Ten eksperymentalny protokół zapewnia stabilną, opłacalną i efektywną metodę, łączącą knockdown lncRNA z testami tworzącymi kolonie, aby ilościowo określić wpływ lncRNA na proliferację komórek kostniaraka.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Test formowania kolonii wykrywający zdolność proliferacji komórek osteosaraka LncRNA-knockdown
* These authors contributed equally
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Nieprawidłowa ekspresja długich, niekodujących RNA (lncRNA) głęboko wpływa na proliferację komórek kostniaraka, sugerując, że mogą one służyć jako potencjalne cele terapeutyczne. Jednak badania funkcjonalne lncRNA pozostają w dużej mierze teoretyczne i ograniczone do kilku weryfikacji. Testy formowania kolonii, które konkretnie odzwierciedlają ostateczny los proliferacyjny pojedynczych komórek, są uznawane za złoty standard oceny długoterminowego potencjału proliferacyjnego. Tutaj protokół ten ustanowił wiarygodny protokół eksperymentalny wykorzystujący testy formowania kolonii w komórkach knockdown lncRNA, aby ocenić wpływ lncRNA na zdolność proliferacji komórek osteosarcoma. Ten protokół eksperymentalny zapewnia stabilny, opłacalny i wydajny test oceniający regulacyjne wpływy lncRNA na proliferację komórek osteosarcoma. To podejście jest nie tylko odpowiednie do badań nad komórkami osteosarcoma, ale także stanowi wykonalne narzędzie dla regulowanej przez lncRNA zdolności proliferacyjnej komórek w innych guzach. Badanie to obejmowało szczegółowy protokół detekcji testów knockdownu lncRNA i tworzenia kolonii, z przykładem knockdownu małego nukleolowego RNA genu gospodarza 6 (SNHG6) w komórkach osteoarcoma (143B). Wyniki eksperymentalne potwierdziły efektywne tłumienie ekspresji SNHG6, któremu towarzyszyło wyraźne zmniejszenie zarówno liczby, jak i wielkości kolonii. Wyniki te sugerują, że SNHG6 jest niezbędny do utrzymania długoterminowego potencjału proliferacyjnego komórek kostniaraka (143B).
Wprowadzenie
Długie niekodujące RNA (lncRNA), definiowane jako transkrypcje dłuższe niż 200 nukleotydów bez potencjału kodującego białka, w ostatnich latach stały się ważnymi regulatorami różnorodnych procesów biologicznych 1,2. Odgrywają one kluczową rolę w inicjowaniu i rozwoju różnych nowotworów, w tym osteosarcoma, raka prostaty oraz raka płuc 3,4,5. W przypadku osteosarcoma narastające dowody sugerują, że nieprawidłowa ekspresja długiego, niekodującego RNA (lncRNA) ma głęboki wpływ na proliferację komórek. Na przykład wyciszanie lncRNA POU3F3 znacząco hamowało proliferację i promowało apoptozę komórek osteosarcoma (MG63 i U2OS)6. Podobnie, wybicie lncRNA HOXA-AS3 zmniejszało tworzenie kolonii i hamowało wzrost komórek U2OS i SW13537. Biorąc pod uwagę, że niekontrolowana proliferacja jest cechą rozpoznawczą biologii nowotworów i głównym czynnikiem determinującym strategie terapeutyczne, wyjaśnienie proliferacji komórek regulowanej przez lncRNA w guzach, szczególnie w osteosarcomacie, pozostaje niezwykle ważne i konieczne.
Chociaż istnieje kilka metod oceny proliferacji komórek, każde z nich niesie ze sobą swoje wewnętrzne ograniczenia. Testy kolorymetryczne lub metaboliczne, takie jak CCK-8 i MTT, są wygodne, szybkie i mają wysoką przepustowość. Jednak przede wszystkim dostarczają krótkoterminowe odczyty i łatwo ulegają zakłóceniom fluktuacji metabolicznych, a także niosą dodatkowe ryzyko interferencji optycznej lub fotochemicznej ze strony używanych odczynników8. Metody oparte na syntezie DNA, w tym inkorporacja BrdU i EdU, oferują większą swoistość przy jednoczesnym ograniczeniu do analiz migawkowych wejścia fazy S bez uwzględniania długoterminowych rezultatów proliferacyjnych 9,10. Podobnie, immunobarwienie markerów proliferacji, takich jak Ki-67, wskazuje jedynie na natychmiastową aktywność cyklu komórkowego i nie przewiduje zdolności klonogenicznej10. Systemy monitoringu w czasie rzeczywistym, takie jak RTCA, umożliwiają ciągłą analizę krzywej wzrostu o wysokiej powtarzalności, jednak ich wysoki koszt i ograniczenie do oceny krótko- lub średnioterminowej zmniejszają ich praktyczność11. Dla porównania, test klonogeniczny unikalnie rejestruje zdolność pojedynczej komórki do nieograniczonej proliferacji i tworzenia widocznych kolonii, co bezpośrednio odzwierciedla jej ostateczny los. Pomimo że test klonogeniczny jest pracochłonny i czasochłonny, pozostaje złotym standardem oceny długoterminowego potencjału proliferacyjnego, oferując wnioski nieosiągalne za pomocą krótkoterminowych lub zastępczych testów12.
Tutaj artykuł zawiera szczegółowy protokół wykrywania testów knockdownu lncRNA i tworzenia kolonii, z przykładem knockdownu SNHG6 w komórkach osteosarcoma 143B. To podejście ma zastosowanie nie tylko w badaniach nad osteosakrcomem, ale także stanowi wykonalne narzędzie do badania proliferacji podleganej lncRNA w innych guzach.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Odczynniki i używany sprzęt są wymienione w Tabeli Materiałów.
1. Transfekcja plazmidów
- Nasiona 5 × 105 komórek 143B na naczynie hodowlane o pojemności 10 cm (łącznie dwie naczynia), hodować komórki w kompletnym medium (DMEM + 10% FBS) w temperaturze 37 °C w inkubatorze 5%CO2 .
- Przygotować odczynniki transfekcyjne 24 godziny później, w tym plazmidy (shNC i shSNHG6), PEI oraz Opti-MEM.
UWAGA: Wykonaj wir i upewnij się, że wszystkie są wyrównane do temperatury pokojowej przed użyciem. - Wyjmij cztery mikrowirówki o pojemności 1,5 mL, oznaczyj plazmidy (shNC i shSNHG6) oraz PEI (dwie probówki) za pomocą markera.
- Dodaj 500 μL Opti-MEM do każdej rurki.
- Do probówki plazmidowej należy dodać 10 μg plazmidów (shNC lub shSNHG6) oraz 30 μL PEI (1μg/μL) do każdej probówki PEI.
- Delikatnie mieszaj w górę i w dół, inkubuj w temperaturze pokojowej przez 5 minut.
- Połącz probówkę plazmidową z rurką PEI, delikatnie wymieszaj i inkubuj mieszankę w temperaturze pokojowej przez 20 minut.
- Wyjmij 143 komórki B z inkubatora i delikatnie aspiruj pożywkę hodowlą. Dodaj 7 ml medium bez surowicy do każdego dania. Oznaczaj naczynia tak, aby wskazać plazmidy do dodania (143B shNC lub 143B shSNHG6).
- Dodaj przygotowaną mieszankę transfekcyjną kropelo do odpowiedniego naczynia kulturowego.
UWAGA: Dodaj mieszankę powoli, używając pipety w ruchach okrężnych, i równomiernie rozmieszczaj ją od zewnętrznej krawędzi w kierunku środka naczynia. Inkubować w temperaturze 37 °C w inkubatorze z 5%CO2. - Usuń supernatant po 8-12 godzinach i dodaj 10 mL kompletnego medium DMEM do każdej misy hodowli o średnicy 10 cm. Inkubuj komórki w temperaturze 37 °C w inkubatorze 5%CO2 .
- Obserwuj pod mikroskopem fluorescencyjnym 72 godziny po odrzuceniu supernatantu i zastąpieniu go pełnym nośnikiem DMEM.
2. Test formowania kolonii
- Usuń podłoże z 10 cm naczynia hodowlanego (shNC i shSNHG6), dodaj 1,5 mL trypsyny-EDTA do trawienia komórek, delikatnie pipetuj je w celu ich odłączenia, a następnie dodaj 5 ml kompletnego nośnika, aby zakończyć trawienie.
- Przełóż zawiesinę ogniwa do rurki mikrowirówki o pojemności 15 mL.
- Usuń 20 μL zawiesiny komórkowej i policz liczby komórek.
UWAGA: Liczenie komórek musi być wykonywane wielokrotnie, aby upewnić się, że liczby komórek w grupie shNC i shSNHG6 są spójne. Tutaj zbieramy 3 × 105 komórek do weryfikacji wydajności knockdownu SNHG6 RT-PCR. - Nasiono 2 × 103 komórek na odwiert w płytkach z 6 dołkami. Dodaj kompletne medium DMEM do końcowej objętości 2 mL i hoduj komórki w temperaturze 37 °C w inkubatorze 5%CO2 .
UWAGA: Wymień medium na świeże, kompletne medium DMEM co drugi dzień. - Codziennie monitoruj formowanie się kolonii.
UWAGA: Zakończ hodowlę, gdy większość kolonii w grupie kontrolnej (shNC) zawiera ≥50 komórek lub po 10-14 dniach inkubacji, w zależności od tego, co nastąpi wcześniej. - Wyjmij komórki z inkubatora i wyrzuć supernatant.
- Płucz komórki dwukrotnie po 1 mL PBS na dołek i wyrzucaj PBS po każdym przemyciu.
- Utraż komórki 1 ml roztworu 10% formaliny przez 15 minut, a następnie wyrzuć 10% roztwór formaliny.
- Płucz komórki dwukrotnie po 1 mL PBS na dołek i wyrzucaj PBS po każdym przemyciu.
- Barw komórki 1 mL roztworu barwiącego fioletowy o stężeniu 0,5% przez 10-30 minut, a następnie wyrzuć ten roztwór.
- Delikatnie myj komórki powoli płynącą wodą z kranu.
- Ogniwa suszą na powietrzu w temperaturze pokojowej.
- Rejestruj zdjęcia aparatem.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Aby ocenić wpływ lncRNA SNHG6 na zdolność proliferacji komórek osteosarcoma, z powodzeniem ustanowiliśmy system knockdown pośredniczony plazmidami i przeprowadziliśmy testy formowania kolonii. Eksperymentalny workflow obejmował transfekcję plazmidów 143B komórek oraz test formowania kolonii (Rysunek 1).
Skuteczność transfekcji 143B komórek została potwierdzona mikroskopią fluorescencyjną 72 godziny po transfekcji (Rysunek 2). Wyniki w...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Terapeutyczne celowanie w lncRNA związane z rakiem, oprócz wykorzystania ich funkcji diagnostycznych jako biomarkerów, stanowi nowe podejście w leczeniu nowotworów. Określenie roli lncRNA w patogenezie osteosarcoma jest kluczowe dla przyspieszenia diagnozy, terapii i rokowania.
Aby zapewnić sukces tego testu, należy podjąć kluczowe kroki. Po pierwsze, ustanowienie zawiesiny pojedynczej komórki jest absolutnym warunkiem koniecznym wiarygodnych testów klonalnych, ponieważ obecność agregatów komó...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają nic do ujawnienia.
Podziękowania
Prace te były wspierane grantami od National Nature Science Foundation (82174408, 82374477, 82474535 i 82205145).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| 1,5 mL MIKRORUREK | Merck | AXYMCT150C | |
| 10% neutralna formalina buforowana | VICTREX | 5205000 | |
| 100 - 1000 μ L Rozszerzone Niebieskie Końcówki Stopniowane | Shanghai BioScience Co., Ltd | BS10401ML | |
| Laboratorium 100mm Cell Culture Dishes | Wuxi NEST Biotechnology Co.,Ltd | 704001 | |
| 143B | ATCC | ATCC CRL-8303TM | |
| Rurka wirówki 15 mL | Shanghai BioScience Co., Ltd | BL2002150 | |
| Płytka hodowla komórek 6 dołków | Wuxi NEST Biotechnology Co.,Ltd | 703001 | |
| Inkubator CO2 | Thermo Fisher Technology (China)Co., Ltd. | 300583057 | |
| Crystal Violet | TCI Szanghaj | C0428 | |
| Medium DMEM | KORPORACJA WISENT | 319-005-CL | |
| Eppendorf Research plus | Eppendorf | 3123000233 | |
| FBS – Doskonała jakość | KORPORACJA WISENT | 086-150 | |
| Mark Pen | Zebra Trading (Shenzhen) Co., Ltd. | YYST5 | |
| Opti-MEM | Gibco | 31985070 | |
| PIPETA PASTERA | Labgic | BS-XG-O3L | |
| Bufor PBS (suchy proszek) | Labgic | BL601A | |
| PEI | Nauki polinaukowe | 24765 | |
| Końcówki pipety | Merck | AXYT200Y | |
| Enzym ekspresowy trypLE | Gibco | 12604021 | |
| Trypsyna/EDTA | Gibco | R001100 |
Bibliografia
- Chen, N., et al. IAV inhibits the host antiviral defense mediated by LncRNA-LRIR to enhance viral replication. Int J Biol Macromol. 322 (Pt 1), 146665(2025).
- Zhu, J., Mo, Y. Y., Peng, W. X. RNA binding protein-mediated competing endogenous RNA mechanism in cancer. Gene. 963, 149606(2025).
- Zhang, Y., et al. KIAA1429-mediated ZFPM2-AS1 m(6)A modification promotes the proliferation, migration and invasion of osteosarcoma cells. Oncol Lett. 30 (4), 453(2025).
- Oh, M., Kadam, R. N., Charania, Z. S., Somarowthu, S. LncRNA SChLAP1 promotes cancer cell proliferation and invasion via its distinct structural domains and conserved regions. J Mol Biol. 437 (19), 169350(2025).
- Wang, G., et al. TBX5-AS1 induces ER stress and suppresses lung cancer growth and tumor stemness via the miR-494-3p/ATF6 axis. Cell Stress Chaperones. 30 (6), 100113(2025).
- Xu, S., et al. lncRNA POU3F3 promotes osteosarcoma progression through GPX4-modulated ferroptosis by interaction with IGF2BP2 to facilitate NRF2 mRNA stability. Genes Dis. 12 (5), 101439(2025).
- Li, R., et al. LncRNA HOXA-AS3 promotes cell proliferation and invasion via targeting miR-218-5p/FOXP1 axis in osteosarcoma. Sci Rep. 14 (1), 16581(2024).
- Ghasemi, M., Turnbull, T., Sebastian, S., Kempson, I. The MTT assay: Utility, Limitations, pitfalls, and interpretation in bulk and single-cell analysis. Int J Mol Sci. 22 (23), (2021).
- Harris, L., Zalucki, O., Piper, M. BrdU/EdU dual labeling to determine the cell-cycle dynamics of defined cellular subpopulations. J Mol Histol. 49 (3), 229-234 (2018).
- Romar, G. A., Kupper, T. S., Divito, S. J. Research techniques made simple: Techniques to assess cell proliferation. J Invest Dermatol. 136 (1), e1-e7 (2016).
- Stefanowicz-Hajduk, J., Ochocka, J. R. Real-time cell analysis system in cytotoxicity applications: Usefulness and comparison with tetrazolium salt assays. Toxicol Rep. 7, 335-344 (2020).
- Franken, N. A., Rodermond, H. M., Stap, J., Haveman, J., van Bree, C. Clonogenic assay of cells in vitro. Nat Protoc. 1 (5), 2315-2319 (2006).
- Brix, N., Samaga, D., Belka, C., Zitzelsberger, H., Lauber, K. Analysis of clonogenic growth in vitro. Nat Protoc. 16 (11), 4963-4991 (2021).
- Rajendran, V., Jain, M. V. In vitro tumorigenic assay: Colony forming assay for cancer stem cells. Methods Mol Biol. 1692, 89-95 (2018).
- Guzman, C., Bagga, M., Kaur, A., Westermarck, J., Abankwa, D. ColonyArea: An ImageJ plugin to automatically quantify colony formation in clonogenic assays. PLoS One. 9 (3), e92444(2014).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
