trwały 4 tygodnie. Po interwencji oceniono funkcję ruchów kończyn za pomocą skali Basso-Beattie-Bresnahan (BBB). Sztywność mięśni udowych oceniano za pomocą ultrasonografii fal ścinanych (SWE), natomiast integralność rdzenia kręgowego za pomocą rezonansu magnetycznego (MRI). Wykonano barwienie hematoksylin-eozyny (HE), Nissl i Luxol fast blue w celu obserwacji zmian histopatologicznych. Multipleksowe barwienie immunofluorescencyjne zostało użyte do oznaczania białka plamkowego związanego z apoptozą, zawierającego CARD (ASC, zielony), kaspaza-8 (pomarańczowy) oraz receptorowo-oddziałującą kinazę seryną/treoniną-białkową 3 (RIPK3, żółty), aby ocenić PANoptozę.

GLGZ poprawiło wyniki BBB zależnie od dawki: fałszywe (21,00 ± 0,00), modelowe (5,8 ± 1,1), wysokie dawki (10,6 ± 1,3), średnie dawki (8,5 ± 1,2), niskie dawki (7,1 ± 1,0). SWE wykazało zmniejszoną sztywność mięśni: model (6,68 ± 0,74 m/s), wysokie dawki (2,19 ± 0,36 m/s, P < 0,001), średnie dawki (3,04 ± 0,45 m/s, P = 0,002), niskie dawki (4,08 ± 0,65 m/s, P = 0,031) vs model. W porównaniu z grupą modelową (3,65 ± 1,03 mm²), GLGZ zależnie od dawki zmniejszała rozmiar uszkodzenia rdzenia kręgowego we wszystkich grupach dawkowych (wszystkie P < 0,05), (1,33 ± 0,79 mm² w wysokiej dawce, 1,94 ± 0,67 mm² w średniej dawce, 2,50 ± 0,79 mm² w grupie niskiej dawki. Histologia wykazała, że GLGZ zachowały neurony i sprzyjały naprawie mieliny. Zależna od dawki GLGZ zmniejszała ekspresję ASC, kaspazy-8 i RIPK3.

Wprowadzenie

Skurcz mięśni to częste powikłanie urazu rdzenia kręgowego (SCI), które poważnie wpływa na jakość życia pacjentów. Proces patologiczny obejmuje początkowe uszkodzenie mechaniczne, wtórne zapalenie, stres oksydacyjny, apoptozę oraz zaburzenia regeneracji nerwów, między innymi ^1,2. Obecne metody leczenia (chirurgiczna dekompresja, farmakoterapia, rehabilitacja) mają ograniczoną skuteczność, a długotrwałe leki powodują skutki uboczne, takie jak oporność na leki³. Dlatego kluczowe jest badanie nowych mechanizmów i metod leczenia.

Najnowsze badania zidentyfikowały PANoptozę, zaprogramowaną śmierć komórkową, która integruje apoptozę (zależną od kaspazy), nekroptozę (zależną od RIPK3/MLKL) oraz pirostozę (zależną od kaspazy-8/GSDMD)^4, jako kluczowy mechanizm patologiczny wtórnego uszkodzenia w SCI. Nieprawidłowa aktywacja (ASC, kaspazy-8 i RIPK3) powoduje utratę neuronów i powstawanie blizn glejowych, pogłębiając spastyczność⁵. Celowanie w PANoptosis stało się więc obiecującą strategią przerwania wtórnej kaskady urazów SCI⁴.

Tradycyjna medycyna chińska (TCM) zyskała na sobie uwagę w leczeniu chorób neurologicznych dzięki wielocelowym efektom (np. przeciwzapalnym, stresowi antyoksydacyjnym)^6. Granulki przeciwspazmatyczne Gualou Guizhi (GLGZ) pochodzą z Synopsis Złotej Komory Zhang Zhongjinga i są zoptymalizowane jako przygotowanie szpitalne⁷. Do jego składników należą Trichosanthes kirilowii (Tianhuafen), Cinnamomum cassia (Guizhi), Paeonia lactiflora (Baishao), Glycyrrhiza uralensis (Gancao), jujube oraz imbir⁸. Wstępne badania wykazały, że GLGZ łagodzi skurcze po uszkodzeniu ośrodkowego układu nerwowego poprzez regulację neuroprzekaźników i hamowanie stanu zapalnego^. Jednak jego wpływ na spastyczność wywołaną przez SCI oraz potencjalne powiązanie z PANoptozą pozostają niewyjaśnione.

W przeciwieństwie do konwencjonalnych leków jednocelowych, wieloskładnikowy charakter GLGZ wpisuje się w złożoną sieć patologiczną SCI – jednocześnie zajmując się stanem zapalnym, utratą neuronów, uszkodzeniem mieliny oraz potencjalnie PANoptozą. Badanie to zakłada, że GLGZ łagodzi spastyczność mięśniową u szczurów z rdzeniem rdzeniowym poprzez wspieranie patologicznej naprawy rdzenia kręgowego (redukcja stanu zapalnego, zachowanie neuronów, naprawa mieliny) oraz hamowanie panoptozy. Potwierdzając tę hipotezę, chcemy dostarczyć dowodów eksperymentalnych na GLGZ jako obiecującą terapię, która integruje łagodzenie objawów i podstawową patologiczną naprawę rdzenia rdzeniowego.

Protokół

Modelowanie zwierząt
Badanie to zostało zatwierdzone przez Komisję Etyczną Drugiego Szpitala Afiliowanego Uniwersytetu Tradycyjnej Medycyny Chińskiej w Fujian (Nr Zatwierdzenia FJPSPH-IAEC2024114) i przeprowadzane zgodnie z wytycznymi dotyczącymi dobrostanu zwierząt. Samce szczurów Sprague-Dawley ważące 180-200 g były trzymane w kontrolowanych warunkach przy temperaturze 22-26°C i wilgotności 40-70%. SCI zostało wywołane metodą Allena i spadkiem masy¹⁰: 3-4% znieczulenie wdechowe izofluranem, nacięcie środkowe w T10, ekspozycja segmentów T9-T11, laminektomia (opona twarda nienaruszona) oraz uderzenie (czubek 2 mm, prędkość 0,5 m/s, głębokość 1,3 mm, czas trwania 1 s). Szczury fałszywe przechodziły laminektomię bez ucisku. Kryteria włączenia: wynik BBB < 8 po 24 godzinach po operacji; Kryteria wykluczenia: infekcja, przecięcie rdzenia kręgowego. Opieka pooperacyjna: analgezja (buprenorfina, 0,1 mg/kg s.c., co 12 godzin przez 3 dni), ekspresja pęcherza moczowego (co 6 godzin przez tydzień) oraz sterylna pielęgnacja ran. Udane szczury modelowe zostały losowo przydzielone do grupy modelowej oraz grupy GLGZ o wysokiej (2,32 g/kg, n = 10), średniej (1,16 g/kg, n = 10), niskodawkowej (0,58 g/kg, n = 10).

Analiza funkcji ruchowych
Notowanie Basso, Beattiego i Bresnahana (BBB) było wykonywane na ślepo. Szczury obserwowano na otwartym polu przez 5 minut, obserwując ruchy stawów tylnych, noszenie ciężaru, chod i koordynację.

Elastografia fal ścinania do pomiaru sztywności mięśnia prostego udowego
Zastosowano system ultradźwiękowy Dopplera z sondą liniową (18L6). Szczury umieszczano w pozycji leżącej bocznej (mięśnie rozluźnione). SWE wykonywano z sondą ustawioną pod kątem 90° do mięśnia, na głębokości 1-2 cm. Obszar zainteresowania (ROI) został ustawiony na 0,5 × 0,5 cm, a na każdy pomiar uzyskano dziesięć klatek. Ostateczna wartość sztywności reprezentowała średnią trzech prawidłowych pomiarów. Zarejestrowano prędkość fali ścinającej (SWV); Zielona kontrola jakości wskazywała na poprawność obrazów¹¹.

Badanie MRI
MRI wykonano za pomocą skanera 7.0T z sekwencją T2 fatsuppressed oraz specyficzną dla zwierząt cewką. Parametry akwizycji były następujące: czas powtórzenia (TR) 3 800 ms, czas echa (TE) 72 ms, grubość przekroju 1 mm, rozmiar wokselu 0,1 × 0,1 × 1 mm, matryca 256 × 256, pole widzenia (FOV) 25,6 × 25,6 mm, cztery średnie sygnałów oraz ograniczenie oddechowe. Powierzchnię zmiany zmierzono za pomocą oprogramowania do przetwarzania obrazów.

Barwienie histologiczne
Barwienie HE przeprowadzano poprzez sekwencyjną deparafinizację, nawodnienie, barwienie hematoksyliną przez 5 minut, płukanie w bieżącej wodzie, różnicowanie w 1% kwasu solnego etanolu przez 30 sekund, barwienie eozyną przez 2 minuty, odwodnienie, oczyszczanie i montaż. Jako punkt kontrolny widoczne zabarwione fragmenty wykazywały niebieskie jądra i czerwoną cytoplazmę.

Barwienie Nissl przeprowadzono poprzez deparafinizację, rehydratację, inkubację w 0,1% błękitu toluidynowym w temperaturze 50-60 °C przez 30 minut, następnie płukanie wodą destylowaną, różnicowanie etanolem, odwodnienie, oczyszczanie i montowanie. Jako punkt kontrolny wizualny, w grupie pozorowanej wyraźnie zaobserwowano ciemnoniebieskie ciała Nissla.

Szybkie barwienie fioletu niebieskiego i kresylowego Luxol przeprowadzono poprzez deparafinizację, rehydrację, inkubację w Luxol fast blue w temperaturze 60 °C przez 2 godziny, płukanie etanolem 95%, różnicowanie w węglanie litu przez 30 sekund, a następnie 70% różnicowanie etanolem, kontrbarwienie krezyliotem przez 10 minut, odwodnienie, oczyszczanie i montaż. Stężenie robocze fioletu krezylnego wynosiło 0,1%. Jako punkt kontrolny wizualny w grupie pozorowanej zaobserwowano ciemnoniebieski mielin.

Wielowarstwowe barwienie immunofluorescencyjne wykonano od deparafinizacji, nawodnienia i pobierania antygenów przy użyciu buforu cytrynianowego (pH 6,0) w temperaturze 95 °C przez 20 minut. Cięcia były traktowane nadtlenkiem wodoru 3% przez 10 minut, a następnie blokowano 5% BSA w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę. Przeciwciała pierwotne inkubowano przez noc w temperaturze 4 °C (ASC: 1:500; Kaspaza-8: 1:400; RIPK3: 1:500). Po myciu PBS-T (0,1% Tween-20, 3 x 5 min) sekcje inkubowano z przeciwciałami wtórnymi znakowanymi HRP (1:1000) w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę. Następnie zastosowano znakowanie fluorochromowe: YTR520 Plus dla ASC, TYR570 Plus dla Caspase8 oraz TYR690 Plus dla RIPK3 (30 min), a następnie DAPI jądrowe barwienie przez 5 minut. Zamontowano preparaty, a obrazowanie wykonano za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego ustawionego na ekspozycję 500 ms, wzmocnienie 1,0, powiększenie ×200, z zestawami filtrów odpowiadającymi odpowiednim fluorochromom.

W przypadku ksylenu i etanolu wszystkie operacje wykonywano w okapu wyparowym, a podczas użytkowania nosiono rękawice i gogle. W przypadku odczynników barwiących unikano bezpośredniego kontaktu ze skórą. Wszystkie odczynniki odpadów zostały utylizowane w wyznaczonych pojemnikach na odpady niebezpieczne. W przypadku materiałów niebezpiecznych biologicznych przeprowadzono dokładną sterylizację autoklawową przed ostateczną utylizacją, aby zapobiec potencjalnemu zanieczyszczeniu biologicznemu.

Analiza statystyczna
Do porównań grupowych zastosowano jednokierunkowy test ANOVA z LSD post-hoc. P < 0,05 uznano za istotne statystycznie.

Wyniki

Wynik BBB
Wynik BBB w grupie fikcyjnej wyniósł 21,00 ± 0,00, co jest znacznie wyższe niż w modelu (5,8 ± 1,1, P < 0,001). GLGZ zależne od dawki zwiększają wyniki BBB: wysoka dawka (10,6 ± 1,3, P < 0,001), średnia dawka (8,5 ± 1,2, P = 0,003), niska dawka (7,1 ± 1,0, P = 0,028) vs model (Rysunek 1).

Analiza sztywności prostości prostej udźwigowej za pomocą fali ścinającej
Elastografia fal ścinanych (SWE) może odzwierciedl...

Dyskusja

Badanie to systematycznie oceniało łagodzące efekty GLGZ na spastyczność mięśni u szczurów z rdzeniem rdzeniowym oraz badało jej związek z neuroprotekcją i panoptozą. Wyniki wskazywały, że GLGZ może poprawić wyniki BBB i zmniejszyć sztywność mięśni u szczurów z rdzeniem rdzeniowym w sposób zależny od dawki. Badanie wykazało również, że mechanizm działania GLGZ może być powiązany z neuroprotekcją, naprawą mieliny oraz hamowaniem PANoptozy. Obecnie kliniczne leczenie farmakologiczne spastyczności mięśni po SCI głównie łago...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Bezwodny etanol & NBSP;	240403A1		Odwodnienie
Bezwodny etanol & NBSP;	241101A1		Barwienie
Środek powłokowy z tłumieniem antyfluorescencyjnym (zawierający DAPI)	MA0221		Barwienie immunofluorescencyjne
Przeciwciało ASC	Bs-6741R		Analiza PANoptosis (1:300)
Przeciwciało kaspaza-8	13423-1-AP		Analiza PANoptozy (1:400)
Mikroskop fluorescencyjny;	NIKON		ECLIPSECi-L
W pełni automatyczny cyfrowy skaner szkiełek szkieletowych	GCell-60		Skaner slajdów
Zestaw hematoksylin-eozynowy	R23718		Barwienie hematoksylinowo-eozynowe (HE)
Oprogramowanie do analizy obrazów	NIH		ImageJ 1.53k
Luxol Fast Blue	R23193		Luxol Fast Blue-Cresyl Violet barwienie
Skaner MRI	Bruker		7.0T
Zestaw do wielokrotnego barwienia fluorescencyjnego	240522		Barwienie immunofluorescencyjne
Zestaw do barwienia szpiku	G3245		barwienie szpikowe
Neutral   balsam	MB9899		Montaż po bejcowaniu
Zestaw do barwienia Nissl	R23093		Barwienie Nissl
Przeciwciało RIPK3	Bs-3551R		Analiza PANoptozy (1:400)
SPSS 22.0			oprogramowanie do analizy statystycznej i nbsp;
Szczury Sprague-Dawley	Firma biotechnologiczna Hangyi w Fuzhou
Kwas winowy, tripolifosforan sodu	10019418		Barwienie
System USG	SIEMENS Acuson		Sonda z tablicą liniową (18L6)
ksylen	240904A2		Barwienie