Method Article

Wpływ różnych metod ekstrakcji na profile bioaktywności in vitro terfezii claveryi

DOI:

10.3791/69950

⸱

March 20th, 2026

 ,  ,  ,  , 
1Department of Biophysics, Department of Basic Medical Sciences, Faculty of Medicine, Kirsehir Ahi Evran University, 2Department of Genetics and Bioengineering, Faculty of Engineering and Architecture, Kirsehir Ahi Evran University, 3Department of Physiology, Gulhane Faculty of Medicine, University of Health Sciences, 4Department of Medical Services and Techniques, Medical Laboratory Techniques Program, Vocational School of Health Services, Kirsehir Ahi Evran University, 5Department of Field Crops, Faculty of Agriculture, Kirsehir Ahi Evran University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bioaktywność in vitro ekstraktów Terfezia claveryi zależała od metody ekstrakcji biofizycznej oraz polaryzacji rozpuszczalnika. Ekstrakt wodny z ekstrakcji wspomaganej maceracją (MAE) wykazywał najsilniejszą aktywność antyoksydacyjną, podczas gdy ekstrakt Soxhlet (SE) indukował większą cytotoksyczność w komórkach SH-SY5Y. Wyniki te wykazują wyraźne różnice zależne od metody w bioaktywności in vitro ekstraktów Terfezia claveryi.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Terfezia claveryi to jadalna trufla pustynna, tradycyjnie spożywana w regionach suchych. W ostatnich latach wzbudza rosnące zainteresowanie naukowe ze względu na potencjalne właściwości antyoksydacyjne, antybakteryjne i terapeutyczne, co sugeruje możliwe zastosowania w dziedzinie żywności i zdrowia. Jednak pomimo rosnących dowodów na jej potencjał biologiczny, wpływ różnych strategii ekstrakcji na odzyskiwanie związków bioaktywnych oraz wynikający z tego profil bioaktywności in vitro Terfezia claveryi nie został jeszcze wyjaśniony w literaturze. W tym badaniu oceniono bioaktywność in vitro ekstraktów Terfezia claveryi uzyskanych różnymi metodami ekstrakcji oraz rozpuszczalnikami o zmiennej polaryzacji. Określono wydajność ekstrakcji, a uzyskane ekstrakty oceniono pod kątem aktywności antyoksydacyjnej, przeciwbakteryjnej, antybiofilmowej oraz cytotoksycznej przy użyciu ustalonych systemów testowania. Zdolność antyoksydowaną mierzono za pomocą testów 2,2-difenylo-1-pikrylhydrazylu (DPPH), 2,2′-azino-bis(3-etylobenzotiazolina-6-sulfonowego kwasu) (ABTS) oraz właściwości antyoksydacyjnych redukujących żelazo (FRAP), natomiast badania badań nad efektami cytotoksycznymi w komórkach neuroblastoma SH-SY5Y. Wydajność ekstrakcji różniła się zarówno w zależności od metody, jak i polaryzacji rozpuszczalnika, a najwyższy wynik uzyskano z ekstraktu wodnego przygotowanego metodą ekstrakcji wspomaganej ultradźwiękami (UAE) (18,40%). Ustalono, że aktywność antyoksydantów wykazywała istotne różnice w zależności od metody ekstrakcji, a ekstrakty wodne uzyskane metodą ekstrakcji wspomaganej maceracją (MAE) wykazywały profil bogaty w związki fenolowe oraz najsilniejszą zdolność do usuwania rodników. Analiza LC-MS/MS tego ekstraktu wykazała obecność dziewięciu związków fenolowych; Zidentyfikowano kwas chininowy i kwas chlorogenowy jako dominujące składniki. Natomiast ekstrakty pochodzące z Soxhleta indukowały silniejsze efekty cytotoksyczne w komórkach SH-SY5Y. Odpowiedzi antybakteryjne i antybiofilmowe wykazywały stosunkowo ograniczone zróżnicowanie między metodami ekstrakcji, co wskazuje na słabszą zależność od strategii ekstrakcji w tych działaniach. Ogólnie rzecz biorąc, wyniki te pokazują, że metoda ekstrakcji biofizycznej i wybór rozpuszczalnika są kluczowymi czynnikami determinującymi profil bioaktywności in vitro ekstraktów Terfezia claveryi, z wyraźnymi efektami obserwowanymi w zakresie aktywności antyoksydacyjnej i cytotoksycznej.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wykorzystanie różnych gatunków grzybów do poprawy zdrowia oraz zapobiegania i leczenia chorób sięga czasów starożytnych 1,2,3. Makrogrzyby dzieli się zazwyczaj na dwie grupy: epigealne (grzyby) i hipogealne (trufle)4. Znana jako trufla pustynna, Terfezia claveryi (T. claveryi) to światowej sławy i jadalny gatunek trufli należący do rodzaju Terfezia5. T. claveryi jest powszechnie występowana na obszarach suchych i półsuchych, gdzie gatunki Helianthemum występująw 6,7,8,9,10,11. W ostatnich latach globalne obciążenie chorobami przewlekłymi, takimi jak nowotwory i choroby neurodegeneracyjne, znacznie wzrosło, co podkreśla pilną potrzebę nowych, bezpiecznych i skutecznych środków terapeutycznych. Według globalnych raportów zdrowotnych, rak pozostaje jedną z głównych przyczyn zgonów na świecie, podczas gdy choroby neurodegeneracyjne nadal rosną wraz ze starzejącą się populacją. W obliczu narastającego problemu zdrowia publicznego, badanie produktów naturalnych pochodzących z grzybów i roślin leczniczych jako potencjalnych źródeł związków bioaktywnych stało się ważnym priorytetem badawczym12.

Równolegle gwałtowne pojawienie się oporności na środki przeciwdrobnoustrojowe stanowi kolejne poważne zagrożenie dla zdrowia globalnego. Oporność na leki znacząco ograniczyła skuteczność tradycyjnych antybiotyków, tworząc pilną potrzebę alternatywnych strategii antybakteryjnych13. Metabolity wtórne pochodzące ze źródeł naturalnych, szczególnie związki fenolowe i polifenolowe, wzbudzają coraz większe zainteresowanie ze względu na różnorodne mechanizmy przeciwbakteryjne i niską tendencję do rozwoju oporności14. Stres oksydacyjny jest fundamentalnym czynnikiem mechanistycznym leżącym u podstaw wielu chorób przewlekłych, w tym nowotworów, zaburzeń neurodegeneracyjnych oraz zespołów metabolicznych. Nadmierna produkcja reaktywnych form tlenu (ROS) może ostatecznie zakłócić homeostazę komórkową, powodując uszkodzenia DNA, peroksydację lipidów oraz utlenianie białek. W tym kontekście naturalne przeciwutleniacze, które mogą usuwać wolne rodniki i regulować równowagę redoks, są uważane za obiecujące środki łagodzące uszkodzenia oksydacyjne i postęp choroby15.

Trufle są bogate w nienasycone kwasy tłuszczowe, białka, minerały, witaminy, aminokwasy, fenole i polifenole, składniki związane z właściwościami antybakteryjnymi, antyoksydacyjnymi i przeciwnowotworowymi 16,17,18,19,20,21,22,23,24 . Ich zdolność antyoksydacyjna została powiązana z skutecznością w usuwaniu wolnych rodników 25,26,27. Wśród gatunków trufli T. claveryi jest szczególnie godny uwagi ze względu na swoją jadalną strukturę, regionalną wartość ekonomiczną oraz zgłoszone bogactwo związków fenolowych23. Pomimo pojawiających się dowodów dotyczących jej tradycyjnej konsumpcji i aktywności biologicznej, kompleksowe badania dotyczące wpływu strategii ekstrakcji na skład chemiczny i efekty biologiczne pozostają ograniczone.

Odzyskiwanie biologicznie aktywnych związków z trufli jest silnie zależne od parametrów ekstrakcji, w tym zastosowanej techniki ekstrakcji oraz polaryzacji rozpuszczalnika. Metody ekstrakcji biofizycznej, takie jak ekstrakcja wspomagana ultradźwiękami (ZEA), ekstrakcja wspomagana maceracją (MAE) oraz ekstrakcja Soxhleta (SE), wykazują istotne różnice pod względem energii wejściowej, efektywności ekstrakcji oraz selektywności dla związków polarnych28. Jednak większość badań opierała się na jednej metodzie ekstrakcji lub ograniczonych systemach rozpuszczalników, a badania mające stosunkowo analizujące wpływ tych metod na profil aktywności biologicznej in vitro T. claveryi są ograniczone. Dlatego to badanie systematycznie porównuje różne metody ekstrakcji biofizycznej z wykorzystaniem rozpuszczalników o różnej polaryzacji w celu oceny biologicznej aktywności in vitro ekstraktów T. claveryi. Postawiono hipotezę, że metoda ekstrakcji i polaryzacja rozpuszczalnika prowadzą do różnic w aktywności biologicznej zależnych od metody. W związku z tym cele badania to: (i) porównanie wydajności ekstrakcji pomiędzy różnymi metodami i rozpuszczalnikami, (ii) ocena zależnych od metody zmienności aktywności antyoksydacyjnej i cytotoksycznej oraz (iii) badanie odpowiedzi antybakteryjnej i antybiofilmowej, uwzględniając ich wrażliwość na strategię ekstrakcji.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

UWAGA: Ogólny proces eksperymentalny przygotowania i analizy ekstraktów T. claveryi jest schematycznie podsumowany na Rysunku 1. Wszystkie materiały użyte w badaniu opisane są w Tabeli Materiałów.

1. Uwierzytelnianie i przygotowanie materiału grzybowego

  1. Zbieranie i przetwarzanie materiałów
    UWAGA: Świeże trufle T. claveryi zostały zebrane w maju 2023 roku ze stepowych i piaszczystych, nieuprawianych (nierolniczych) terenów w prowincji Kırsehir, Anatolia Centralna, Turcja. Pobieranie próbek przeprowadzono w trzech odrębnych miejscach: wiosce Dedeli (38°54′15,8" N, 34°06′40,3" E; ~1050 m n.p.m.), wiosce Buyukkayapa (38°53′45,1" N, 34°19′37,5" E; ~1020 m n.p.m.) oraz wiosce Akcaagıl (39°01′39,9" N, 34°12′39,8" E; ~1100 m n.p.m.). Miejsca zbiorów charakteryzują się półpustynnym klimatem kontynentalnym, z zimnymi zimami, gorącymi i suchymi latami oraz średnimi rocznymi opadami około 380–420 mm. Wszystkie próbki zostały zebrane w naturalnym sezonie owocowania z obszarów, gdzie nie prowadzono ostatnio działalności rolniczej, aby zminimalizować potencjalne skażenie antropogeniczne.
    1. Wybierz czyste i nieuszkodzone trufle, obierz je i umyj trzy razy wodą destylowaną.
    2. Pokroj próbki na małe kawałki i susz w cieniu, aż uzyskasz stałą wagę (około 20 dni).
    3. Zmielić wysuszony materiał za pomocą mechanicznego młynka i przepuścić przez sito o średnicy 328 mikronów (50 siatek).
    4. Przechowuj przetworzone próbki w woreczkach strunowych w chłodnym, suchym i ciemnym środowisku w temperaturze pokojowej do dalszych analiz.
  2. Identyfikacja molekularna T. claveryi
    1. Izoluj DNA genomowe z suszonych próbek T. claveryi w celu identyfikacji molekularnej.
    2. Należy spektrofotometrycznie ocenić ilość i czystość DNA.
    3. Przeprowadz reakcję łańcuchową polimerazy (PCR) identyfikacji gatunków poprzez amplifikację wewnętrznego obszaru transkrybowanego spacera (ITS) za pomocą uniwersalnych starterów ITS1 (5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′) i ITS4 (5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′).
    4. Produkty amplifikacji PCR rozwiązują się za pomocą elektroforezy na żelu agarozowym o stężeniu 1,5% przygotowanym w buforze 1x TAE i zwizualizowanym pod oświetleniem UV po barwieniu bromkiem etydu.
    5. Oczyszczaj produkty PCR jednopasmowe zgodnie z instrukcjami producenta29. Poddaliśmy oczyszczone amplikony sekwencjonowaniu Sanger.
    6. Składanie sekwencji do przodu i wstecznej do sekwencji konsensusu za pomocą algorytmu programu montażu kontig (CAP).
    7. Tożsamość gatunku została potwierdzona poprzez porównanie konsensualnej sekwencji ITS z sekwencjami referencyjnymi dostępnymi w publicznych bazach danych.
      UWAGA: Okaz voucherowy T. claveryi został zachowany w zbiorach laboratoryjnych do przyszłych referencji. Identyfikacja gatunków została potwierdzona analizą molekularną opartą na ITS (Plik Uzupełniający 1).

2. Przygotowanie i ekstrakcji materiału grzybowego

  1. Przygotowanie ekstraktów T. claveryi
    1. Waż około 30 g suszonego proszku T. claveryi .
    2. Dodaj 150 mL rozpuszczalnika (metanol, aceton, n-heksan, octan etylu lub woda destylowana), aby utrzymać stały stosunek stałych do cieczy we wszystkich metodach ekstrakcji.
    3. Do wszystkich procedur ekstrakcyjnych używaj rozpuszczalników o jakości analitycznej.
    4. Przefiltruj każdy ekstrakt pod obniżonym ciśnieniem za pomocą jakościowego papieru filtracyjnego.
    5. Skoncentruj filtraty pod obniżonym ciśnieniem w temperaturze 30–45 °C za pomocą parownika obrotowego.
    6. Liofilizacja (liofilizacja) skoncentrowane ekstrakty aż do całkowitego usunięcia rozpuszczalnika.
    7. Przechowuj suszone ekstrakty surowe w temperaturze −20 °C do dalszej analizy.
      UWAGA: Stosuj identyczne kroki przetwarzania po ekstrakcji do wszystkich próbek, aby zapewnić spójność metodologiczną i porównywalność.
  2. Metody ekstrakcji biofizycznej
    1. Ekstrakcja wspomagana maceracją (MAE)
      1. Włóż próbkę T. claveryi w sproszku do zamkniętego pojemnika ekstrakcyjnego.
      2. Dodaj wybrany rozpuszczalnik, zachowując stały stosunek rozpuszczalnika do ciała stałego.
      3. Inkubuj mieszankę w temperaturze pokojowej w ciemnych warunkach przez 72 godziny.
      4. Trzymaj pojemniki zamknięte, aby zapobiec odparowaniu rozpuszczalnika.
      5. Nie stosuj zewnętrznego poruszenia podczas maceracji.
      6. Pozwól mieszance osadzić się po zakończeniu okresu ekstrakcji.
      7. Przefiltruj ekstrakt przed dalszym przetwarzaniem.
    2. Ekstrakcja Soxhleta (SE)
      UWAGA: Zadbaj o prawidłową cyrkulację wody w kondensatorze i unikaj suchego ogrzewania podczas refluksu.
      1. Włóż próbkę w naparstek do ekstrakcji celulozy.
      2. Umieść naparstek wewnątrz komory ekstrakcyjnej Soxhleta połączonej z kolbą o okrągłym dnie.
      3. Dodaj wybrany rozpuszczalnik do kolby, utrzymując stały stosunek rozpuszczalnika do stałego.
      4. Podgrzej rozpuszczalnik do refluksu, używając termostatycznie sterowanego płaszcza grzewczego.
      5. Utrzymuj ciągłe pobieranie przez 24 godziny.
      6. Utrzymuj temperaturę ekstrakcji w temperaturze wrzenia każdego rozpuszczalnika (n-heksan: 68,7 °C; octan etylu: 77,1 °C; metanol: 64,7 °C; aceton: 56 °C; woda destylowana: 100 °C).
    3. Ekstrakcja wspomagana ultrasonografią (ZEA)
      UWAGA: Monitoruj temperaturę stale, aby zapobiec przegrzaniu podczas sonacji.
      1. Włóż próbkę T. claveryi w proszku do naczynia ekstrakcyjnego.
      2. Dodaj wybrany rozpuszczalnik, zachowując stały stosunek rozpuszczalnika do ciała stałego.
      3. Sonikować mieszankę z stałą częstotliwością 35 kHz i mocą wyjściową 520 W przez 25 minut.
      4. Utrzymuj temperaturę ekstrakcji na poziomie około 30 °C.
      5. Dodawaj lód co 5 minut, aby utrzymać temperaturę w granicach 25–28 °C podczas sonifikacji.
  3. Wydajność ekstrakcji
    1. Przed ekstracją zważ wysuszony materiał grzybowy (Wp).
    2. Po całkowitym usunięciu rozpuszczalnika zważ wysuszony ekstrakt surowy (Wext).
    3. Oblicz efektywność ekstrakcji za pomocą równania (1).
      figure-protocol-1    (1)
    4. Każdy wysuszony ekstrakt surowy ponownie rozpuszcza w odpowiednim rozpuszczalniku, aby przygotować roztwór zapasowy w stężeniu 10 mg/mL.
    5. Przygotuj świeże roztwory przed każdym eksperymentem in vitro z bioaktywności.
      UWAGA: Standaryzuj wszystkie stężenia ekstraktów, aby zapewnić porównywalne dawkowanie w kolejnych testach bioaktywności.

3. Określanie aktywności antyoksydantów

  1. Wykonaj analizę aktywności antyoksydacyjnej za pomocą testów DPPH, ABTS i FRAP.
  2. Przygotuj pięć różnych stężeń ekstraktów w zakresie od 0,25 do 1,0 mg/mL ze świeżo przygotowanych roztworów bulionowych.
  3. Wszystkie pomiary wykonuj w trzech egzemplarzach, aby zapewnić powtarzalność.
  4. Rejestruj wartości absorpcji spektrofotometrycznie za pomocą czytnika mikropłyt.
    UWAGA: Wszystkie testy wykonuj zgodnie z ustalonymi protokołami literatury z drobnymi modyfikacjami.
  5. Aktywność usuwania radykalnych DPPH
    UWAGA: Aktywność radykalnego usuwania DPPH ekstraktów T. claveryi została oceniona według metody opisanej w literaturze, z drobnymi modyfikacjami30. Chronić roztwór DPPH i mieszaniny reakcyjne przed ekspozycją na światło.
    1. Przygotuj roztwór DPPH w 70% metanolu.
    2. Dostosuj roztwór DPPH do absorbancji 1,00 ± 0,02 przy 517 nm.
    3. Pipeta 50 μL ekstraktu w różnych stężeniach do mikropłytki.
    4. Dodaj 250 μL roztworu DPPH do każdego dołka.
    5. Inkubuj mieszaninę reakcji w ciemności w temperaturze pokojowej przez 30 minut.
    6. Zmierz absorpcję przy 517 nm za pomocą spektrofotometru mikropłytowego.
    7. Używaj metanolu jako środka przeciwdziałania negatywnego, a kwasu askorbinowego jako dodatniego.
    8. Skonstruuj krzywe dawka–odpowiedź i oblicz wartości IC₅₀, aby ilościowo określić aktywność wydzielania radykalnych.
  6. Aktywność wydzielania radikalnych kationów ABTS
    UWAGA: Wykonaj badanie usuwania promieniników ABTS zgodnie z metodą opisaną w literaturze, z drobnymi modyfikacjami31. Przygotuj roztwór ABTS⁺ na co najmniej 16 godzin przed użyciem i chroń go przed światłem.
    1. Wygeneruj roztwór rodników ABTS, inkubując mieszaninę reakcji w ciemności w temperaturze pokojowej przez 16 godzin.
    2. Przed analizą rozcieńcz 1 mL roztworu ABTS 80 mL etanolu.
    3. Sreguluj absorpcję rozcieńczonego roztworu ABTS do 0,80 ± 0,02 przy 734 nm.
    4. Pipeta 50 μL ekstraktu w różnych stężeniach do mikropłytki.
    5. Dodaj 250 μL roztworu ABTS do każdego otworu.
    6. Inkubuj mieszankę w temperaturze pokojowej przez 10 minut.
    7. Zmierz absorpcję przy 734 nm za pomocą spektrofotometru mikropłytowego.
    8. Skonstruuj krzywe dawka–odpowiedź i oblicz wartości IC₅₀.
  7. Badanie właściwości antyoksydacyjnych redukujących żelazo (FRAP)
    UWAGA: Wykonaj test FRAP zgodnie z metodą zaproponowaną w literaturze, z drobnymi modyfikacjami32. Przygotuj odczynnik FRAP świeżo przed użyciem i chroń mieszaninę reakcji przed światłem.
    1. Przygotuj odczynnik FRAP zgodnie z podanym protokołem.
    2. Pipeta włóż 20 μL ekstraktu w różnych stężeniach do mikropłytki.
    3. Dodaj 280 μL świeżo przygotowanego odczynnika FRAP.
    4. Inkubuj mieszaninę reakcji w temperaturze pokojowej w ciemności przez 45 minut.
    5. Zmierz absorpcję przy 593 nm za pomocą spektrofotometru mikropłytowego.
    6. Wygeneruj krzywą kalibracyjną, używając Trolox jako standardu.
    7. Wyrażaj zdolność antyoksydacyjną w mg ekwiwalentów Troloxu (TE) na gram ekstraktu.

4. Analiza całkowitej zawartości fenolowej (TPC)

UWAGA: Określ całkowitą zawartość fenolową (TPC) ekstraktów T. claveryi za pomocą metody Folin–Ciocalteu opisanej w literaturze, z drobnymi modyfikacjami33. Chroń mieszaniny reakcji przed światłem podczas inkubacji. Przygotuj świeży roztwór węglanu sodu przed użyciem.

  1. Przygotuj roztwory ekstraktowe w stężeniu 1 mg/mL ze świeżo przygotowanych roztworów bulionowych.
  2. Pipeta włóż 25 μL ekstraktu do dołka mikropłytowego, dodaj 75 μL wody destylowanej, a następnie 25 μL odczynnika Folin–Ciocalteu.
  3. Inkubuj mieszankę w temperaturze pokojowej przez 6 minut.
  4. Do każdego dołku dodaj 100 μL roztworu węglanu sodu 7% (w/v).
  5. Inkubuj mieszaninę reakcji w temperaturze pokojowej w ciemności przez 90 minut.
  6. Zmierz absorpcję przy 665 nm za pomocą spektrofotometru mikropłytowego.
  7. Przygotuj krzywą kalibracyjną, używając kwasu galowego jako standardu i oblicz całkowitą zawartość fenolową, wyrażając wyniki jako mg ekwiwalentów kwasu galowego (GAE) na mL ekstraktu.

5. Analiza fitochemiczna z użyciem LC-MS/MS

UWAGA: Wykonaj analizę LC-MS/MS zgodnie z wcześniej opublikowanymi metodami chromatograficznymi z drobnymi modyfikacjami34. Przefiltruj wszystkie próbki i fazy komórkowe przez filtry membranowe o średnicy 0,22 μm i odgazuj fazy komórkowe przed analizą.

  1. Wybierz ekstrakt o najwyższej całkowitej zawartości fenolu do ilościowego profilowania fitochemicznego.
  2. Wykonaj separację chromatograficzną przy użyciu kolumny C18 w odwróconej fazie utrzymywanej w temperaturze 30°C.
  3. Przygotuj fazę mobilną składającą się z (A) 0,1% kwasu mrówkowego w wodzie dejonizowanej oraz (B) 0,1% kwasu mrówkowego w acetonitryle, ustaw przepływ na 0,4 mL/min, dostosuj objętość wtrysku do 5 μL i ustaw całkowity czas pracy na 17 minut.
  4. Przeprowadz detekcję spektrometryczną mas w warunkach jonizacji elektrosprayowej (ESI), wykorzystując azot jako gaz suszący, osłonowy i nebulizujący.
  5. Ustaw temperaturę gazu suszącego na 350 °C z przepływem 12 L/min, ustaw temperaturę gazu w otoczce na 250 °C przy przepływie 5 L/min i wyreguluj ciśnienie w nebulizatorze do 55 psi.
  6. Przygotuj zewnętrzne krzywe kalibracyjne dla każdego standardu fenolowego i ilościowo określ analizy, używając odpowiednich krzywych kalibracyjnych.

6. Test aktywności przeciwdrobnoustrojowej

UWAGA: Oceń aktywność antybakteryjną metodą dyfuzji agarowej zgodnie z ustalonymi protokołami mikrobiologicznymi. Wszystkie procedury mikrobiologiczne wykonuj w warunkach aseptycznych w szafie biobezpieczeństwa. Wysterylizuj wszystkie materiały przed i po użyciu.

  1. Wybierz następujące szczepy do testów przeciwdrobnoustrojowych: Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853, Escherichia coli ATCC 25922, Staphylococcus aureus ATCC 25923, Enterococcus faecalis ATCC 29212, Bacillus cereus ATCC 14579, Staphylococcus epidermidis ATCC 12228, Listeria monocytogenes ATCC 19115, Acinetobacter baumannii ATCC 17978, Shigella dysenteriae ATCC 13313, Klebsiella pneumoniae ATCC 13883 oraz Enterobacter aerogenes ATCC 13048.
  2. Inokuluj każdy szczep bakterii w bulionie sojowym tryptonowym (TSB) i inkubuj w optymalnej temperaturze wzrostu aż do osiągnięcia gęstości optycznej OD₆₀₀ = 0,7.
  3. Rozprowadz posiewy bakteryjne równomiernie na płytkach tryptonu sojowego agaru (TSA) za pomocą sterylnego wymazu.
  4. Punch wbija się aseptycznie do agaru za pomocą sterylnego wiertacza korkowego.
  5. Dodaj 100 μL każdego ekstraktu (100 μg/mL) do odpowiednich dołków.
  6. Inkubuj płytki w temperaturze 37 °C przez 18 godzin.
  7. Zmierz średnice stref hamujących otaczających każdą studnię, aby ocenić aktywność przeciwdrobnoustrojową.
  8. Wszystkie eksperymenty wykonuj w trzech egzemplarzach i wyrażaj wyniki jako wartości średnie.

7. Hamowanie biofilmu

UWAGA: Oceń aktywność antybiofilmu za pomocą testu barwienia fioletowego na podstawie szczepów bakterii referencyjnych. Wszystkie procedury wykonuj w warunkach aseptycznych i unikaj zakłócania przyklejonych biofilmów podczas mycia.

  1. Wybieraj szczepy Escherichia coli ATCC 25922 oraz Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 jako szczepy referencyjne i hoduj je w TSB w temperaturze 37 °C aż do osiągnięcia fazy wzrostu logarytmicznego.
  2. Dostosuj zawiesiny bakteryjne do gęstości optycznej OD₆₀₀ = 0,132.
  3. Pipeta 100 μL roztworów ekstraktu (0,625–10 mg/mL) do sterylnych mikromiarek polistyrenowych o pojemności 96 dołków, dodaj 100 μL zawiesiny bakteryjnej do każdego dołka i delikatnie wymieszaj.
  4. Inkubuj płytki w temperaturze 37 °C przez 24 godziny. Użyj studni zawierających tylko TSB jako pustych warstw oraz studni zawierających zawiesinę bakteryjną bez ekstraktu jako kontrolę.
  5. Ostrożnie usuń nieprzylegające komórki, dwukrotnie umyj studnie wodą destylowaną i pozwól płytkom wyschnąć na powietrzu.
  6. Dodaj 200 μL roztworu kryształowego fioletu 0,4% (w/v) do każdego dołka i inkubuj przez 30 minut.
  7. Usuń nadmiar bejcy, dwukrotnie opłuj studnie wodą destylowaną i pozwól płytom całkowicie wyschnąć.
  8. Dodaj etanol, aby rozpuścić związany barwnik i zmierz absorpcję przy 595 nm za pomocą czytnika mikropłyt.
  9. Oblicz aktywność antybiofilmu za pomocą równania (2).
    figure-protocol-2    (2)

8. Hodowla komórkowa i analiza aktywności cytotoksycznej (test MTT)

UWAGA: Oceń efekty cytotoksyczne za pomocą testu MTT zgodnie ze standardowymi protokołami żywotności komórek. Wszystkie procedury wykonuj w warunkach sterylnych w szafce bezpieczeństwa biologicznego i podgrzej medium oraz odczynniki do 37 °C przed użyciem.

  1. Pobierz linię komórkową ludzkiego neuroblastoma SH-SY5Y z akredytowanego repozytorium komórek i hodować komórki w zmodyfikowanym medium Eagle (DMEM) Dulbecco, uzupełnionym o 10% surowicę płodową bydła (FBS), 1% penicylinę/streptomycynę oraz 1% L-glutaminę w kolbach o powierzchni 25cm 2 .
  2. Utrzymuj hodowle w temperaturze 37 °C w nawilżonej atmosferze zawierającej 5%CO2 i rozwijaj komórki do około 80% konfluencji.
  3. Odłącz komórki przez trypsynizację, zasiewa je na płytkach z 96 dołkami o gęstości 2 × 104 komórek na dołek i wysiada przez 24 godziny, aby umożliwić przywiązanie.
  4. Należy poddać komórki ekstraktom T. claveryi w stężeniach 150, 300, 600, 1200 i 2000 μg/mL i inkubować przez 24 godziny.
  5. Usuń podłoże hodowlane, dodaj 100 μL świeżego medium zawierającego 10 μL roztworu MTT do każdego dołku i inkubuj przez 4 godziny w temperaturze 37 °C.
  6. Aspiruj ośrodek, rozpuszczaj kryształy formazonu, dodając 100 μL dimetylosulfotlenku (DMSO) do każdego otworu, a następnie mierz absorpcję przy 570 nm za pomocą spektrofotometru mikropłytowego.
  7. Wykonaj wszystkie eksperymenty w trzech egzemplarzach.

figure-protocol-3
Rysunek 1: Schematyczny przegląd eksperymentalnego przepływu pracy. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

9. Analiza statystyczna

  1. Wykonuj analizy statystyczne przy użyciu odpowiednich pakietów oprogramowania statystycznego oraz porównuj grupy kontrolne i leczone za pomocą testu Studenta t-test lub dwukierunkowej analizy wariancji (ANOVA), w zależności od potrzeb.
  2. Wyrażmy wszystkie dane jako średnią ± błędu standardowego średniej (SEM).
  3. Zdefiniuj istotność statystyczną na p < 0,05.
  4. Wskazuj istotność statystyczną na wykresach za pomocą gwiazdek w następujący sposób: **** dla p < 0,0001, *** dla p < 0,001, ** dla p < 0,01 oraz * dla p < 0,05, a "ns" oznacza nieistotność.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Identyfikacja molekularna T. claveryi
Amplifikacja PCR regionu ITS została przeprowadzona za pomocą uniwersalnych starterów ITS1 i ITS4 do identyfikacji molekularnej T. claveryi. Uzyskane sekwencje zostały przeanalizowane i porównane z sekwencjami referencyjnymi w bazie danych NCBI za pomocą algorytmu BLAST, co umożliwiło ostateczną identyfikację gatunków (plik uzupełniający 1).

Wydajność ekstrakcji
Efektywność ekst...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Niniejsze badanie ustanawia porównawczą i standaryzowaną platformę ekstrakcji i bioaktywności dla T. claveryi, wykazując, że strategia ekstrakcji jest decydującym czynnikiem zarówno dla składu chemicznego, jak i funkcjonalności biologicznej. Podstawową siłą metodologiczną tego protokołu jest ścisła kontrola parametrów ekstrakcji, szczególnie stałego stosunku stałego do cieczy, ustandaryzowanej objętości rozpuszczalnika, identycznego przetwarzania po ekstrakcji oraz jednolitego przygotowania roztworu przed biotes...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy deklarują brak konkurencyjnych interesów. Wszystkie dane wspierające wyniki tego badania są dostępne w głównym rękopisie oraz w dodatkowych plikach informacyjnych. Zbiory danych wygenerowane i przeanalizowane podczas obecnego badania są dostępne u współautora na uzasadnione żądanie.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy stwierdzili, że to badanie nie otrzymało żadnego wsparcia finansowego.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
96-dołkowe mikromiareczki polistyrenoweNest Scientific701001Hodowla komórek / płytki testowe
ABTS (2,2'-azino-bis(3-etylobenzotiazolina-6-kwas sulfonowy))Sigma-AldrichA3219Badanie usuwania radikalników kationowych
Aceton (poziom analityczny)Sigma-Aldrich179124Rozpuszczalnik ekstrakcyjny
Acetonitryl (klasa LC-MS)Sigma-Aldrich34851Faza ruchoma organiczna
Acinetobacter baumanniiATCCManassas, VA, USAATCC 17978
Potrójny Quad LC-MS/MS z systemem 1290 Infinity UPLCAgilent Technologies6460Analiza ilościowa
Kolumna analityczna (C18, 4,6 & razy; 100 mm, 3,5 μ m)Agilent Technologies (Zorbax)959990-902Kolumna odwróconej fazy
Standardy antyoksydacyjne (kwas askorbinowy / Trolox)Sigma-AldrichA7506 / 238813Kontrola dodatnia
Zastosowane analizatory DNA Biosystems 3730xlBiosystemy stosowane Analizatory DNA 3730xlSystem sekwencjonowania DNA
Biosystemy stosowane i handel; BigDye™ Zestaw do sekwencjonowania cykli Terminator v3.1Biosystemy stosowane 4337455Zestaw do sekwencjonowania Sangera
Bacillus cereusATCCManassas, VA, USAATCC 14579
Analiza bioinformatyczna, oprogramowanie BioEdit, używany algorytm: CAP contig assemblyIbis BiosciencesNAOprogramowanie do asemblerowania sekwencji
Naparstek do ekstrakcji celulozyFisherbrand&handel;  11724043Używane do ekstrakcji Soxhleta
Dimetylosiarkowotlenek (DMSO)Merck102952Rozpuszczalnik
Zestaw do izolacji DNA (Plant& Zestaw do izolacji DNA grzybów (Polska)EurX GeneMATRIXE3595Izolacja DNA 
DPPH (2,2-difenyl-1-pikrylhydrazyl)Sigma-AldrichD9132Badanie z radykalnym usuwaniem
Zmodyfikowany Eagle Medium firmy DulbeccoKoziorożec, DMEM-HA
Enterobacter aerogenesATCCManassas, VA, USAATCC 13048
Enterococcus faecalisATCCManassas, VA, USAATCC 29212
Escherichia coliATCCManassas, VA, USAATCC 25922
EtanolMerck100983Rozpuszczalnik
Octan etyluMerck109623Rozpuszczalnik ekstrakcyjny
Serum bydła płodu (FBS)Capricorn ScientificFBS-16A
Zestaw do sekwencjonowania cyklu BigDyeTerminator v3.1ThermoFisher4337455Zestaw do sekwencjonowania
Odczynnik Folin-CiocalteuSigma-Aldrich 47641Całkowita zawartość fenolu
Kwas mrówkowySigma-Aldrich 33015Addytywność fazy ruchomej
Kwas galowyCarlo Erba406335Krzywa kalibracji
Gene MATRIX Plant& Zestaw do izolacji DNA grzybówEurX E3595Zestaw do izolacji DNA
GraphPad Prism (v9)Wizualizacja danych i analiza statystycznaNie maAnaliza statystyczna
Płaszcz grzewczyElektrotermalne EME30500Stosowany do utrzymania refluksu rozpuszczalnika
HighPrep™ System czyszczenia PCRMAGBIOAC-60005
LódKlasa laboratoryjna—Kontrola temperatury w ZEA
Klebsiella pneumoniaeATCCManassas, VA, USAATCC 13883
L-glutaminaCapricorn ScientificNiemcy
Listeria monocytogenesATCCManassas, VA, USAATCC 19115
LiofilizatorScientzNie maLiofilizacja ekstraktów
Magnetyczna kulka i dash; Oparty na systemie czyszczenia PCRMAGBIOAC-60005PCR
MetanolMerck106009Rozpuszczalnik ekstrakcyjny
n-HexaneMerck103701Rozpuszczalnik ekstrakcyjny
Penicylina/StreptomycynaCapricorn ScientificNiemcy
Pseudomonas aeruginosaATCCManassas, VA, USAATCC 27853
Papier filtrujący (nr 541)Cytiva1541-125 VW procesie filtracji ekstraktów
Rotacyjny parownikBuchi R10011100V101Usuwanie rozpuszczalnika
Shigella dysenteriaeATCCManassas, VA, USAATCC 13313
Węglan soduMerck106392Całkowita analiza fenolowa
SPECTROstar Nano Microplate Reader BMG LabtechPomiary absorpcji
Staphylococcus aureusATCCManassas, VA, USAATCC 25923
Gronkowec epidermidisATCCManassas, VA, USAATCC 12228
Oprogramowanie do analizy statystycznej (SPSS, v23)Analiza danychNA
Thermo Scientific Nanodrop 2000 Thermo Fisher ScientificND-2000
Trypton Soy Agar (TSA)MerckNiemcy—
Tryptonowy bulion sojowy (TSB)MerckNiemcy—
Homogenizator ultradźwiękowyScientzSCIENTZ-650LEkstrakcja wspomagana ultradźwiękami

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Wasser, S. P., Weis, A. L. Medicinal properties of substances occurring in higher basidiomycetes mushrooms: current perspectives (Review). Int. J. Med. Mushrooms. 1 (1), 31-62 (1999).
  2. Wasser, S. P. Current findings, future trends, and unsolved problems in studies of medicinal mushrooms. Appl. Microbiol. Biotechnol. 89 (5), 1323-1332 (2011).
  3. Badalyan, S. Medicinal aspects of edible ectomycorrhizal mushrooms. Edible Ectomycorrhizal Mushrooms: Current Knowledge and Future Prospects. Zambonelli, A., Bonito, G. M. , Springer. Berlin, Heidelberg. 317-334 (2012).
  4. El Enshasy, H. A., Hatti-Kaul, R. Mushroom immunomodulators: unique molecules with unlimited applications. Trends Biotechnol. 31 (12), 668-677 (2013).
  5. Morte, A., Kagan-Zur, V., Navarro-Ródenas, A., Sitrit, Y. Cultivation of desert truffles—A crop suitable for arid and semi-arid zones. Agronomy. 11 (8), 1462(2021).
  6. Gutiérrez, A., Morte, A., Honrubia, M. Morphological characterization of the mycorrhiza formed by Helianthemum almeriense Pau with Terfezia claveryi Chatin and Picoa lefebvrei (Pat.) Maire. Mycorrhiza. 13 (6), 299-307 (2003).
  7. Loizides, M., Hobart, C., Konstandinides, G., Yiangou, Y. Desert truffles: the mysterious jewels of antiquity. Field Mycology. 13 (1), 17-21 (2012).
  8. Atila, F., Kazankaya, A. Terfezia species natural distributed in Türkiye and their ecologies. Mantar Dergisi. 13 (3), 119-130 (2022).
  9. Türkoğlu, A., Castellano, M., Trappe, J., Yaratanakul Güngör, M. Turkish truffles I: 18 new records for Turkey. Turkish J. Bot. 39, 359-376 (2015).
  10. Doğan, H., Kurt, F. New macrofungi records from Turkey and macrofungal diversity of Pozantı-Adana. Turkish J. Bot. 40, 209-217 (2016).
  11. İnci, Ş, Kırbağ, S. Nutritional content, antioxidant and antimicrobial activity of Terfezia claveryi Chatin. Artvin Çoruh Univ. J. For. Fac. 19 (2), 138-143 (2018).
  12. Sung, H., et al. Global cancer statistics 2020: GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries. CA Cancer J. Clin. 71 (3), 209-249 (2021).
  13. Ventola, C. L. The antibiotic resistance crisis: part 1: causes and threats. P T. 40 (4), 277-283 (2015).
  14. Cushnie, T. P. T., Lamb, A. J. Antimicrobial activity of flavonoids. Int. J. Antimicrob. Agents. 26 (5), 343-356 (2005).
  15. Valko, M., et al. Free radicals and antioxidants in normal physiological functions and human disease. Int. J. Biochem. Cell Biol. 39 (1), 44-84 (2007).
  16. Morte, A., Honrubia, M., Gutiérrez, A. Biotechnology and cultivation of desert truffles. Mycorrhiza: State of the Art. Varma, A. , 467-483 (2008).
  17. Corrêa, R. C. G., et al. Biotechnological, nutritional and therapeutic uses of Pleurotus spp. related with its chemical composition: a review. Trends Food Sci Technol. 50, 103-117 (2016).
  18. Ma, G., et al. A critical review on the health promoting effects of mushrooms nutraceuticals. Food Sci. Hum. Wellness. 7 (2), 125-133 (2018).
  19. Reis, F. S., et al. Functional foods based on extracts or compounds derived from mushrooms. Trends Food Sci. Technol. 66, 48-62 (2017).
  20. Mandeel, Q. A., Al-Laith, A. A. Ethnomycological aspects of the desert truffle among native Bahraini and non-Bahraini peoples. J. Ethnopharmacol. 110 (1), 118-129 (2007).
  21. Patel, S. Food, health and agricultural importance of truffles: a review. Curr. Trends Biotechnol. Pharm. 6, 15-27 (2012).
  22. Janakat, S., Nassar, M. Hepatoprotective activity of desert truffle (Terfezia claveryi) compared with Nigella sativa in rats. Pak. J. Nutr. 9, 52-56 (2010).
  23. Al-Laith, A. A. A. Antioxidant components and activities of desert truffle (Tirmania nivea). J. Food Compos. Anal. 23 (1), 15-22 (2010).
  24. Shavit, E., Shavit, E. The medicinal value of desert truffles. Desert Truffles. Kagan-Zur, V., Roth-Bejerano, N., Sitrit, Y., Morte, A. 38, 323-340 (2014).
  25. Patel, S., et al. Potential health benefits of natural products derived from truffles. Trends Food Sci. Technol. 70, 1-8 (2017).
  26. Beara, I. N., et al. Phenolic profile, antioxidant, anti-inflammatory and cytotoxic activities of truffles. Food Chem. 165, 460-466 (2014).
  27. Dahham, S. S., et al. Antioxidant, anticancer and apoptosis properties of Terfezia claveryi. Saudi J. Biol. Sci. 25 (8), 1524-1534 (2018).
  28. Azmir, J., et al. Techniques for extraction of bioactive compounds: a review. J. Food Eng. 117 (4), 426-436 (2013).
  29. Kumar, M., Shukla, P. K. PCR targeting of ITS regions for rapid diagnosis of mycotic keratitis. J. Clin. Microbiol. 43 (2), 662-668 (2005).
  30. Bondet, V., Brand-Williams, W., Berset, C. Kinetics and mechanisms of antioxidant activity using the DPPH method. LWT Food Sci. Technol. 30, 609-615 (1997).
  31. Re, R., et al. Antioxidant activity applying an improved ABTS assay. Free Radic. Biol. Med. 26 (9-10), 1231-1237 (1999).
  32. Đorđević, T. M., et al. Effect of fermentation on antioxidant properties of cereals. Food Chem. 119 (3), 957-963 (2010).
  33. Herald, T. J., et al. High-throughput micro plate assays for screening flavonoid content and DPPH-scavenging activity in sorghum bran and flour. Sci. Food Agric. 92 (11), 2326-2331 (2012).
  34. Kısa, D., et al. Evaluation of Biological Potency of two Endemic Species Integrated with in vitro and in silico Approches: LC-MS/MS Analysis of the Plants. Chem. Biodivers. 21 (3), e202301351(2024).
  35. Kumoro, A., Singh Hasan, Effects of solvent properties on the soxhlet extraction of diterpenoid lactones from andrographis paniculata leaves. ScienceAsia. 35, 306-309 (2009).
  36. Ng, Z. X., Samsuri, S. N., Yong, P. H. The antioxidant index and chemometric analysis of tannin, flavonoid, and total phenolic extracted from medicinal plant foods with the solvents of different polarities. Food Process. Preserv. 44 (9), e14680(2020).
  37. Kıvrak, İ Analytical methods applied to assess chemical composition, nutritional value and ın vitro bioactivities of Terfezia olbiensis and Terfezia claveryi from Turkey. Food Anal. Methods. 8 (5), 1279-1293 (2015).
  38. Neggaz, S., et al. In vitro evaluation of antioxidant, antibacterial and antifungal activities of Terfezia claveryi Chatin. Phytothérapie. 13, 1-7 (2015).
  39. Monteiro, M., et al. Effect of extraction method and solvent system on the phenolic content and antioxidant activity of selected macro- and microalgae extracts. J. Appl. Phycol. 32 (1), 349-362 (2020).
  40. Pingret, D., et al. Degradation during application of ultrasound in food processing: A review. Food Control. 31, 593-606 (2013).
  41. Şahin, A., et al. Total phenol, antioxidant activity, fatty acid composition and mineral contents of the species of fungi known as domalan. J. Agroalimentary Process. Technol. 26 (3), 149-154 (2020).
  42. Fidan, M., et al. cytotoxic and protective effects of truffles. Anal. Biochem. 641, 114566(2022).
  43. Awika, J. M., et al. Screening methods to measure antioxidant activity of sorghum (sorghum bicolor) and sorghum products. J. Agric. Food Chem. 51 (23), 6657-6662 (2003).
  44. Gursoy, N., et al. Antioxidant activities, metal contents, total phenolics and flavonoids of seven Morchella species. Food Chem. Toxicol. 47 (9), 2381-2388 (2009).
  45. Elsayed, E., et al. Truffles: A potential source of bioactive compounds. Bioactive Compounds in Food. , CRC Press. 163-174 (2021).
  46. Elsayed, E. A., et al. Mushrooms: a potential natural source of anti-inflammatory compounds for medical applications. Mediators Inflamm. 2014, 805841(2014).
  47. Stanikunaite, R., et al. Cyclooxygenase-2 inhibitory and antioxidant compounds from the truffle Elaphomyces granulatus. Phytother. Res. 23 (4), 575-578 (2009).
  48. Doğan, H. H., Aydın, S. Determination of antimicrobial effect, antioxidant activity and phenolic contents of desert truffle in Turkey. Afr. J. Tradit. Complement. Altern. Med. 10 (4), 52-58 (2013).
  49. Abu-Odeh, A., et al. In vitro and In vivo Antidiabetic Activity, phenolic content and microscopical characterization of Terfezia claveryi. Molecules. 27 (15), 4843(2022).
  50. Nguyen, V., et al. Chlorogenic Acid: A systematic review on the biological functions, mechanistic actions, and therapeutic potentials. Nutrients. 16 (7), 924(2024).
  51. Suhag, R., et al. Mapping antioxidant mechanisms in plant extracts via reactivity kinetics inhibiting oil autoxidation. Appl. Food Res. 5 (2), 101476(2025).
  52. Harir, M., et al. Evaluation of antimicrobial activity of Terfezia arenaria extracts collected from Saharan desert against bacteria and filamentous fungi. 3 Biotech. 9 (7), 281(2019).
  53. Hamza, A., et al. Nutraceutical potential, antioxidant and antibacterial activities of Terfezia boudieri Chatin, a wild edible desert truffle from Tunisia arid zone. Arab. J. Chem. 9 (3), 383-389 (2016).
  54. Neggaz, S., et al. In vitro evaluation of antioxidant, antibacterial and antifungal activities of Terfezia claveryi Chatin. Phytothérapie. 13, 1-7 (2020).
  55. Dib, S., Fortas, Z. Antimicrobial activities of desert truffle extracts and their chemical ıdentification. J. Pharm. Pharmacol. 7, 1-7 (2019).
  56. Gargano, M. B., et al. Antimicrobial activity of the extracts of Terfezia Claveryi and Tirmania Pinoyi against gram-positive and gram-negative bacteria causal agent of diseases in tomato. Chem. Eng. Trans. 58, 73-78 (2017).
  57. Khojah, H. M. J., et al. Antimicrobial efficacy of extracts of Saudi Arabian desert Terfezia claveryi truffles. Saudi J. Biol. Sci. 29 (11), 103462(2022).
  58. Akyüz, M., et al. Cytotoxicity and DNA protective effects of the Terfezia and Picoa species from the eastern region of Turkey. Istanbul J. Pharm. 51 (2), 198-203 (2021).
  59. Al Obaydi, M. F., et al. Terfezia boudieri: A Desert Truffle With Anticancer and Immunomodulatory Activities. Front. Nutr. 7, 38(2020).
  60. Pakrashi, S., et al. Quercetin alleviates 6-OHDA-caused apoptosis in SH-SY5Y cells. Toxicol. Res. 13 (4), tfae117(2024).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Terfezia ClaveryiExtraction MethodsIn Vitro BioactivityAntioxidant ActivityAntimicrobial ActivityCytotoxic ActivityUltrasound Assisted ExtractionMaceration Assisted ExtractionPhenolic CompoundsLC MS MS Analysis

Related Articles