Artykuł metodologiczny

Ocena wpływu elektroakupunktury na przepływ krwi mózgowej u myszy APP/PS1 za pomocą techniki laserowego plamkowania

DOI:

10.3791/69915

⸱

13 lutego 2026

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1School of Acupuncture, Moxibustion and Tuina, Beijing University of Chinese Medicine, 2Guang’anmen Hospital, China Academy of Chinese Medical Sciences

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przedstawiamy protokół skoncentrowany na laserowym obrazowaniu z kontrastem plamkowym do ilościowego pomiaru przepływu krwi w mózgu, połączony z Morris Water Maze, do oceny efektów elektroakupunktury u myszy APP/PS1 (model AD), co jest cenne dla badań nad AD.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Choroba Alzheimera (AD) charakteryzuje się postępującym pogorszeniem funkcji poznawczych i dysfunkcją naczyniowo-mózgową, w tym zmniejszonym przepływem krwi mózgowej (CBF) oraz zaburzeniami jednostek neuronaczyniowych. Elektroakupunktura (EA) wykazała potencjał w poprawie funkcji neurologicznych, jej mechanizm może być związany z regulacją CBF. Laserowe obrazowanie plamkowe to metoda szerokopolowa do oceny CBF w czasie rzeczywistym, która może precyzyjnie oceniać zmiany w perfuzji krwi mózgowej. W tym eksperymencie obserwowaliśmy wpływ elektroakupunktury na CBF i zdolności poznawcze u myszy modelowych z AD (myszy transgeniczne APP/PS1). Przekręcenie krwi środkowej tętnicy mózgowej i jej naczyń odgałęzionych u myszy zostało zaobserwowane za pomocą obrazowania laserowego za pomocą plam. Ocena funkcji poznawczych myszy przestrzennych została oceniona za pomocą labiryntu wodnego Morrisa. Wyniki wykazały, że EA może poprawić funkcje poznawcze myszy APP/PS1, a opóźnienie ucieczki zostało istotnie zmniejszone w teście Morris Water Mase (P<0.05). Ponadto laserowe obrazowanie z kontrastem plamkowym (LSCI) potwierdziło istotną hipoperfuzję mózgu u myszy modelowych z AD w porównaniu do kontrolnych typu dzikiego (P < 0,05), a co istotne, leczenie EA wywołało statystycznie istotny wzrost CBF (P < 0,05), odwracając hipoperfuzję mózgu u myszy z AD. Laserowe obrazowanie plamkowe to technika wizualizacji służąca do oceny poprawy mózgu wywołanej przez EA. Te odkrycia wspierają EA jako potencjalną terapię uzupełniającą AD, ukierunkowaną na zaburzenia mózgu naczyniowego.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Choroba Alzheimera (AD) to postępująca choroba neurodegeneracyjna, charakteryzująca się postępującym zaburzeniem poznawczym i pogorszeniem pamięci. Przetwarza cechy patologiczne polegające na odkładaniu się zewnętrznych blaszek beta-amyloidowych (Aβ), wewnątrzkomórkowego splątania nerwowego (NFT) oraz utracie neuronów1. Chociaż te klasyczne cechy były głównym celem badań terapeutycznych, rosnące dowody podkreślają kluczową rolę zmniejszonego przepływu krwi mózgowej (CBF) w patogenezie i postępie AD2. Redukcja CBF występuje we wczesnym stadium wystąpienia AD i wiąże się z nasileniem zaburzeń funkcji poznawczych3. Dlatego strategia leczenia poprawy uszkodzeń naczynia mózgowego jest skutecznym sposobem na złagodzenie objawów AD i poprawę przebiegu choroby.

Elektroakupunktura (EA), nowoczesna technika integrująca tradycyjną akupunkturę ze stymulacją elektryczną, wykazała potencjał w poprawie funkcji poznawczych w chorobach Alzheimerowca. Badania sugerują, że EA może wywierać korzystne efekty poprzez wiele mechanizmów, takich jak redukcja depozycji Aβ, łagodzenie neurozapalenia oraz promowanie plastyczności synaptycznej4. Warto zauważyć, że coraz częściej spekuluje się, że działanie neuroprotekcyjne EA może być ściśle powiązane z jego zdolnością do modulowania CBF5. Jednak bezpośrednie, w czasie rzeczywistym dowody pokazujące wpływ EA na hemodynamikę mózgu w modelach AD pozostają ograniczone. Brak takich dowodów utrudnia kompleksowe zrozumienie, jak EA poprawia funkcjonowanie mózgu.

Postęp technologiczny w obrazowaniu optycznym dostarczył potężnych narzędzi do badania hemodynamiki mózgu. Jako szybka, szerokokątna technika optyczna, LSCI zapewnia wysoką rozdzielczość przestrzenno-czasową do wizualizacji map przepływu krwi tkanek zintegrowanych z objętością6, umożliwiając monitorowanie w czasie rzeczywistym dynamiki perfuzji wywołanej elektroakupunkturou. Chociaż ekspozycja czaszki jest wymagana dla optymalnego dostępu optycznego, LSCI unika penetracji inwazyjnej tkanki. LSCI zostało wprowadzone w latach 90. i jest szeroko stosowane w neurobiologii w ostatnich dekadach7. Jak wszystkie techniki obrazowania, LSCI ma wrodzone ograniczenia: głębokość optycznego przenikania jest ograniczona, faworyzując powierzchowne naczynia korowe, a jednocześnie ograniczając dostęp do głębokich obszarów mózgu (np. hipokamp, zwój podstawy), a także ilościowo określa względny przepływ krwi (jednostki perfuzji) zamiast bezwzględnych wartości CBF, z dokładnością subtelnie zależną od morfologii naczyniowej i rozpraszania optycznego tkanek 8,9. Jednak te ograniczenia nie podważają użyteczności LSCI, lecz definiują jego specjalistyczne zastosowanie w ocenie powierzchownego przepływu krwi w czasie rzeczywistym. W naszym badaniu skupiającym się na zmianach perfuzji kory wywołanej przez EA, LSCI dostarcza wiarygodnych, praktycznych danych. Konkretnie ustanowiliśmy standaryzowany protokół LSCI z ukierunkowanym wyznaczaniem ROI oraz zoptymalizowanymi parametrami do ilościowego określenia CBF u myszy APP/PS1, uzupełniony testami Morris Water Maze łączącymi poprawę mózgu z wynikami poznawczymi.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protokół ten został zatwierdzony przez Komitet Etyki Zwierząt Uniwersytetu Medycyny Chińskiej w Pekinie (BUCM20250708-005) i był zgodny ze wszystkimi wytycznymi dotyczącymi opieki i wykorzystania zwierząt laboratoryjnych w Chinach.

1. Przygotowanie

  1. W eksperymencie użyto dwunastu 6-miesięcznych męskich myszy APP/PS1 oraz sześciu 6-miesięcznych samców C57bl/6.
  2. Wszystkie myszy były przechowywane w Centrum Eksperymentów na Zwierzętach Uniwersytetu Medycyny Chińskiej w Pekinie, po trzy myszy w klatce. Mieli swobodny dostęp do sterylnej wody pitnej i standardowej diety na pelety.
  3. Środowisko obudowy utrzymywano w cyklu światła/ciemności co 12 godzin, z temperaturą otoczenia kontrolowaną na poziomie 23 ± 2 °C.

2. Grupowanie zwierząt i interwencje

  1. Losowo przydziel dwunastu 6-miesięcznych samców myszy APP/PS1 (waga 27,88 g ± 0,48 g) do dwóch grup eksperymentalnych (n = 6/grupa): grupy modelowej choroby Alzheimera (AD) oraz grupy leczonej elektroakupunkturą (EA).
  2. Użyj sześciu 6-miesięcznych samców myszy C57BL/6 (waga 29,90 g ± 0,81 g) jako grupy typu dzikiego (WT).
  3. W grupach kontrolnych i modelowych z WT delikatnie unieruchom myszy w dobrze wentylowanych zabezpieczeniach i nie stosuj eksperymentalnych interwencji.
  4. W grupie leczonej EA delikatnie unieruchom myszy w tym samym zabezpieczeniu, co w grupach modelowych kontroli WT i AD, co ogranicza nadmierne ruchy, zapewniając jednocześnie niezakłócony oddech. W tym ustandaryzowanym warunku unieruchomienia należy włożyć jednorazowe igły do sterylnej akupunktury (0,25 mm × 13 mm) w punkty punktowe Baihui (GV20) i Yintang (GV29) (Rysunek 1A) na głowie, skierowane w okolice nosa, z stałą głębokością 2-3 mm. Podłącz dodatni i ujemny biegun urządzenia EA odpowiednio do tych dwóch punktów akupunktowych i zapewnij stymulację przez 15 minut (rysunek 1B). Parametry stymulacji konfiguruj jako wzór fal o gęstości dyspersyjnej, o intensywności 0,1 mA i częstotliwości 2 Hz.
  5. Przeprowadzaj interwencje każdej grupy co 48 godzin, każda sesja trwająca 15 minut, łącznie 30 dni.
    UWAGA: Wykonaj dobór, lokalizację i zabiegi igły punktu akupunktowego zgodnie z T/CAAM 0002-2020: Nazwy i lokalizacje najczęściej używanych punktów akupunkturowych dla zwierząt laboratoryjnych Część 3: Myszy10, norma wydana przez Chińskie Stowarzyszenie Akupunktury i Moksibustji w dniu 15 maja 2020 roku.

3. Test MWM

UWAGA: 24 godziny po 30-dniowym okresie interwencji poddano wszystkie myszy z trzech grup eksperymentalnych testowi Morris Water Maze (MWM), który obejmował zarówno próbę ukrytej platformy (nawigacji miejscowej), jak i próbę sondy11,12. Wprowadź jednodniowy okres aklimatyzacji przed formalnymi testami, aby zminimalizować stres i pozwolić myszom przyzwyczaić się do pomieszczenia eksperymentalnego, aparatury MWM i procedur obsługi.

  1. Procedury przygotowawcze
    1. Umieść aparat MWM oraz powiązany z nim system akwizycji/przetwarzania sygnałów w pomieszczeniu eksperymentalnym z tłumieniem dźwięku. Utrzymuj temperaturę otoczenia w środowisku testowym na poziomie około 25 °C i standaryzuje warunki oświetlenia w następujący sposób: zamontuj cztery lampy LED o mocy 60W nad czterema ćwiartkami labiryntu na wysokości wystarczającej do uniknięcia przez kamerę sufitową. Nieprzezroczyste zasłony otaczały cały obszar testowy, blokując zewnętrzne zakłócenia środowiskowe i zapobiegając niezamierzonym sygnałom przestrzennym wpływającym na nawigację myszy.
    2. Umieść okrągły biały zbiornik (90 cm średnicy × 50 cm wysokości) w centrum układu MWM. Podłącz kamerę wideo montowaną na suficie do zautomatyzowanego systemu śledzenia i rejestratora, aby zapewnić ciągłe zbieranie danych podczas testów.
    3. Podziel zbiornik na cztery równe obszary, oznaczone jako północ (N), południe (S), wschód (E) i zachód (W), a następnie podziel się na cztery zgodne ćwiartki: północny wschód (NE), północny zachód (NW), południowy zachód (SW) i południowy wschód (SE).
    4. Przymocuj wyraźnie ukształtowane kształty wizualne (kwadrat, trójkąt i koło) do zewnętrznej ściany każdego kwadrantu, umieszczone w linii widzenia myszy, aby służyć jako punkty odniesienia przestrzenne.
    5. Napełnić zbiornik 30 cm wodą utrzymywaną w temperaturze 24 ± 1 °C za pomocą elektrycznego grzejnika; Dodaj biały jadalny pigment, aby woda stała się kryjąca.
  2. Ukryta platforma próbna
    1. Na czas trwania tego testu zamontuj zanurzoną platformę w kwadrancie południowo-wschodnim.
    2. Losowo wypuszczaj każdą mysz do basenu z trzech alternatywnych ćwiartków (NE, NW, SW), z początkową orientacją skierowaną do ściany akwarium dla spójności.
    3. Pozwól każdej myszy maksymalnie 60 sekund na samodzielne zlokalizowanie ukrytej platformy.
    4. Rejestruj opóźnienie ucieczki (czas od wydania do wejścia na platformę) dla każdego testu w celu oceny uczenia się przestrzennego.
      UWAGA: Każda mysz przeprowadzała trzy próby dziennie przez pięć kolejnych dni. Jeśli mysz nie znalazła platformy w ciągu 60 sekund, delikatnie ją prowadzono na platformę i pozwalano jej pozostać tam przez 10 sekund, aby wzmocnić pamięć przestrzenną przed zakończeniem próby.
  3. Proces Badawczy
    1. Usuń platformę.
    2. Wypuść każdą mysz raz do basenu zwróconego w stronę ściany akwarium i pozwól na 60 sekund swobodnego pływania.
    3. Zapisz kluczowe miary wyników: średnią prędkość pływania oraz liczbę przejść przez dawną lokalizację peronu.
  4. Opieka po badaniu
    1. Po każdej sesji MWM dokładnie osusz myszy miękkimi ręcznikami i delikatnie je podgrzej za pomocą elektrycznego grzejnika, aby zapobiec hipotermii.

4. Laserowe obrazowanie z kontrastem plamkowym

  1. Losowo wybierz trzy myszy z każdej grupy i monitoruj ich CBF w czasie rzeczywistym oraz w pełnym terenie, korzystając z systemu LSCI.
  2. Przygotowanie zwierząt: Wszystkie operacje ze zwierzętami wykonuj pod narkozą. Znieczulaj myszy podając 1,25% tribrometanolu (0,02 mL/g) dootrzewnowkowo, aby zapewnić ciągłe spontaniczne oddychanie, i umieszczaj je na poziomej płycie operacyjnej. Umieść znieczulone myszy na termostatycznie sterowanej termostatycznej poduszce grzewczej utrzymywanej w temperaturze 37 °C, aby ustabilizować temperaturę ciała rdzenia. Ogol skórę głowy i ostrożnie rozciąń mięśnie/opopówki, aby odsłonić czaszkę; Utrzymuj odsłoniętą powierzchnię czaszki wilgotną z 0,9% sterylnej soli fizjologicznej przez cały zabieg, aby zapobiec wysychaniu.
  3. Ustawienie obrazowania: Ustawij głowicę skanującą systemu prostopadle do odsłoniętego okna czaszki w stałej odległości 20 cm. Włącz funkcje autofokusu i auto-gain, aby zoptymalizować klarowność i kontrast obrazu, a wartości wzmocnienia automatycznie utrzymywane w zakresie 140-160 we wszystkich eksperymentach. Konfiguruj dodatkowe standaryzowane parametry obrazowania w następujący sposób: czas naświetlania = 20 ms, stała czasowa = 1,0 s, tryb pracy = temporalny, filtr = 250 klatek, interwał próbki = 5000 ms, rozdzielczość obrazu = 1032 × 772.
  4. Pozyskiwanie danych: Pobieranie ciągłych obrazów plamkowych z częstotliwością próbkowania 25 Hz i synchronizacja zbierania z wcześniej skonfigurowanymi parametrami czasowymi i filtrem.
  5. Analiza ROI: Użyj oprogramowania do analizy do określenia obszarów zainteresowania (ROI) nad korą przedczołową, szczególnie celując w przednie i środkowe terytoria tętnic mózgowych w obrębie tej kory. Określ ROI dla tych obszarów naczyniowych i wyodrębnij średnie wartości strumienia (wyrażone w jednostkach perfuzji) z każdego ROI do późniejszych porównań statystycznych.

5. Analiza statystyczna

  1. Wykonaj analizy statystyczne z wykorzystaniem SPSS 27.0.
  2. Analizuj różnice grupowe w ukrytej platformie, wynikach prób probacyjnych oraz CBF za pomocą testu Student's t. Zdefiniuj istotność statystyczną jako P < 0,05 i ustaw wysoką istotność statystyczną na P < 0,01.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wpływ EA na uczenie się przestrzenne i pamięć u myszy modelowych AD

Wyniki testu morris water maze pokazano na Rysunku 2. Rysunek 2A pokazuje opóźnienie ucieczki podczas testu ukrytej platformy przez pięć dni. Latencja ucieczki grupy z AD wykazywała wahania, podczas gdy grupy WT i EA systematycznie maleły. Opóźnienie ucieczki grupy AD było znacznie dłuższe niż grupy WT od 4 do 5. dnia (P < 0,01). Grupa EA miała znaczn...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Niniejsze badanie pokazuje, że długoterminowa interwencja EA w Baihui (GV20) i Yintang (GV29) znacząco łagodzi deficyty przestrzennego uczenia się u transgenicznych myszy APP/PS1, co odzwierciedla skrócona latencja ucieczki w teście platformy Morris Water Maze. To odkrycie jest zgodne z wcześniejszymi doniesieniami, że EA poprawia funkcje poznawcze w różnych modelach AD poprzez mechanizmy takie jak zmniejszone odkładanie Aβ i osłabione neurozapalenie13. Co istotne, selekcja punktu akupunktowego op...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Badania te były wspierane przez Projekt Naukowo-Badawczy Uprawy Szkoły Akupunktury-Moksyzbustji oraz Tuina na Uniwersytecie Medycyny Chińskiej w Pekinie.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Igła akupunkturowa(Beijing Zhongyan Taihe Medicine Company, Ltd., Chiny0,25 mm & razy; 13 mmIgła akupunkturowa
System obrazowania laserowego z kontrastem plamkowymGene& I Scientific. Ltd.MoorFLPI-2
Ogranicznik myszyCentrum Sprzętu Laboratoryjnego HengtaiHT-A2
TribrometanolNanjing Aibei Biotechnology Co., Ltd. M2910Znieczulenie

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Zheng, Q., Wang, X. Alzheimer's disease: Insights into pathology, molecular mechanisms, and therapy. Protein Cell. 16 (2), 83-120 (2025).
  2. Goldsmith, H. S. Alzheimer's disease: A decreased cerebral blood flow to critical intraneuronal elements is the cause. J Alzheimers Dis. 85 (4), 1419-1422 (2021).
  3. Oliver, B., et al. Causes and consequences of baseline cerebral blood flow reductions in Alzheimer's disease. J Cereb Blood Flow Metab. 41 (7), 1501-1516 (2021).
  4. Cai, M., et al. Electroacupuncture attenuates cognition impairment via anti-neuroinflammation in an Alzheimer's disease animal model. J Neuroinflammation. 16 (1), 264(2019).
  5. Ding, N., et al. Manual acupuncture regulates behavior and cerebral blood flow in the SAMP8 mouse model of Alzheimer's disease. Front Neurosci. 13, 37(2019).
  6. Jafari, C. Z., et al. Effect of vascular structure on laser speckle contrast imaging. Biomed Opt Express. 11 (10), 5826-5841 (2020).
  7. Du, E., et al. Multifunctional laser speckle imaging. Biomed Opt Express. 11 (4), 2007-2016 (2020).
  8. Paul, R., et al. Optimized laser speckle-based imaging system and methods for deep tissue cerebral blood flow imaging in small rodents. Neurophotonics. 12 (2), 025017(2025).
  9. Kazmi, S. M. S., et al. Flux or speed? Examining speckle contrast imaging of vascular flows. Biomed Opt Express. 6 (7), 2588-2608 (2015).
  10. Standard T/CAAM 0002-2020: Names and locations of commonly used acupuncture points for laboratory animals part 3: Mice. , China Association for Acupuncture and Moxibustion. (2020).
  11. Tian, H., et al. Analysis of learning and memory ability in an Alzheimer's disease mouse model using the Morris water maze. J Vis Exp. (152), e60055(2010).
  12. Sun, R. Q., et al. Improvement of electroacupuncture on APP/PS1 transgenic mice in behavioral probably due to reducing deposition of Aβ in hippocampus. Anat Rec (Hoboken). 304 (11), 2521-2530 (2021).
  13. Wang, X., et al. Improvement of electroacupuncture on APP/PS1 transgenic mice in spatial learning and memory probably due to expression of Aβ and LRP1 in hippocampus. Evid Based Complement Alternat Med. 2016, 7603975(2016).
  14. Ding, N., et al. Manual acupuncture regulates behavior and cerebral blood flow in the SAMP8 mouse model of Alzheimer's disease. Front Neurosci. 13, 37(2019).
  15. Akshmisha, Y., et al. Hippocampus and its involvement in Alzheimer's disease: A review. 3 Biotech. 12 (2), 55(2022).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

obrazowanie laserowego obrazu plamkowegochoroba Alzheimeradysfunkcja naczyniowo m zgowafunkcje poznawczewodny labirynt Morrisajednostka naczyniowo neuronalnahipoperfuzja m zgowa

Powiązane artykuły