Artykuł metodologiczny

Elektrofizjologia jednokanałowa z wykorzystaniem zminiaturyzowanego płaskiego systemu błon lipidowych Montala–Muellera do rejestracji syntetycznego kanału K2P

3 wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/69903

⸱

9 października 2026

 ,  ,  ,  , 
1Department of Molecular Medicine, University of Pavia, 2Elements S.r.l.

W tym artykule

Podsumowanie

Niniejszy protokół opisuje zastosowanie zminiaturyzowanego systemu płaskich dwuwarstw lipidowych Montala–Muellera z wbudowanym wzmacniaczem do przeprowadzania stabilnych pomiarów z pojedynczego kanału. Metoda została zademonstrowana poprzez rekonstytucję oczyszczonego syntetycznego kanału K2P w celu walidacji wydajności systemu.

Streszczenie

Funkcjonalna rekonstytucja kanałów jonowych w płaskich dwuwarstwach lipidowych stanowi strategię badania aktywności kanałów na poziomie pojedynczych cząsteczek. Jednak konwencjonalne systemy dwuwarstw Montala-Muellera zazwyczaj wymagają rozbudowanych układów eksperymentalnych, ręcznego montażu komór oraz stosunkowo dużych objętości rejestracyjnych, co zwiększa zużycie odczynników i może wprowadzać dodatkowe źródła szumów elektrycznych ze względu na rozległe okablowanie i zewnętrzne przedwzmacniacze. W niniejszej pracy przedstawiamy zminiaturyzowaną, gotową do użycia platformę dwuwarstwową (BLMchipMM) zintegrowaną z kompaktowym wzmacniaczem, która umożliwia stabilne pomiary pojedynczych kanałów przy zmniejszonym zużyciu odczynników i uproszczonej obsłudze. Niniejszy protokół opisuje zastosowanie tego systemu do przeprowadzania elektrofizjologicznych pomiarów pojedynczych kanałów. Wykorzystując ten system, dokonaliśmy rekonstytucji syntetycznego kanału K2P (ancTREK1), który posłużył jako białko testowe w celu walidacji rekonstytucji oraz rejestracji pojedynczych kanałów. Pomiary pojedynczych kanałów wykazują zależność prądowo-napięciową w symetrycznych roztworach K+ wolnych od Mg2+, z wartościami przewodnictwa zgodnymi z tymi raportowanymi dla kanałów TREK1. Pomyślna rekonstytucja tego kanału typu K2P demonstruje użyteczność tego systemu do analizy pojedynczych kanałów w membranach sztucznych.

Wprowadzenie

Rekonstytucja kanałów jonowych w sztucznych błonach lipidowych, znanych również jako czarne błony lipidowe (BLM), jest jedną z uznanych technik służących do elektrofizycznej charakterystyki kanałów jonowych na poziomie pojedynczej cząsteczki1. Zalety BLM wynikają z ich struktury. Planarna błona lipidowa (PLB) powstaje wewnątrz poru w powierzchni niepolarnej, oddzielając dwa roztwory ciekłe. Dzięki naśladowaniu błony biologicznej umożliwia ona rejestrację aktywności kanałów jonowych w ściśle kontrolowanych warunkach, w tym przy określonym składzie lipidowym błony oraz stężeniach elektrolitów lub związków chemicznych, pozostając jednocześnie dostępną z obu stron. Dostępność ta pozwala również na bezpośrednie wprowadzanie kanałów jonowych, na przykład z roztworu micelarnego lub poprzez fuzję indukowaną liposomami2,3.

Pierwszy opisany system sztucznych błon stworzono przy użyciu techniki malowania4, w której kropla lipidów rozpuszczonych w nielotnym rozpuszczalniku organicznym jest nanoszona na niewielki otwór za pomocą pędzla. Następnie dodanie roztworu wodnego po obu stronach otworu prowadzi do spontanicznego utworzenia się lipidowej dwuwarstwy. Istotną wadą tej metody jest jednak pozostawanie śladów rozpuszczalnika, co może wpływać na właściwości błony. Aby zmniejszyć ilość pozostałego rozpuszczalnika organicznego w obrębie lipidowych dwuwarstw, opracowano metodę składania5, która umożliwia tworzenie BLM wolnych od rozpuszczalnika. W tym podejściu roztwór lipidów w lotnym rozpuszczalniku rozprowadza się na powierzchni wody, tworząc dwie monowarstwy, a poprzez stopniowe podnoszenie poziomu fazy wodnej nad otworem, monowarstwy lipidowe składają się nad otworem, tworząc dwuwarstwę. Jednak mimo że tak powstała BLM jest określana jako wolna od rozpuszczalnika, pomyślne utworzenie dwuwarstwy wymaga uprzedniego potraktowania otworu cienką warstwą nielotnego rozpuszczalnika. Podstawowym elementem niezbędnym do tych eksperymentów jest komora pomiarowa z dwiema komorami wodnymi (typowo nazywanymi cis i trans), oddzielonymi lipofilową przegrodą z małym otworem (o średnicy 50–250 µm) (Rysunek 1). Do każdej komory wprowadza się elektrody srebro/chlorek srebra (Ag/AgCl). Po zanurzeniu w roztworze elektrolitu elektrody te ustanawiają połączenie elektrochemiczne między lipidową dwuwarstwą a aparaturą pomiarową. Ta ostatnia składa się z wzmacniacza typu voltage-clamp, który umożliwia precyzyjną kontrolę potencjału transbłonowego i jednoczesny pomiar prądów jonowych przepływających przez osadzone białka tworzące pory.

figure-introduction-1
Rysunek 1: Schemat układu do elektrofizjologii płaskiej błony lipidowej (PLB). Schemat kluczowych komponentów wymaganych do eksperymentów PLB. Komora pomiarowa składa się z dwóch przedziałów wodnych (cis i trans) oddzielonych lipofilną przegrodą z otworem, w którym tworzona jest błona lipidowa. Elektrody srebrowe/chlorek srebra (Ag/AgCl) są zanurzone w roztworze elektrolitu w każdym z przedziałów. Jedna elektroda przykłada bodźce napięciowe (np. przebiegi sinusoidalne, prostokątne lub trójkątne), podczas gdy druga, uziemiona, jest podłączona do konwertera prąd-napięcie, który przekształca prąd jonowy w proporcjonalny sygnał napięcia. Sygnał jest wzmacniany, opcjonalnie filtrowany, digitalizowany i rejestrowany w celu monitorowania i analizy w czasie rzeczywistym. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Opracowano również inne metody formowania BLM. Wśród nich powszechnym podejściem jest tworzenie lipidowych dwuwarstw zawieszonych na końcówce pipety do patch-clampu. Odpowiednio, metoda tip-dip6 umożliwia utworzenie zawieszonej, wolnej od rozpuszczalnika dwuwarstwy lipidowej w otworze szklanej mikropipety o średnicy ~4 µm poprzez wielokrotne zanurzanie końcówki w monowarstwie lipidowej na granicy powietrze-woda, co pozwala na wychwycenie pojedynczej warstwy podczas każdego przejścia. Technika patch-clamp była również stosowana do pomiarów pojedynczych kanałów w dwuwarstwach lipidowych. Na przykład w metodzie punch-out7 szklana pipeta o średnicy od 10 do 80 µm jest używana do pobrania fragmentu dużej membrany, która pierwotnie pokrywała otwór w komorze pomiarowej. Alternatywnie, metoda liposome-patch obejmuje użycie wstępnie uformowanego pęcherzyka o rozmiarze od nano- do mikroskalowego jako wolnej od rozpuszczalnika BLM8,9. W szczególności gigantyczne pęcherzyki jednowarstwowe były szeroko stosowane do rejestracji pojedynczych kanałów przy użyciu różnych konfiguracji patch-clamp, w tym w trybach cell-attached oraz excised patch10,11.

Powstało również kilka platform umożliwiających równoległe i zautomatyzowane tworzenie wielu dwuwarstw. Jednym z takich podejść jest technika dwuwarstwy na interfejsie kropel (DIB)12, w której krople wodne umieszcza się w mieszaninie lipid–rozpuszczalnik. W tej metodzie monowarstwy lipidowe spontaneously formują się wokół kropli, a powstanie dwuwarstwy następuje w momencie zetknięcia się dwóch kropli. W niektórych konfiguracjach DIB mogą być tworzone na hydrożelach w celu poprawy stabilności błony13. Alternatywnym podejściem opartym na tworzeniu DIB na końcówce szklanej pipety jest metoda dwuwarstwy z pęcherzyków kontaktowych (CBB)14, w której pęcherzyki wodne wprowadza się do fazy olejowej za pomocą dwóch mikropipet. Podobnie jak w podejściu DIB, dwuwarstwa lipidowa powstaje spontanicznie, gdy dwie pokryte lipidami pęcherzyki zostaną ze sobą zetknięte. Kolejną platformę reprezentują systemy BLM w układach macierzowych, które składają się z macierzy dobrze zdefiniowanych porów o rozmiarach od mikro- do nanometrowych, rozmieszczonych w układzie siatki. W tych systemach zawieszone dwuwarstwy lipidowe mogą być tworzone albo ręcznie — za pomocą technik malowania lub składania, albo poprzez rozrywanie pęcherzyków liposomów15,16,17 — albo automatycznie poprzez sekwencyjną iniekcję roztworów lipidów i buforów, gdy system jest sprzężony ze strukturami kanałów mikroprzepływowych18,19.

Choć opracowano wiele metod tworzenia BLMs bez użycia rozpuszczalników, w niniejszej pracy skupiamy się na metodzie składania (folding method) zaimplementowanej w zminiaturyzowanej i zintegrowanej platformie w celu zbadania zachowania pojedynczych kanałów białek błonowych osadzonych w sztucznej lipidowej dwuwarstwie. Eksperymenty przeprowadzono przy użyciu zestawu Elements, który składa się z dwóch komponentów: czytnika nanoporów Elements (wzmacniacza eNPR) oraz BLMchipMM (Rysunek 2A i Rysunek 2B). Pierwszy z nich to kompaktowy, niskoszumowy wzmacniacz typu voltage-clamp, który upraszcza stanowisko badawcze, tworząc kompletną i niezależną jednostkę, co eliminuje potrzebę stosowania dodatkowych urządzeń zewnętrznych. BLMchipMM to wstępnie zmontowany, zminiaturyzowany system zaprojektowany dla techniki Montala–Muellera, który służy jako interfejs eksperymentalny. Składa się on z przezroczystej komory pomiarowej z polimetakrylanu metylu (PMMA) zintegrowanej z płytką drukowaną (PCB), która zawiera dwa gniazda przystosowane do drutów Ag/AgCl służących jako elektrody do bezpośredniego połączenia z wzmacniaczem. Rdzeń struktury komory stanowi przegroda polimidowa uszczelniona pomiędzy dwoma przezroczystymi komponentami PMMA. Przegroda ma grubość 50 µm, z wyjątkiem niewielkiego obszaru centralnego (3,78 mm2), gdzie grubość została zredukowana do 25 µm, aby ułatwić tworzenie dwuwarstwy. W centrum tego cieńszego obszaru, za pomocą wiercenia laserowego, wykonano zwężający się otwór, co zwiększa stabilność mechaniczną dwuwarstwy lipidowej20,21. Dostępne są cztery średnice otworu (50, 75, 100 i 140 µm), co umożliwia dostrojenie pojemności błony (Tabela 1). Każdy komponent PMMA posiada w kształcie litery C wnękę o objętości 110 µL, tworząc dwie komory płynowe po obu stronach przegrody polimidowej do przechowywania roztworu elektrolitu. W każdym bloku PMMA po przeciwnych stronach wywiercono dwa nachylone kanały płynowe: jeden kanał służy do wprowadzenia elektrody Ag/AgCl, natomiast drugi umożliwia ręczną regulację poziomu buforu w zbiorniku za pomocą pipetowania.

figure-introduction-2
Rysunek 2: Zintegrowany system Elements Nanopore Reader oraz BLMchipMM. (A) Fotografia przedstawiająca BLMchipMM włożony do dedykowanego slotu wzmacniacza Elements Nanopore Reader (eNPR). (B) Schematyczne przedstawienie komponentów BLMchipMM, w tym komory pomiarowej z polimetakrylanu metylu (PMMA), septa poliimidowego zawierającego mikroaperturę oraz płytki drukowanej (PCB) z gniazdami dla elektrod Ag/AgCl i slotem do wyrównania komory. Aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku, kliknij tutaj.

Średnica otworu (µm)5075100140
Grubość otworu (µm)25252525
Typowa pojemność błony (pF)20–4040–6060–9090–140

Tabela 1: Charakterystyka dostępnych formatów apertury BLMchipMM. Średnica otworu, grubość przegrody w obszarze apertury oraz typowe wartości pojemności błony dla urządzeń BLMchipMM z aperturami 50, 75, 100 i 140 µm. Wartości pojemności błony przedstawiono dla dwuwarstw utworzonych z lipidów 1,2-diphytanoyl-sn-glycero-3-phosphocholine.

Zazwyczaj komory pomiarowe stosowane w laboratoriach są albo jednostkami wykonanymi samodzielnie, albo urządzeniami dostępnymi komercyjnie. W pierwszym przypadku konstrukcja systemu wiąże się z montażem różnych komponentów i opracowaniem niezawodnej metody tworzenia otworu w przegrodzie, co może ograniczać dostępność tej metody dla wielu laboratoriów. Nawet w przypadku stosowania urządzeń komercyjnych często wymagana jest ręczna integracja wielu elementów przed każdym eksperymentem. W przeciwieństwie do nich, BLMchipMM jest wstępnie zmontowany i nie wymaga demontażu między eksperymentami w celu przeprowadzenia rutynowych procedur czyszczenia. Ta sama jednostka może być myta i używana wielokrotnie w różnych eksperymentach bez pogorszenia jakości tworzenia błony, pod warunkiem, że stosowane rozpuszczalniki są kompatybilne z materiałami urządzenia. Redukuje to zmienność zależną od użytkownika i minimalizuje ryzyko wycieków związanych z ręcznymi elementami uszczelniającymi. Zastosowanie zewnętrznych, wymiennych i odnawialnych elektrod z drutu srebrnego dodatkowo wydłuża czas użytkowania systemu, szczególnie w warunkach eksperymentalnych przyspieszających zużycie elektrod.

Ponadto urządzenia wykonane amatorsko często charakteryzują się dużymi objętościami komór, co zwiększa ilość komponentów biologicznych i chemicznych wymaganych do przeprowadzenia eksperymentów. W przeciwieństwie do nich, miniaturyzacja BLMchipMM pozwala na zminimalizowanie objętości eksperymentalnych, co znacząco redukuje zużycie odczynników, białek i innych związków. Jest to szczególnie korzystne w przypadku pracy z trudnymi do ekspresji lub niskowydajnymi białkami błonowymi, a także wtedy, gdy wysoki koszt syntezy związków testowych zwiększa całkowity koszt badań. Co istotne, BLMchipMM umożliwia tworzenie dwuwarstw z minimalną ilością rozpuszczalnika i wspiera asymetryczne konfiguracje błon, w których każda warstwa może składać się z różnych gatunków lipidów5,22, co ułatwia badanie funkcji białek błonowych w kontrolowanych warunkach.

Tradycyjnie pomiary prądu wykonuje się za pomocą wzmacniaczy przeznaczonych do eksperymentów patch-clamp, które często wymagają połączenia z oddzielnym digitalizatorem w celu akwizycji danych i sterowania za pomocą interfejsów graficznych. Systemy te są nie tylko nieporęczne i kosztowne, ale często wiążą się również z nieintuicyjnymi procedurami konfiguracji dla użytkowników niebędących ekspertami. Ponadto, ze względu na rozmiar komory pomiarowej oraz konstrukcję standardowych wzmacniaczy — którym zazwyczaj brakuje wbudowanego ekranowania chroniącego wejście przedwzmacniacza przed zakłóceniami elektrostatycznymi — często niezbędne jest zastosowanie zewnętrznej klatki Faradaya. Jakość i uziemienie takiej klatki mogą znacząco wpływać na poziom szumów systemu. Urządzenie BLMchipMM, stosowane z kompaktowym zintegrowanym wzmacniaczem, upraszcza tę konfigurację, redukując zapotrzebowanie na komponenty zewnętrzne. Digitalizacja sygnału odbywa się wewnątrz urządzenia, a obudowa systemu zapewnia ekranowanie, które zmniejsza podatność na zewnętrzne zakłócenia elektromagnetyczne.

Aby zademonstrować przydatność tej platformy, wykorzystano kanał typu K2P o nazwie ancTREK1, będący obliczeniowo wyznaczonym przodkiem z podrodziny TREK (Supplementary Figure 1), jako białko testowe w celu walidacji poprawnej rekonstytucji oraz rejestracji prądów pojedynczego kanału. Kanały K2P tworzą dimeryczne kanały przecieczowe dla potasu, które regulują spoczynkowy potencjał błonowy oraz pobudliwość komórkową, przy czym kanały TREK stanowią dobrze scharakteryzowaną podrodzinę.

Protokół

Badanie to nie obejmowało uczestników będących ludźmi, materiałów pochodzenia ludzkiego ani zwierząt doświadczalnych. W związku z tym, zgodnie z wytycznymi instytucjonalnymi i krajowymi, nie było wymagane uzyskanie zgody komisji etycznej.

1. Przygotowanie układu do elektrofizjologii

  1. Kalibracja instrumentu
    ​Chociaż formalna kalibracja nie jest wymagana, ponieważ system jest skonfigurowany fabrycznie, należy zweryfikować prawidłowe działanie systemu przed formowaniem błony.
    1. Zmierzyć rezystancję wejściową w warunkach otwartego obwodu (tzn. bez włożonego modułu BLMchipMM). Zmierzona rezystancja powinna wynosić ≥1 TΩ, co potwierdza prawidłową integralność wejścia wzmacniacza.
    2. Zweryfikować odpowiedź systemu przy użyciu komórki modelowej zawierającej rezystor 1 GΩ. Zmierzona rezystancja powinna wynosić 1 GΩ z dokładnością ±30%, co jest zgodne z tolerancją zintegrowanego rezystora.
    3. Zmierzyć szum bazowy w warunkach otwartego obwodu przy stałym napięciu (0 mV). Szum RMS powinien wynosić ≤300 fA przy częstotliwości próbkowania 10 kHz i szerokości pasma 5 kHz, co potwierdza niskoszumową wydajność systemu.
  2. Przygotowanie elektrod Ag/AgCl
    1. Przy pierwszym użyciu opłukać srebrne druty etanolem i wodą dwukrotnie destylowaną.
    2. W przypadku drutów używanych wcześniej, użyć papieru ściernego o bardzo drobnej ziarnistości, aby usunąć starą warstwę Ag/AgCl z powierzchni drutu, aż powierzchnia stanie się jednolitym, jasnym srebrem o czystym metalicznym połysku i bez widocznych osadów. Następnie opłukać etanolem i wodą dwukrotnie destylowaną.
    3. Chlorować końcową część srebrnych drutów, mocząc je w 1%–5% podchlorynie sodu (NaOCl) (Rysunek 3A) do momentu uzyskania jasnoszarego koloru, zazwyczaj przez 15–30 min. Monitorować chlorowane druty w czasie pod kątem degradacji podczas użytkowania, która objawia się zmianą koloru, dryftem prądu bazowego lub obiema tymi zmianami.
      UWAGA: Chlorowanie można przeprowadzić przy użyciu zwykłego domowego wybielacza (1%–5% NaOCl).
      OSTRZEŻENIE: Nie chlorować drutów na całej ich długości. Pozostawić końcową część wkładaną do gniazda PCB niechlorowaną, aby zapewnić prawidłowe połączenie elektryczne.
      ​OSTRZEŻENIE: Gniazda na płytce PCB są przeznaczone dla srebrnych drutów o średnicy 0,5 mm. Inne średnice mogą nie pasować prawidłowo lub mogą prowadzić do niestabilnych połączeń.
  3. Montaż BLMchipMM
    1. Włożyć niechlorowaną końcową część dwóch srebrnych drutów do gniazd PCB. W razie potrzeby użyć pęsety, aby odpowiednio je ustawić (Rysunek 3B).
    2. Umieścić chlorowane końce drutów w kanałach płynowych nawierconych w komponencie PMMA (Rysunek 3C).
    3. Delikatnie obrócić BLMchipMM i zamontować go na płytce PCB, dopasowując dolny ząb komory rejestracyjnej PMMA do dedykowanego gniazda (Rysunek 3D).
    4. Sprawdzić położenie drutów i upewnić się, że docierają one do końca kanałów płynowych. W razie potrzeby delikatnie pchnąć druty, aż ich końce pojawią się na dnie komór (Rysunek 3E).
      ​OSTRZEŻENIE: Umieścić druty jak najbliżej komponentu PMMA. Nadmierne wygięcie może spowodować kontakt z pokrywą wzmacniacza, co doprowadzi do zwarcia i nasycenia sygnału.
  4. Przygotowanie lipidów i roztworu do pomiaru
    1. Przygotować 100 µL 1% (v/v) roztworu heksadekanu w 100% n-heksanie do wstępnego przygotowania otworu przegrody. Przechowywać ten roztwór w temperaturze −20°C przez maksymalnie jeden tydzień.
    2. Resuspendować lipidy 1,2-diphytanoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DPhPC) w 100% n-pentanie do końcowego stężenia 15 mg/mL. Przechowywać ten roztwór w temperaturze −20°C przez maksymalnie 24 h.
    3. Przygotować elektrolitowy roztwór do pomiaru w temperaturze pokojowej (RT; 20°C–25°C), mieszając 3 mL roztworu stokowego 1 M KCl z 150 µL roztworu stokowego 1 M kwasu 4-(2-hydroksyetylo)-1-piperazynoetanosulfonowego (pH 7,4 skorygowane za pomocą KOH przy użyciu pH-metru). Dodać wodę dwukrotnie destylowaną, aby uzyskać końcową objętość 15 mL. Przechowywać roztwór w temperaturze 4°C przez maksymalnie jeden tydzień (Tabela 2).

figure-protocol-1
Rysunek 3: Montaż urządzenia BLMchipMM. (A) Chlorowanie drutów Ag poprzez namaczanie w wybielaczu. (B) Wkładanie drutów Ag do gniazd PCB. (C) Pozycjonowanie drutów Ag w kanałach mikrofluidycznych. (D) Umieszczenie komory rejestracyjnej na PCB. (E) Weryfikacja prawidłowego rozmieszczenia elektrod w kanałach fluidycznych. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

OdczynnikStężenie końcoweObjętość
Woda podwójnie destylowana—Dopełnić do 15 mL
Chlorek potasu (KCl) (1 M)200 mM3 mL
HEPES pH 7.4 (KOH) (1 M)10 mM150 µL

Tabela 2: Roztwór elektrolitu do rejestracji. Skład roztworu elektrolitu używanego do rejestracji PLB, w tym stężenia odczynników i objętości przygotowania. Objętość końcową doprowadza się do 15 mL wodą dwukrotnie destylowaną. Roztwór do rejestracji należy przefiltrować przez filtr strzykawkowy 0,2 µm przed użyciem.

UWAGA: Przed użyciem przefiltruj roztwór do rejestracji za pomocą filtra strzykawkowego 0.2 µm. Lipidy DPhPC mogą być dostarczane w formie suchego proszku lub rozpuszczone w chloroformie. Obie formy należy przechowywać w temperaturze −20°C w szczelnych szklanych fiolkach w atmosferze gazu obojętnego, aby zapobiec utlenianiu. Przed otwarciem należy pozwolić, aby suchy proszek wyrównał temperaturę do RT. Nowe roztwory z suchego proszku należy przygotować i zużyć w ciągu 24 h. W przypadku stosowania zapasów w chloroformie, należy całkowicie odparować rozpuszczalnik w strumieniu azotu przed resuspensją, ponieważ pozostałości chloroformu mogą destabilizować membranę.

2. Formowanie PLB metodą Montala–Muellera

Poniższe kroki opisują tworzenie sztucznej błony metodą składania, nazywaną również techniką Montala–Muellera5 (Rysunek 4). Podejście to polega na wstępnym potraktowaniu otworu przegrody cienką warstwą 1% (v/v) heksadekanu w n-heksanie, naniesieniu roztworu lipidów w celu utworzenia monowarstw na granicy powietrze–woda oraz składaniu monowarstw nad otworem w miarę sukcesywnego podnoszenia poziomu roztworu elektrolitu w komorach.

figure-protocol-2
Rysunek 4: Tworzenie PLB metodą Montala–Muellera. (A) Wstępna obróbka otworu 1% heksadekanem w n-heksanie i napełnianie komór do poziomu otworu. (B) Tworzenie monowarstw lipidowych na granicy powietrze–woda. (C i D) Sekwencyjne podnoszenie poziomu buforu w każdej komorze, prowadzące do zagięcia monowarstw i utworzenia wolnej od rozpuszczalnika dwuwarstwy lipidowej w obrębie otworu. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

  1. Formowanie membrany
    1. Przetraktować otwór przegrody 1% (v/v) roztworem heksadekanu w n-heksanie za pomocą końcówki pipety. Nanieść około 2 µL na każdą stronę (Rysunek 4A).
    2. Pozostawić rozpuszczalnik do odparowania przez 5 min w temperaturze 23°C–25°C i wilgotności względnej 45%–50%.
    3. Włożyć zmontowany BLMchipMM do wzmacniacza.
    4. Podłączyć wzmacniacz do komputera za pomocą kabla USB i uruchomić oprogramowanie akwizycyjne.
    5. Ustawić zakres prądu na 2 nA i aktywować narzędzie estymacji RC w celu monitorowania pojemności i rezystancji membrany.
      UWAGA: Ustawienia estymacji RC są skonfigurowane domyślnie, ale można je dostosować w razie potrzeby.
    6. Wypełnić każdą komorę 30 ± 2 µL roztworu rejestracyjnego do dolnej krawędzi otworu (Rysunek 4A).
      OSTRZEŻENIE: Należy dopilnować, aby roztwór rejestracyjny nie zwilżył obszaru wokół otworu.
    7. Nanieść kroplowo 2,5 ± 0,1 µL roztworu lipidów na powierzchnię fazy wodnej w każdej komorze (Rysunek 4B).
    8. Pozostawić rozpuszczalnik do odparowania przez 2 min.
    9. Umieścić końcówkę pipety na dnie jednej z komór pod kątem około 90° i dodać 80 ± 2 µL roztworu rejestracyjnego. Powtórzyć czynność dla drugiej komory (Rysunek 4C i Rysunek 4D).
      UWAGA: Czasy odparowania rozpuszczalnika odnoszą się do warunków: 23°C–25°C, statyczne powietrze i wilgotność względna 45%–50%.
    10. Zamknąć pokrywę klatki Faradaya i monitorować sygnał prądowy. Wartości rezystancji membrany powyżej 200 GΩ wskazują na pomyślne utworzenie dwuwarstwy i dobrą integralność membrany.
      UWAGA: Pomyślne utworzenie membrany sygnalizuje prądowy sygnał prostokątny fluktuujący wokół zera, z amplitudą proporcjonalną do pojemności membrany (Rysunek 5A).

figure-protocol-3
Rycina 5: Monitorowanie formowania błony za pomocą interfejsu oprogramowania akwizycyjnego. (A) Reprezentatywny zapis obrazujący prawidłowe formowanie błony. Trójkątny przebieg napięcia (100 mV szczyt-szczyt, 10 Hz) generuje prostokątny prąd pojemnościowy proporcjonalny do pojemności błony (~45 pF). (B) Reprezentatywny zapis wskazujący na brak formowania błony, charakteryzujący się nasyceniem sygnału prądowego. (C) Sygnał pojemnościowy odpowiadający pojemności pasożytniczej w sytuacji, gdy dwuwarstwa nie została utworzona, np. gdy otwór jest odsłonięty. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

UWAGA: Sygnał przełączający się między granicami zakresu prądowego wskazuje na uszkodzenie membrany (Rysunek 5B).

UWAGA: Szum RMS rośnie wraz z pojemnością membrany, a co za tym idzie, wraz z rozmiarem otworu. Typowe zakresy szumów mierzone w warunkach stałego napięcia (0 mV), przy częstotliwości próbkowania 5 kHz i szerokości pasma 2,5 kHz, wynoszą: 0,48–2,00 pA (50 µm); 0,74–2,62 pA (75 µm); 1,00–3,52 pA (100 µm) oraz 1,59–5,27 pA (140 µm).

UWAGA: Obniżenie i podwyższenie poziomu buforu w jednej z komór może wspomóc tworzenie błony, jeśli pierwsze próby okażą się nieudane.

UWAGA: W razie potrzeby, aby ułatwić tworzenie dwuwarstwy, należy przyłożyć pęcherzyk powietrza nad otworem przez ok. 5 s, używając końcówki pipety.

UWAGA: Obniżenie poziomu buforu poniżej otworu lub wprowadzenie pęcherzyka powietrza może spowodować powstanie sygnału odpowiadającego pojemności pasożytniczej (Rycina 5C). Jeśli sygnał wyjściowy przypomina Rycynę 5B, wstępna obróbka mogła być nieskuteczna. Należy ponownie zastosować roztwór do wstępnej obróbki oraz lipidy lub wyczyścić urządzenie i powtórzyć procedurę.

UWAGA: Kompensację przesunięcia napięcia należy przeprowadzać wyłącznie w przypadku braku membrany. Jeśli membrana jest obecna, należy ją przerwać za pomocą funkcji ZAP przed dokonaniem kompensacji.

UWAGA: Eksperymenty można przeprowadzać na standardowym stole laboratoryjnym, jednak w razie potrzeby można zastosować stół antywibracyjny.

3. Czyszczenie BLMchipMM

  1. Zdejmij komorę rejestracyjną z płytki PCB.
  2. Przemyć oba przedziały oraz kanały płynowe 100% alkoholem izopropylowym (IPA).
    UWAGA: Nie przekraczać 1 minuty ekspozycji na IPA.
    UWAGA: Nie należy używać acetonu ani 100% etanolu, ponieważ rozpuszczalniki te mogą uszkodzić materiał uszczelniający komory.
    UWAGA: Przed użyciem należy sprawdzić kompatybilność wszelkich dodatkowych rozpuszczalników z PMMA.
  3. Dokładnie wypłukać wodą dwukrotnie destylowaną.
  4. Całkowicie osusz komorę rejestracyjną, używając łagodnego strumienia sprężonego powietrza, aż do momentu, gdy nie będzie widocznych żadnych kropel wody.
    UWAGA: Należy sprawdzić komorę pod lupą z oświetleniem, aby upewnić się, że nie pozostały w niej żadne tłuste filmy. W razie potrzeby należy powtórzyć procedurę czyszczenia i suszenia.
    UWAGA: Przed rozpoczęciem nowego eksperymentu należy upewnić się, że komora jest całkowicie czysta i sucha.

4. Ekspresja i oczyszczanie syntetycznego kanału jonowego (ancTREK1)

  1. Przygotuj konstrukt ekspresyjny
    Poniższe kroki opisują strategie klonowania, ekspresję heterologiczną w komórkach Freestyle-293F oraz oczyszczanie białka ancTREK1.
    ​Konstrukcja wektora ekspresyjnego z wykorzystaniem amplifikacji PCR, trawienia enzymami restrykcyjnymi, ligacji oraz transformacji do chemicznie kompetentnych komórek Escherichia coli23,24Wyrazić sekwencję ancTREK1 (Rysunek uzupełniający 1) przy użyciu wektora ssaczego zawierającego C-końcowy znacznik GFP i His₈ znacznik umożliwiający detekcję fluorescencyjną25,26 or dwuetapowe oczyszczanie powinowactwem z wykorzystaniem kwasu niklowo-nitrilotriacetylowego (Ni2⁺-żywica NTA)27,28,29 następnie z zastosowaniem żywicy z nanoprzeciwciałem anty-GFP30,31,32.
  2. Amplifikacja DNA ancTREK1 metodą PCR
    1. Rozcieńczyć primery PCR i matrycę DNA do końcowych stężeń 10 µM oraz ~20 ng/µL przy użyciu sterylnej wody dwukrotnie destylowanej.
    2. Rozmrozić wszystkie odczynniki na lodzie.
    3. Przygotuj 50 µL reakcja PCR zawierająca 10 µL z 5× bufor, 2.5 µL z każdego 10 µM starter, 2 µL matrycy DNA, 1 µL 10 mM dNTP, 0.5 µL polimerazy DNA o wysokiej wierności oraz sterylnej wody podwójnie destylowanej do uzyskania odpowiedniej objętości (Tabela 3). Delikatnie wymieszać i krótko odwirować.
    4. Przeprowadź reakcję PCR zgodnie z następującymi warunkami: wstępna denaturacja w 98°C przez 3 min; 30 cykli 98°C przez 30 s, 68°C przez 30 s, a następnie 72°C przez 30 s; końcowa elongacja w 72°C przez 3 min (Tabela 4).
    5. Rozdziel produkt PCR w 1% (m/v) żelu agarozowym w 1× bufor TAE przy napięciu 60 V przez 90 min, a następnie wyciąć odpowiedni prążek.
      ​UWAGA: Produkty PCR należy oczyścić metodą ekstrakcji z żelu, zmierzyć stężenie DNA przy 260 nm i przechowywać oczyszczone produkty PCR w temperaturze −20°C jeśli jest to wymagane.
  3. Wykonanie trawienia restrykcyjnego
    1. Przygotować mieszaniny reakcyjne do trawienia zawierające 2 µg produktu PCR i 2 µg plazmidowego DNA w oddzielnych probówkach. Dodać 5 µL z 10× bufor, 0.5 µL EcoRI i 0.5 µL enzymy restrykcyjne NotI, a następnie dostosować do 50 µL wodą dwukrotnie destylowaną (Tabela 5).
    2. Delikatnie wymieszać i inkubować w temperaturze 37°C przez 3 h.
    3. Inaktywować termicznie enzymy w temperaturze 65°C przez 20 min.
    4. Dodaj 1 µL fosfatazę alkaliczną do trawienia wektora i inkubować w 37°C przez 1 h.
    5. Produkty trawienia należy rozdzielić w 1% żelu agarozowym, a następnie wyciąć i wyekstrahować odpowiednie prążki.
      ​UWAGA: Fragmenty DNA należy oczyścić za pomocą odpowiednich metod oczyszczania, a oczyszczone DNA przechowywać w temperaturze −20°C jeśli jest to wymagane.
  4. Przeprowadzenie ligacji i transformacji
    1. Przygotuj 20 µL reakcja ligacji zawierająca wektor i insert (stosunek molowy 3:1), 2 µL 10× bufor ligazowy i 1 µL enzym ligaza (Tabela 6).
    2. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 1 h.
    3. Odprzemrozić chemicznie kompetentne komórki E. coli na lodzie.
    4. Dodaj 5 µL mieszaniny ligacyjnej do 50 µL komórek i inkubować w lodzie przez 20 min.
    5. Szok termiczny w temperaturze 42°C przez 1 min, a następnie ponownie schłodzić na lodzie przez 2 min.
    6. Dodaj 450 µL pożywka LB i inkubacja w temperaturze 37°C przy wstrząsaniu przez 1 h.
    7. Wirować przy 3000 obr./min × g przez 1 min i resuspendować osad w 50 µL.
    8. Wysiać na agar selektywny i inkubować przez noc w temperaturze 37°C.
      ​UWAGA: Prawidłowość klonowania należy potwierdzić za pomocą sekwencjonowania.
  5. Transfekcja komórek HEK293F
    1. Zasiać komórki 293F w objętości 250 mL w zagęszczeniu 0,5 x 10^6 komórek/ml × 106 komórek/ml w bezserowym medium suspensyjnym i inkubować w 37°C z dodatkiem 6% CO₂.
    2. Przygotuj 250 µg DNA w końcowej objętości 3 ml pożywki z obniżoną zawartością surowicy.
    3. Przygotuj 750 µg przygotować roztwór polietyleniminy (PEI) w wodzie o stężeniu 1 mg/ml, dostosować pH do poziomu 6,9–7,1 za pomocą NaOH, przefiltrować roztwór przez filtr sterylny i uzupełnić końcową objętość do 3 ml za pomocą pożywki z obniżoną zawartością surowicy.
    4. Połączyć roztwory DNA i PEI, delikatnie wymieszać i inkubować przez 10 min w temperaturze pokojowej.
    5. Dodawać mieszaninę kroplowo do komórek.
    6. Po 4 h dodać maślan sodu do stężenia końcowego 10 mM.
    7. Po 48 h zebrać komórki poprzez wirowanie przy 500 g × g przez 15 min.
    8. Przechowywać osady komórkowe w temperaturze −80°C.
  6. Rozpuszczanie białek błonowych
    1. Odprzeżyć na lodzie pellety komórkowe uzyskane z 100 ml hodowli HEK293.
    2. Resuspender osad komórkowy w buforze do lizy w stosunku 1:10 (m/v) (Tabela 7).
      Dodać detergent do stężenia końcowego 1% n-dodecyl-β-D-maltozydu (DDM) i 0,1% hemisukcynianu cholesterylu (CHS).
    3. Inkubować z rotacją w temperaturze 4°C przez 2 h.
    4. Wirować przy 100 000 g × g przez 1 h w temperaturze 4°C.
    5. Zebrać nadsącz.
      UWAGA: Wszystkie etapy należy przeprowadzać w 4°C przy użyciu schłodzonych wcześniej buforów.
  7. Przeprowadź oczyszczanie metodą IMAC
    1. Opakowanie 500 µL niku (Ni)2⁺żywica Ni-NTA do kolumny grawitacyjnej.
    2. Równoważyć żywicę dwiema objętościami kolumny (CV) buforu równoważącego (Tabela 8).
    3. Należy wprowadzić próbkę i inkubować przy łagodnym mieszaniu z prędkością 10 obr./min oraz 4°C przez 3 h.
    4. Ustaw kolumnę pionowo i zbierz frakcję przepływową w drodze grawitacyjnej.
    5. Przemyj żywicę 10-krotnością objętości kolumny (CV) buforu do płukania zawierającego 30 mM imidazolu.
    6. Eluuj białko za pomocą 10 objętości kolumny (CV) buforu elucyjnego zawierającego 300 mM imidazolu.
      UWAGA: Analizować frakcje za pomocą SDS-PAGE (Rysunek 6). Przechowywać frakcje przepływowe i płuczące do analizy. Przechowywać białko w 4°C na noc, jeśli jest to wymagane
  8. Przeprowadź oczyszczanie przeciw-GFP
    1. Napełnij kolumnę grawitacyjną 1 ml żywicy anti-GFP.
    2. Równoważyć żywicę przy użyciu 2 objętości kolumny (CV) buforu 1 (Tabela 9). Należy nanieść eluat z chromatografii IMAC i inkubować przy delikatnym mieszaniu z prędkością 10 obr./min oraz 4°C przez 3 h.
    3. Ustaw kolumnę pionowo i zbierz filtrat w drodze grawitacyjnej.
    4. Przemyć żywicę sekwencyjnie 10 CV Buforu 1, 10 CV Buforu 2 oraz 10 CV Buforu 1.
    5. Rozcieńczyć proteazę HRV-3C w 2 ml Buforu 1 w stosunku proteazy do białka 1:50.
    6. Dodać do żywicy bufor 1 uzupełniony o proteazę HRV-3C, delikatnie wymieszać i inkubować przez noc w temperaturze 4°C w pionowej pozycji statycznej.
    7. Zebrać odszczepione białko z frakcji elucyjnej.
    8. Skoncentruj próbkę za pomocą koncentratora odśrodkowego z progiem odcięcia 50 kDa przy 3000 g. × g i 4°C do uzyskania końcowej objętości około 500 µL zostanie osiągnięte.
      UWAGA: Analiza frakcji metodą SDS-PAGE (Rysunek 7). W trakcie zagęszczania należy okresowo resuspender białko, aby zapobiec jego agregacji. Oczyszczone białko przechowywać w temperaturze −80°C po błyskawicznym mrożeniu. Około 60 µg białka można uzyskać ze 100 mL hodowli.

figure-protocol-4
Rysunek 6: Oczyszczanie ancTREK1 za pomocą chromatografii powinowactwa do zimmobilizowanych jonów metali (IMAC).Analiza frakcji elucji IMAC metodą elektroforezy w żelu poliakryloamidowym z dodecylosiarczanem sodu (SDS-PAGE) z detekcją fluorescencyjną. Ścieżka M: marker masy cząsteczkowej. Ścieżka a: frakcja elucji IMAC wykazująca obecność ancTREK1 z nadaną znacznikową zieloną białkiem fluorescencyjnym (GFP) (żółta strzałka). Wolne GFP powstałe w wyniku autokatalitycznego cięcia jest oznaczone jako (*eGFP). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

figure-protocol-5
Rysunek 7: Oczyszczanie ancTREK1 za pomocą chromatografii powinowactwa z użyciem nanoprzeciwciała anty-GFP.Analiza SDS-PAGE frakcji elowanych barwionych błękitem Coomassie. Ścieżka M: marker masy cząsteczkowej. Ścieżka a: frakcja elowania anty-GFP wykazująca obecność proteazy 3C. Ścieżka b: oczyszczony ancTREK1 po zagęszczeniu. Aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku, kliknij tutaj.

OdczynnikObjętość dla 50 µL reakcjaStężenie końcowe
Woda podwójnie destylowanaDodać do 50 µL—
5× PhusionTM bufor GC10 µL1×
dNTP (po 10 mM każdy)1 µL200 µM każdy
starter forward (10 µM)2.5 µL0.5 µM
starter odwrotny (10 µM)2.5 µL0.5 µM
Matryca DNA (20 ng/µL)2 µL0,8 ng/µL
PhusionTM Polimeraza DNA o wysokiej wierności0.5 µL0,02 U/µL

Tabela 3: Konfiguracja reakcji polimerazy łańcuchowej (PCR) dla amplifikacji ancTREK1. Skład odczynników, objętości i stężenia końcowe użyte do amplifikacji PCR sekwencji DNA ancTREK1 z wykorzystaniem systemu wysokowiernej polimerazy DNA.

KrokTemperaturaCzasCykle
Wstępna denaturacja98°C3 min1
Denaturacja98°C30 s30
Wyżarzanie68°C30 s30
Rozszerzenie72°C30 s30
Końcowa elongacja72°C3 min1
Przytrzymaj12°CPrzytrzymać—

Tabela 4: Warunki cykli PCR dla amplifikacji ancTREK1.Parametry cyklicznych zmian temperatury zastosowane do amplifikacji sekwencji DNA ancTREK1, obejmujące etapy denaturacji, przyłączania starterów, elongacji oraz końcowej elongacji.

Komponenttrawienie wkładki (50 µL)Trawienie i defosforylacja wektora (50 µL)
ddH2O₂ODo 50 µLDo 50 µL
10× Bufor Czerwony ANZA5 µL5 µL
Kwas deoksyrybonukleinowy (DNA)produkt PCR ancTREK1 (2 µg)DNA wektora pEG BacMam C-term 3C eGFP His8 (2 µg)
Anza™ EcoRI0.5 µL0.5 µL
Anza™ NotI0.5 µL0.5 µL
Anza™ Fosfataza alkaliczna—1 µL

Tabela 5: Trawienie enzymami restrykcyjnymi insertu i wektora do klonowania ancTREK1.Warunki reakcji dla trawienia restrykcyjnego produktu PCR ancTREK1 oraz wektora ekspresyjnego z użyciem enzymów EcoRI i NotI. Trawienie wektora obejmuje dodatkowy etap defosforylacji przy użyciu fosfatazy alkalicznej w celu zapobiegania samoligacji.

SkładnikIlość (reakcja 20 µL)
ddH₂Odo 20 µL
10× T4 DNA Ligase Buffer2 µL
DNA insertu ancTREK1 (843 bp)10 ng
DNA wektora pEG BacMam C-term 3C eGFP His8 (7673 bp)30 ng
T4 DNA Ligase1 µL

Tabela 6: Warunki ligacji wektora z insertem dla klonowania ancTREK1. Mieszanina reakcyjna do ligacji insertu ancTREK1 do wektora ekspresyjnego pEG BacMam w stosunku molowym 1:3 przy użyciu ligazy T4 DNA.

KomponentStężenie końcoweIlość (do 5 ml)
podwójnie destylowana H2O₂O—do 5 ml
KCl (1 M)200 mM1 mL
Tris-HCl pH 8 (1 M)20 mM100 µL
MgCl₂₂ (100 mM)1 mM50 µL
inhibitor proteaz PMSF (100 mM)1 mM50 µL
Inhibitor proteaz leupeptyna (1 mg/ml)1 µg/mL5 µL
inhibitor proteaz aprotynina (1 mg/ml)1 µg/mL5 µL
Inhibitor proteazy pepstatyna A (1 mg/ml)1 µg/mL5 µL
DNaza I (50 mg/mL)25 µg/mL2.5 µL
n-dodecyl-β-D-maltosyd (DDM, 10%)1%500 µL
Hemisukcynian cholesterylu (CHS, 2%)0.10%250 µL

Tabela 7: Skład buforu do lizy dla ekstrakcji białek błonowych. Skład buforu do lizy stosowanego do solubilizacji białek błonowych, zawierający sole, substancje buforujące, inhibitory proteaz, nukleazę i detergenty. Uwaga: bufory powinny być świeżo przygotowane przed użyciem.

Bufor równoważący (objętość całkowita 10 mL)
SkładnikStężenie końcoweIlość
ddH₂O—do 10 mL
KCl (1 M)200 mM2 mL
Tris-HCl pH 8 (1 M)20 mM200 µL
n-Dodecyl-β-D-maltoside (DDM, 10%)0.05%50 µL
Cholesteryl hemisuccinate (CHS, 2%)0.01%50 µL
Bufor do płukania (objętość całkowita 10 mL)
SkładnikStężenie końcoweIlość
ddH₂O—do 10 mL
KCl (1 M)200 mM2 mL
Tris-HCl pH 8 (1 M)20 mM200 µL
n-Dodecyl-β-D-maltoside (DDM, 10%)0.05%50 µL
Cholesteryl hemisuccinate (CHS, 2%)0.01%50 µL
Imidazole pH 8 (5 M)30 mM60 µL
Bufor do elucji (objętość całkowita 10 mL)
SkładnikStężenie końcoweIlość
ddH₂O—do 10 mL
KCl (1 M)200 mM2 mL
Tris-HCl pH 8 (1 M)20 mM200 µL
n-Dodecyl-β-D-maltoside (DDM, 10%)0.05%50 µL
Cholesteryl hemisuccinate (CHS, 2%)0.01%50 µL
Imidazole pH 8 (5 M)300 mM600 µL

Tabela 8: Składy buforów IMAC do oczyszczania ancTREK1.Formulacje buforów do równoważenia, płukania i elucji stosowanych w chromatografii powinowactwa do zimmobilizowanych jonów metali w celu oczyszczania ancTREK1. Uwaga: roztwory można przechowywać w temperaturze 4°C do sześciu miesięcy.

Bufor 1 (objętość całkowita 10 ml)
KomponentStężenie końcoweIlość
ddH2O₂O—Do 10 ml
KCl (1 M)200 mM2 ml
Tris-HCl pH 8 (1 M)20 mM200 µL
n-dodecyl-β-D-maltozyd (DDM, 10%)0.05%50 µL
hemisukcynian cholesterylu (CHS, 2%)0.01%50 µL
Bufor 2 (objętość całkowita 10 ml)
KomponentStężenie końcoweIlość
ddH2O₂O—do 10 ml
KCl (1 M)500 mM5 mL
Tris-HCl pH 8 (1 M)20 mM200 µL
n-dodecyl-β-D-maltosyd (DDM, 10%)0.05%50 µL
Hemisukcynian cholesterylu (CHS, 2%)0.01%50 µL

Tabela 9: Składy buforów do chromatografii powinowactwa z wykorzystaniem nanociał przeciwko GFP. Formuły buforów stosowanych do oczyszczania ancTREK1 za pomocą chromatografii powinowactwa z wykorzystaniem nanociał przeciwko GFP. Uwaga: roztwory można przechowywać w temperaturze 4°C przez maksymalnie sześć miesięcy.

5. Rejestracja aktywności kanałów jonowych

  1. Ocena jakości błony
    1. Zamknij pokrywę klatki Faradaya.
    2. Zastosuj trójkątną falę napięcia (100 mV, 10 Hz), aby ocenić pojemność błony.
    3. Zastosuj skoki napięcia (przyrosty ±20 mV do ±200 mV), aby ocenić oporność błony.
    4. Monitoruj wartości prądu i szumu.
      ​UWAGA: Stosuj częstotliwość próbkowania 5 kHz i filtrowanie dolnoprzepustowe 2,5 kHz, chyba że wymagane jest inaczej.
  2. Rejestracja aktywności ancTREK1
    1. Rozcieńcz białko ancTREK1 w roztworze pomiarowym do stężenia ~2 µg/mL.
      UWAGA: Podczas rozcieńczania wykonuj rozcieńczenia pośrednie w buforze 1, jeśli jest to konieczne, aby utrzymać stężenie detergentu powyżej krytycznego stężenia micelarnego (CMC) przed końcowym rozcieńczeniem w roztworze pomiarowym.
    2. Dodaj 1 µL rozcieńczonego roztworu białka do komory cis w pobliżu otworu przegrody.
      UWAGA: Potencjał błony definiuje się jako Vcis − Vtrans. Orientacja kanału nie została bezpośrednio określona w niniejszym badaniu; dlatego pomiary opisano w odniesieniu do polaryzacji przyłożonego napięcia, a nie przypisanej stronności błony.
    3. Zastosuj skoki napięcia w przyrostach ±20 mV do ±120 mV.
    4. Monitoruj zdarzenia wbudowania kanałów.
      UWAGA: Wbudowanie kanału sygnalizowane jest przez dyskretne przejścia prądu między stanem zamkniętym a otwartym. Jeśli nie nastąpi wbudowanie, dodaj więcej białka lub sformuj błonę ponownie. Jeśli wbuduje się wiele kanałów, przerwij ciągłość błony i zmniejsz stężenie białka.

Wyniki

Charakterystyki prądowo-napięciowe (I–V) membran PLB

Wrodzona hydrofobowa natura błon dwuwarstwowych sprawia, że są one nieprzepuszczalne dla gatunków naładowanych. Jednakże przyłożenie zewnętrznego pola elektrycznego może indukować tworzenie się przejściowych porów o rozmiarach nanometrycznych, wpływając tym samym na przepuszczalność i przewodnictwo błony33. Aby ocenić jakość sztucznych dwuwarstw utworzonych z lipidów 1,2-difitanoilo-sn-glicero-3-fosfocholiny, w warunkach braku wstawionych białek oceniono pojemność, rezystancję oraz charakterystyki I–V błony. Zastosowano serię skoków napięcia w zakresie od ±20 do ±200 mV (w przyrostach ±20 mV) i zarejestrowano wynikające z nich prądy transbłonowe. Dane próbkowano z częstotliwością 5 kHz i filtrowano dolnoprzepustowo przy 2,5 kHz.

Pojemność błony (Cm) oraz oporność błony (Rm) stanowią kluczowe parametry służące do oceny jakości dwuwarstwy. PLB można opisać za pomocą równoważnego obwodu rezystorowo-kondensatorowego (RC), w którym błona zachowuje się jak kondensator połączony równolegle z rezystorem34. Komponent pojemnościowy odzwierciedla zdolność błony do gromadzenia ładunku, natomiast komponent rezystywny odzwierciedla przepuszczalność jonową. Przyłożenie trójkątnego przebiegu napięcia generuje prostokątną odpowiedź prądu pojemnościowego, która jest proporcjonalna do pojemności błony zgodnie z zależnością:

figure-results-1    (1)

W tym przypadku Cm oznacza pojemność błony, V jest napięciem przyłożonym, a t to czas. Po utworzeniu błony wartości pojemności mogą zwiększać się w czasie ze względu na postępujące ścieńczenie dwuwarstwy35. Przyjmując, że błona jest kondensatorem płytkowym, pojemność jest powiązana z powierzchnią i grubością błony zgodnie z zależnością:

figure-results-2    (2)

W tym przypadku εlipids to stała dielektryczna rdzenia lipidowego (~2), ε0 to przenikalność elektryczna próżni, A to powierzchnia błony, a d to grubość błony36,37.

Opór błony określono z wykorzystaniem prawa Ohma33:

figure-results-3    (3)

Tutaj V to przyłożone napięcie, a Rm to oporność błony. W przypadku braku kanałów jonowych prąd błonowy pozostaje bliski 0 pA, co odpowiada wartościom oporności w zakresie gigaomów (GΩ)33.

Zależność I–V wykazywała liniową charakterystykę (ohmiczną) w zakresie od 0 do ±200 mV dla urządzeń BLMchipMM z aperturą 75 i 100 µm. Liniowe dopasowanie danych pozwoliło uzyskać wartości oporności błony wynoszące 847 ± 16 GΩ (n = 6) dla apertury 75 µm (Rysunek 8A, koła) oraz 980 ± 32 GΩ (n = 7) dla apertury 100 µm (Rysunek 8A, kwadraty). Wartości szumu RMS, mierzone w 3 s segmentach zapisu prądu, wynosiły 3,1 ± 2 pA (n = 7) dla apertury 100 µm oraz 2,6 ± 0,1 pA (n = 6) dla apertury 75 µm. Stabilność błony oceniano poprzez pomiar oporności w odstępach około 2 min przez całkowity czas 1 h (Rysunek 8B). Prawidłowo uformowane błony pozostawały stabilne przez ponad 1 h, co jest wystarczające dla większości eksperymentów elektrofizjologicznych. Błony zazwyczaj tolerowały przyłożone potencjały do ±200 mV bez oznak niestabilności, podczas gdy przebicie następowało w zakresie od ±220 do ±300 mV, w zależności od poszczególnej dwuwarstwy. Błony uznano za odpowiednie do wbudowywania białek, gdy wartości pojemności mieściły się w zakresie od 40 do 60 pF dla apertur 75 µm oraz od 60 do 90 pF dla apertur 100 µm, przy wartościach prądu ≤0,5 pA przy 100 mV.

figure-results-4
Rycina 8: Charakterystyka elektryczna PLB. (A) Zależności prądowo-napięciowe (I–V) dla dwuwarstw utworzonych na aperturach o średnicy 75 µm i 100 µm, wykazujące liniowe (ohmiczne) zachowanie w zakresie ±200 mV. Regresja liniowa daje wartości oporu błony odpowiednio 847 ± 16 GΩ (n = 6) i 980 ± 32 GΩ (n = 7). (B) Stabilność błony oceniona poprzez monitorowanie oporu przez 1 h w odstępach 2 min. Błony pozostają stabilne do ±200 mV i ulegają przerwaniu przy napięciach między ±220 a ±300 mV. Dane przedstawiono jako średnią ± błąd standardowy średniej (SEM). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Wstępna charakterystyka zachowania pojedynczego kanału ancTREK1

Syntetyczny ancTREK1 został oczyszczony i wbudowany w PLB, a aktywność pojedynczego kanału monitorowano przy użyciu protokołów skokowych napięcia w zakresie od −120 do 120 mV w przyrostach 20 mV. Rejestracje z pojedynczego kanału (Rysunek 9A oraz Rysunek 9B) wykazały charakterystyczne zachowanie migotania (flickering) kanałów K2P38. Przy 80 mV średnia amplituda prądu wynosiła 13,02 ± 0,78 pA (n = 5), natomiast przy −80 mV amplituda prądu wzrosła do −18,72 ± 0,25 pA (n = 5) (Rysunek 9C). Wynikowa zależność I–V wykazała mierzalne prądy pojedynczego kanału zarówno przy potencjałach dodatnich, jak i ujemnych w symetrycznych warunkach 200 mM potasu bez Mg2+ (Rysunek 9D). Ponieważ amplitudy prądu oszacowano na podstawie histogramów wszystkich punktów z rejestracji pozyskanych przy częstotliwości 5 kHz i przefiltrowanych dolnoprzepustowo przy 2,5 kHz, zależność I–V ta jest przedstawiona jako opisowy dowód koncepcji, a nie jako wyczerpująca charakterystyka biofizyczna.

figure-results-5
Rysunek 9: Aktywność pojedynczego kanału syntetycznego ancTREK1. (A i B) Reprezentatywne zapisy prądów pojedynczych kanałów zarejestrowane odpowiednio przy 80 mV i −80 mV. Linie przerywane wskazują poziom zamkniętego kanału. (C) Histogramy amplitud wszystkich punktów dla potencjałów dodatnich (lewo) i ujemnych (prawo). (D) Zależność I–V dla ancTREK1 w symetrycznych warunkach 200 mM potasu (K+) bez kationów dwuwartościowych. Krzywa została dopasowana za pomocą wielomianu czwartego stopnia, a wartości przewodnictwa wyznaczono z nachylenia przy ±80 mV. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.

Mimo że ancTREK1 nie posiada rozbudowanych regionów N- i C-terminalnych w porównaniu do ssaczych kanałów TREK1, pozostał on funkcjonalnie aktywny po rekonstytucji. W przeciwieństwie do ssaczego TREK1, który wykazuje tryby wysokiego i niskiego przewodnictwa (odpowiednio 132 ± 5 pS i 41 ± 5 pS przy potencjałach dodatnich)39, ancTREK1 wykazywał jedynie tryb dużego przewodnictwa. Przewodnictwo pojedynczego kanału przy potencjałach dodatnich wynosiło 112,8 ± 10,8 pS (80 mV, n = 5), co jest zgodne z raportowanymi wartościami dla kanałów TREK (85–130 pS w symetrycznych warunkach potasowych)38,39,40,41. Przy potencjałach ujemnych przewodnictwo wzrosło do 205,6 ± 2,05 pS (−80 mV, n = 5), co jest zgodne z wcześniej opisywanym zachowaniem TREK139. Co istotne, ancTREK1 wykazywał wyższe znormalizowane prawdopodobieństwo otwarcia (NPo) w porównaniu do pomiarów TREK1 uzyskanych w konfiguracjach wyciętych płatów błony (excised patch)42. Zależność NPo od napięcia wykazała zwiększoną aktywność kanału przy potencjałach dodatnich, osiągając wartość 0,78 ± 0,02 (n = 5) przy 80 mV. W przeciwieństwie do tego, NPo spadało przy potencjałach ujemnych, przyjmując wartości 0,53 ± 0,04 przy −80 mV oraz 0,28 ± 0,03 przy −120 mV (Rycina 10).

figure-results-6
Rysunek 10: Analiza zależności aktywności pojedynczego kanału ancTREK1 od napięcia. Znormalizowane prawdopodobieństwo otwarcia (NPo) jako funkcja potencjału błonowego (po lewej) oraz porównanie NPo przy 80 mV i −80 mV (po prawej), wykazujące zwiększone otwarcie kanałów przy potencjałach dodatnich. Aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku, kliknij tutaj.

Rycina uzupełniająca 1. Sekwencja aminokwasowa syntetycznego przodka kanału potasowego z dwiema domenami porów (K2P) (ancTREK1). Pełna sekwencja aminokwasowa ancTREK1 wykorzystana do pomiarów elektrofizjologicznych. Sekwencję zrekonstruowano poprzez wnioskowanie sekwencji przodka z opracowanego zbioru danych członków rodziny TREK/TRAAK, obejmującego sekwencje ortologiczne pobrane z baz danych UniProt i NCBI, przefiltrowane pod kątem konserwatywnych motywów poru, wyrównane i przeanalizowane przy użyciu filogenetyki maksymalnej wiarygodności.Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Dyskusja

W niniejszym badaniu wykorzystaliśmy technikę PLB do oceny właściwości elektrofizjologicznych syntetycznego kanału K2P na poziomie pojedynczej cząsteczki. Spośród różnych płaskich modeli lipidowych opisanych w literaturze naukowej, skoncentrowaliśmy się na tworzeniu BLMs, które są nanoszone na otwór o średnicy od 50 do 140 µm, wykonany w pionowej powierzchni niepolarnej oddzielającej dwa przedziały wodne. Konfiguracja ta pozwala na symulację środowiska błony komórkowej przy jednoczesnym zachowaniu kontroli nad parametrami eksperymentalnymi, w tym nad przygotowaniem błony lipidowej i składem elektrolitu (np. siłą jonową i pH)3. Odtworzyliśmy BLMs, stosując metodę Montala–Muellera (składania)5, w której błona formuje się spontanicznie, gdy dwie monowarstwy lipidowe, wcześniej rozprzestrzenione na granicy powietrze–woda dwóch roztworów wodnych, łączą się nad otworem po podniesieniu poziomu wody.

Przedstawiony tutaj protokół tworzenia membrany jest bardzo intuicyjny, jednak kilka krytycznych kroków ma silny wpływ na sukces eksperymentu. Aby zapewnić prawidłowe połączenie elektryczne między BLMchipMM a wzmacniaczem, niezbędne jest unikanie chlorowania końcówek drutów Ag/AgCl wkładanych do gniazd PCB. Podczas montażu BLMchipMM niewłaściwe rozmieszczenie drutów może doprowadzić do kontaktu z obudową wzmacniacza, co skutkuje zwarciami i nasyceniem sygnału. Innym krytycznym czynnikiem jest procedura wstępnego przygotowania otworu: nadmierna siła podczas nakładania roztworu do wstępnego przygotowania może uszkodzić przegrodę poliimidową, natomiast niewłaściwa obsługa roztworu elektrolitu – w szczególności namoczenie obszaru otworu – może utrudnić tworzenie membrany. Ponadto, dla zapewnienia powtarzalności niezbędne jest dokładne czyszczenie komory pomiarowej BLMchipMM. Zastosowanie 100% alkoholu izopropylowego, a następnie dokładne płukanie i całkowite osuszenie gwarantuje, że pozostałości nie będą zakłócać kolejnych eksperymentów.

Możliwe są liczne modyfikacje protokołu. Choć chlorowanie poprzez moczenie w wybielaczu stanowi praktyczne i powszechnie stosowane podejście, można również zastosować alternatywne metody, takie jak galwanizacja43. Podobnie możliwe są modyfikacje w zakresie wstępnego przygotowania i preparacji lipidów. Standardowe roztwory do wstępnego przygotowania zazwyczaj składają się z długołańcuchowych alkanów rozpuszczonych w lotnych rozpuszczalnikach węglowodorowych36; mimo że powszechnie stosuje się 1% roztwór heksadekanu w n-heksanie, odpowiednie mogą być również inne rozpuszczalniki. Skład lipidów można również dostosować w zależności od wymagań eksperymentalnych. Podczas gdy lipidy DPhPC zapewniają optymalną stabilność błony, można stosować alternatywne mieszaniny lipidów, w tym składniki naturalne lub syntetyczne36. Kluczową zaletą pionowych dwuwarstw lipidowych formowanych metodą składania jest możliwość tworzenia błon asymetrycznych, w których każda warstwa składa się z innych gatunków lipidów5,22, co jest cechą znaną z wpływania na funkcję białek błonowych.

Rozwiązywanie problemów z formowaniem się błony zazwyczaj polega na regulacji poziomów fazy wodnej. Jeśli błona nie utworzy się początkowo, wielokrotne obniżanie i podnoszenie poziomu buforu w jednej komorze może ułatwić montaż dwuwarstwy. W przypadku niepowodzenia, wprowadzenie pęcherzyka powietrza nad otworem może wspomóc redystrybucję lipidów i formowanie błony. Utrzymujące się problemy zazwyczaj wskazują na kwestie związane z przygotowaniem wstępnym lub zanieczyszczeniem, w takim przypadku zaleca się oczyszczenie komory pomiarowej i ponowne rozpoczęcie eksperymentu.

Podstawowe elementy tej konfiguracji obejmują kompaktowy wzmacniacz eNPR 100 kHz oraz BLMchipMM. Wzmacniacz jest kompaktowym, niskoszumowym systemem do zaciskania napięcia (voltage-clamp), który eliminuje potrzebę stosowania dodatkowych urządzeń zewnętrznych, w tym zewnętrznych klatek Faradaya, ponieważ obudowa wzmacniacza zapewnia skuteczne ekranowanie elektromagnetyczne. BLMchipMM to wstępnie zmontowana, zminiaturyzowana komora rejestracyjna zintegrowana z płytką PCB w celu bezpośredniego połączenia ze wzmacniaczem. Składa się ona z dwóch przedziałów w kształcie litery C, oddzielonych polimidową przegrodą z lejkowatym otworem wykonanym laserowo, w którym tworzona jest sztuczna membrana. Zredukowane wymiary systemu, z objętością przedziałów wynoszącą około 110 µL, znacząco zmniejszają zużycie odczynników i redukują pojemność wewnętrzną, co poprawia jakość sygnału. Ponadto urządzenie można wielokrotnie wykorzystywać bez konieczności demontażu, pod warunkiem przestrzegania odpowiednich procedur czyszczenia, co zmniejsza zmienność i zwiększa powtarzalność eksperymentów.

Mimo tych zalet należy wziąć pod uwagę pewne ograniczenia. Obecna konfiguracja nie zawiera zintegrowanych modułów kontroli temperatury, ciśnienia ani perfuzji. Wykazano, że wewnętrzne napięcie błony wpływa na kanały mechanosensytywne, takie jak TREK144,45,46; jednakże obecny układ nie obejmuje kontrolowanej manipulacji napięciem błony, w związku z czym nie wyciągnięto tutaj wniosków mechanistycznych. Ogólnie rzecz biorąc, platforma ta stanowi niezawodny i dostępny system do rejestracji aktywności kanałów jonowych w błonach sztucznych. W niniejszym badaniu zbadaliśmy syntetyczny kanał K2P ancTREK1, będący obliczeniowo zrekonstruowanym kanałem przodkiem podrodziny TREK. Dane z rejestracji wykazują, że oczyszczone białko ancTREK1 zrekonstytuowane w PLB wykazuje zachowanie pojedynczego kanału zgodne z raportowanymi właściwościami przewodnictwa typu TREK1. W symetrycznych warunkach 200 mM potasu, bez Mg2+, kanał wykazuje mierzalną zależność I–V, z wartościami amplitudy wynoszącymi około 13 pA przy 80 mV i −19 pA przy −80 mV. Dodatkowo ancTREK1 wykazuje charakterystyczny tryb wysokiego przewodnictwa obserwowany w kanałach TREK1, z wyższym przewodnictwem przy potencjałach ujemnych (~205,6 pS) w porównaniu do potencjałów dodatnich (~112,8 pS). Co istotne, ancTREK1 wykazuje zwiększone NPo przy potencjałach dodatnich (0,78 przy 80 mV) i zmniejszone NPo przy potencjałach ujemnych (0,53 przy −80 mV i 0,28 przy −120 mV), co różni się od obserwacji w konfiguracjach wyciętego patcha42. Wyniki te potwierdzają przydatność tego systemu do dowodowej rejestracji pojedynczych kanałów zrekonstytuowanych białek błonowych.

Oświadczenia

F.T. oraz A.P. są odpowiednio dyrektorem generalnym i pracownikiem firmy Elements S.r.l. Pozostali autorzy nie deklarują żadnych konfliktów interesów.

Podziękowania

Dziękujemy Sofii Diletta Guzzeloni za pomoc w procedurze transfekcji komórek. Jesteśmy wdzięczni pracownikom firmy Elements, dr Leonowi Juarezi i dr Michelangelo Paciemu. Praca ta była wspierana przez Departament Medycyny Molekularnej Uniwersytetu w Pawii we Włoszech w ramach inicjatywy Dipartimenti di Eccellenza (2023–2027), przez Fundację Cariplo (#2019-1809) oraz przez program badawczy PNRR CN00000013 „National Centre for HPC, Big Data and Quantum Computing” dla M.L.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
1,2-diphytanoyl-sn-glycero-3-phosphocholina (DPhPC)Avanti Polar Lipids850356PTworzenie sztucznych dwuwarstw lipidowych
2-Propanol (≥99,5%)Honeywell24137-5LCzyszczenie urządzenia BLMchipMM
AgarozaFisher BioReagentsBP160-500Przygotowanie żeli agarozowych
System poziomej elektroforezy w żelu agarozowymBTLabSystemsBT102Rozdział fragmentów DNA
AmpicylinaFisher BioReagentsBP1760-25Selekcja bakterii transformowanych
Żywica Sepharose z nanociałem przeciw-GFP (własna produkcja)——Oczyszczanie powinowactwa białek z etykietą GFP
Anza Alkaline PhosphataseInvitrogenIVGN2208Defosforylacja wektora
Anza EcoRIInvitrogenIVGN0116Trawienie restrykcyjne
Anza NotIInvitrogenIVGN0014Trawienie restrykcyjne
Anza Red Buffer (10×)InvitrogenIVGN2008Bufor do trawienia restrykcyjnego
Aprotynina (inhibitor proteaz)Fisher Scientific15996008Zapobieganie degradacji białek
Wirówka laboratoryjnaEppendorfEP5420000164Wirowanie komórek i przygotowanie próbek
BLMchipMMElements s.r.l.—Tworzenie płaskich dwuwarstw lipidowych
Hemisukcynian cholesterolu (CHS)AnatraceCH210Stabilizacja białek błonowych
Błękit Coomassie (Coomassie Brilliant Blue)Sigma-Aldrich1125530025Barwienie białek
Zwykły domowy wybielacz——Chlorowanie drutów Ag
DNaza ISigma-Aldrich11284932001Zmniejszenie lepkości lizatu
Woda dwukrotnie destylowana——Przygotowanie buforów i roztworów
Etanol (czysty, 99,9%)Girelli Alcool s.r.l.—Czyszczenie drutów Ag/AgCl
Bromek etydynySigma-Aldrich1116080030Barwienie DNA
Papier ścierny o bardzo drobnej ziarnistości——Usuwanie powłoki Ag/AgCl z drutów
Wzmacniacz eNPR 100 kHzElements s.r.l.—Rejestracje elektrofizjologiczne
Zestaw Gel-Out do ekstrakcji DNA z agarozyA&A Biotechnology023-250Oczyszczanie DNA
Marker wielkości DNA GeneRuler 1 kbThermo Fisher ScientificSM0311Referencja wielkości DNA
FreeStyle™ 293-FThermo Fisher ScientificR79007Ekspresja białka ancTREK1
HEPES (≥99,5%)Sigma-AldrichH3375-500G substancja buforująca
Heksadekan (≥99%)Sigma-AldrichH6703-100MLObróbka wstępna otworu
Heksan (≥99%)Sigma-Aldrich139386-100MLRozpuszczalnik lipidowy
Własny barwnik do ładowania DNA 5×——Przygotowanie próbek DNA
Własny bufor SDS Laemmli 6× (redukujący)——Przygotowanie próbek białek
Własny roztwór do odbarwiania——Odbarwianie żeli SDS-PAGE
Własna proteaza HRV-3C——Odcinanie białek fuzyjnych
Własny bufor do prowadzenia SDS-PAGE (10×)——Bufor do elektroforezy SDS-PAGE
ImidazolAlfa AesarA10221Elucja białek z etykietą His
Kolumny do oczyszczania in-batch——Procedury oczyszczania białek
Inkubator wytrząsowy Innova44New Brunswick InnovaM1282Wzrost kultur komórkowych
KClHoneywell31248-1KGPrzygotowanie elektrolitów i buforów
Pożywka LB (Lennox)Condalab1231Kultura bakteryjna
Leupeptyna (inhibitor proteaz)Thermo Scientific78435Zapobieganie degradacji białek
Chlorek magnezu sześciowodnyAcros Organics447700010Składnik buforu
Spektrofotometr NanodropDeNovixDS-11Ilościowe oznaczanie DNA i białek
n-Dodecyl-β-D-maltosyd (DDM)NeoBiotechNB-19-0056-25GSolubilizacja białek błonowych
Żywica Ni Sepharose High PerformanceCytiva17526801Oczyszczanie IMAC
Notebook (komputer)——Sterowanie instrumentami i akwizycja danych
Ultrawirówka Optima LE-80KBeckman365668Izolacja frakcji błonowej
Pentan (≥99%)Sigma-Aldrich236705-100MLRozpuszczalnik lipidowy
Pepstatyna A (inhibitor proteaz)Thermo Scientific78436Zapobieganie degradacji białek
Bufor Phusion GC (5×)Thermo Fisher ScientificF519Bufor do PCR
Polimeraza DNA Phusion High-FidelityThermo Fisher ScientificF530SAmplifikacja PCR
PMSF (inhibitor proteaz)Thermo Scientific36978Ochrona białek podczas lizy
Polyethylenimine (PEI)Clinisciences24765-100Odczynnik do transfekcji
Gotowy żel ProteinEle Tris-Glicyna (4–20%)TransGen BiotechDG101-01-V2Rozdział białek
System elektroforezy żelowej SDS-PAGEBio-Rad1658002FCElektroforeza białek
Maślan soduFisher ScientificA11079Wzmacniacz ekspresji białek
Ligaza T4 DNAThermo Fisher ScientificEL0011Ligacja DNA
Bufor do ligazy T4 DNA (10×)Thermo Fisher ScientificB69Bufor do ligacji
Termocykler (Mastercycler Nexus)Eppendorf6331000025Amplifikacja PCR
Tris (zasada)Sigma-AldrichT1503-1KGPrzygotowanie buforów
Agar sojowy Tryptone SOYA z lecytyną i polisorbatem 80HiMediaM449-5KGWysiew bakterii
Dwa druty AgElements s.r.l.—Elektrody do elektrofizjologii
Koncentrator Ultra-spin (cutoff 50 kDa)Merck AmiconUFC8050Koncentracja białek
Wektor ekspresyjny pEG BacMamAddgene160687Ekspresja białek
Kabel USB——Połączenie między wzmacniaczem a komputerem

Bibliografia

  1. Wickenden, A. D. Overview of electrophysiological techniques. Curr Protoc Pharmacol. 11 (1), (2000).
  2. Polak, A., Mulej, B., Kramar, P. System for measuring planar lipid bilayer properties. J Membr Biol. 245 (10), 625-632 (2012).
  3. Zakharian, E. Recording of ion channel activity in planar lipid bilayer experiments. Methods Mol Biol. 998, 109-118 (2013).
  4. Mueller, P., Rudin, D., Tien, H. T., Wescott, W. C. Reconstitution of cell membrane structure in vitro and its transformation into an excitable system. Nature. 194, 979-980 (1962).
  5. Montal, M., Mueller, P. Formation of bimolecular membranes from lipid monolayers and a study of their electrical properties. Proc Natl Acad Sci U S A. 69 (12), 3561-3566 (1972).
  6. Coronado, R., Latorre, R. Phospholipid bilayers made from monolayers on patch-clamp pipettes. Biophys J. 43 (2), 231-236 (1983).
  7. Andersen, O. S. Ion movement through gramicidin A channels. Single-channel measurements at very high potentials. Biophys J. 41 (2), 119-133 (1983).
  8. Tank, D. W., Miller, C., Webb, W. W. Isolated-patch recording from liposomes containing functionally reconstituted chloride channels from Torpedo electroplax. Proc Natl Acad Sci U S A. 79 (24), 7749-7753 (1982).
  9. Criado, M., Keller, B. U. A membrane fusion strategy for single-channel recordings of membranes usually non-accessible to patch-clamp pipette electrodes. FEBS Lett. 224 (1), 172-176 (1987).
  10. Varnier, A., et al. A simple method for the reconstitution of membrane proteins into giant unilamellar vesicles. J Membr Biol. 233, 85-92 (2010).
  11. Garten, M., et al. Reconstitution of a transmembrane protein, the voltage-gated ion channel KvAP, into giant unilamellar vesicles for microscopy and patch clamp studies. J Vis Exp. (95), e52281 (2015).
  12. Funakoshi, K., Suzuki, H., Takeuchi, S. Lipid bilayer formation by contacting monolayers in a microfluidic device for membrane protein analysis. Anal Chem. 78 (24), 8169-8174 (2006).
  13. Heron, A. J., Thompson, J. R., Mason, A. E., Wallace, M. I. Direct detection of membrane channels from gels using water-in-oil droplet bilayers. J Am Chem Soc. 129 (51), 16042-16047 (2007).
  14. Iwamoto, M., Oiki, S. Contact bubble bilayers with flush drainage. Sci Rep. 5, 9110 (2015).
  15. Han, X., et al. Nanopore arrays for stable and functional free-standing lipid bilayers. Adv Mater. 19 (24), 4466-4470 (2007).
  16. Miyata, R., et al. Parallel recordings of transmembrane hERG channel currents based on solvent-free lipid bilayer microarray. Micromachines. 12 (1), 98 (2021).
  17. Kresak, S., Hianik, T., Naumann, R. L. C. Giga-seal solvent-free bilayer lipid membranes: from single nanopores to nanopore arrays. Soft Matter. 5 (20), 4021 (2009).
  18. Suzuki, H., Pioufle, B. L., Takeuchi, S. Ninety-six-well planar lipid bilayer chip for ion channel recording fabricated by hybrid stereolithography. Biomed Microdevices. 11, 17-22 (2009).
  19. Zagnoni, M., Sandison, M. E., Morgan, H. Microfluidic array platform for simultaneous lipid bilayer membrane formation. Biosens Bioelectron. 24 (5), 1235-1240 (2009).
  20. Baker, C. A., Bright, L. K., Aspinwall, C. A. Photolithographic fabrication of microapertures with well-defined, three-dimensional geometries for suspended lipid membrane studies. Anal Chem. 85 (19), 9078-9086 (2013).
  21. Tadaki, D., et al. Mechanically stable solvent-free lipid bilayers in nano- and micro-tapered apertures for reconstitution of cell-free synthesized hERG channels. Sci Rep. 7 (1), 17736 (2017).
  22. Collins, M. D., Keller, S. L. Tuning lipid mixtures to induce or suppress domain formation across leaflets of unsupported asymmetric bilayers. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (1), 124-128 (2008).
  23. Cohen, S. N., Chang, A. C. Y., Boyer, H. W., Helling, R. B. Construction of biologically functional bacterial plasmids in vitro. Proc Natl Acad Sci U S A. 70 (11), 3240-3244 (1973).
  24. Hoseini, S., Sauer, M. G. Molecular cloning using polymerase chain reaction, an educational guide for cellular engineering. J Biol Eng. 9 (1), 2 (2015).
  25. Goehring, A., et al. Screening and large-scale expression of membrane proteins in mammalian cells for structural studies. Nat Protoc. 9 (11), 2574-2585 (2014).
  26. Kawate, T., Gouaux, E. Fluorescence-detection size-exclusion chromatography for precrystallization screening of integral membrane proteins. Structure. 14 (4), 673-681 (2006).
  27. Porath, J., Carlsson, J., Olsson, I., Belfrage, G. Metal chelate affinity chromatography, a new approach to protein fractionation. Nature. 258 (5536), 598-599 (1975).
  28. Hochuli, E., Dobeli, H., Schacher, A. New metal chelate adsorbent selective for proteins and peptides containing neighbouring histidine residues. J Chromatogr A. 411, 177-184 (1987).
  29. Hochuli, E., et al. Genetic approach to facilitate purification of recombinant proteins with a novel metal chelate adsorbent. Biotechnology (N Y). 6 (11), 1321-1325 (1988).
  30. Kirchhofer, A., et al. Modulation of protein properties in living cells using nanobodies. Nat Struct Mol Biol. 17 (1), 133-138 (2010).
  31. Kubala, M. H., Kovtun, O., Alexandrov, K., Collins, B. M. Structural and thermodynamic analysis of the GFP:GFP-nanobody complex. Protein Sci. 19 (12), 2389-2401 (2010).
  32. Lee, H., Lolicato, M., Arrigoni, C., Minor, D. L. Production of K2P2.1 (TREK-1) for structural studies. Methods Enzymol. 653, 151-188 (2021).
  33. Kramar, P., Miklavcic, D., Kotulska, M., Lebar, A. M. Voltage- and current-clamp methods for determination of planar lipid bilayer properties. Adv Planar Lipid Bilayers Liposomes. 11, 29-69 (2010).
  34. Golowasch, J., Nadim, F. Capacitance, membrane. Encyclopedia of Computational Neuroscience. , (2014).
  35. Niles, W. D., Levis, R. A., Cohen, F. S. Planar bilayer membranes made from phospholipid monolayers form by a thinning process. Biophys J. 53 (3), 327-335 (1988).
  36. Gutsmann, T., et al. Protein reconstitution into freestanding planar lipid membranes for electrophysiological characterization. Nat Protoc. 10 (1), 188-198 (2015).
  37. White, S. H. A study of lipid bilayer membrane stability using precise measurements of specific capacitance. Biophys J. 10 (12), 1127-1148 (1970).
  38. Bockenhauer, D., Zilberberg, N., Goldstein, S. A. N. KCNK2: reversible conversion of a hippocampal potassium leak into a voltage-dependent channel. Nat Neurosci. 4 (5), 486-491 (2001).
  39. Li, X. T., et al. The stretch-activated potassium channel TREK-1 in rat cardiac ventricular muscle. Cardiovasc Res. 69 (1), 86-97 (2006).
  40. Honoré, E., Maingret, F., Lazdunski, M., Patel, A. J. An intracellular proton sensor commands lipid- and mechano-gating of the K+ channel TREK-1. EMBO J. 21 (12), 2968-2976 (2002).
  41. Patel, A. J., et al. A mammalian two pore domain mechano-gated S-like K+ channel. EMBO J. 17 (15), 4283-4290 (1998).
  42. Maingret, F., Honore, E., Lazdunski, M., Patel, A. J. Molecular basis of the voltage-dependent gating of TREK-1, a mechano-sensitive K+ channel. Biochem Biophys Res Commun. 292 (2), 339-346 (2002).
  43. Lemtiri-Chlieh, F., Ali, R. Characterization of heterologously expressed transporter genes by patch- and voltage-clamp methods: application to cyclic nucleotide-dependent responses. Methods Mol Biol. 1016, 67-93 (2013).
  44. Opsahl, L. R., Webb, W. W. Lipid-glass adhesion in giga-sealed patch-clamped membranes. Biophys J. 66 (1), 75-79 (1994).
  45. Perez-Mitta, G., MacKinnon, R. Freestanding lipid bilayer tensiometer for the study of mechanosensitive ion channels. Proc Natl Acad Sci U S A. 120 (12), e2221541120 (2023).
  46. Sorum, B., et al. Tension activation of mechanosensitive two-pore domain K+ channels TRAAK, TREK-1, and TREK-2. Nat Commun. 15 (1), 3142 (2024).

Przedruki i uprawnienia

Przeglądaj więcej artykułów

System Montala-Muellerarekonstytucja kanałów jonowychplatforma dwuwarstwowarejestracja pojedynczych kanałówbłony sztucznezależność prąd-napięcieaktywność kanałów

Ten artykuł został opublikowany

Film wkrótce dostępny

Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.