Model myszy dawcy serca z ablacją limfatyczną za pomocą elektrokauteryzmu do badań nad transplantacją

Podsumowanie

Opracowaliśmy nowy model myszy dotyczący dawczej ablacji limfatycznej serca w przeszczepach serca. Model ten pokazuje, że zakłócenie funkcji limfatycznych dawców łagodzi ostre odrzucenie, zmniejsza uszkodzenia mięśnia sercowego i przedłuża przeżywalność przeszczepu, dostarczając nowych informacji o funkcji limfatycznego serca w odporności transplantacyjnej.

Streszczenie

Chociaż naczynia limfatyczne serca zyskują w ostatnich latach coraz większą uwagę, związek między układem limfatycznym dawcy serca a ostrym odrzuceniem podczas przeszczepów serca pozostaje do wyjaśnienia.

Aktywność elektrofizjologiczna serca oceniano za pomocą elektrokardiografii (EKG) u myszy w zdrowym stanie przed i po ablacji limfatycznej serca. Główne naczynia limfatyczne serca dawcy zostały zwizualizowane za pomocą zastrzyku Evans Blue i następnie astralizowane za pomocą elektrokauteryzacji. Model przeszczepu serca z dysfunkcją limfatyczną serca dawcy został opracowany na podstawie serc poddanych ablacji limfatycznej. Funkcję przeszczepu serca oceniano za pomocą echokardiografii, western blottingu oraz ELISA. Wpływ ablacji limfatycznej dawcy na ostre odrzucenie oceniano za pomocą barwienia hematoksylin-eozyny (HE) oraz monitorowania czasu przeżycia przeszczepu.

Wyniki EKG nie wykazały istotnych zmian w elektrofizjologii serca przed i po ablacji limfatycznej, potwierdzając, że główne naczynia sercowe pozostały nieuszkodzone. Evans Blue został wstrzyknięty do wierzchołka serca, aby oznakować naczynia limfatyczne. Główne limfatyczne były następnie ablacowane za pomocą elektrokauteryzacji. Po zakończeniu zabiegu ablacji myszy zostały heparynizowane, a następnie pobrano ich serca. Przecięto aortę i tętnicę płucną, a żyła górna/dolna oraz żyły płucne zostały podwiązane. Następnie przeszczepiano przygotowane (ablacowane) serca dawcy. Poziomy cTnI i frakcja wyrzutowa wykazały, że ablacja limfatyczna nie nasila urazu serca. Barwienie HE wykazało, że ablacja dawcy komórek limfatycznych serca łagodziła ostre odrzucenie, zmniejszała uszkodzenia mięśnia sercowego i wydłużała przeżycie przeszczepu.

Udało nam się ustanowić model przeszczepu serca u myszy z dysfunkcją limfatyczną serca dawcy i wykazać, że ablacja dawcy limfatycznych serc może złagodzić ostre odrzucenie, osłabić uszkodzenia mięśnia sercowego i wydłużyć przeżywalność przeszczepu. Te odkrycia dostarczają nowych informacji i podstaw do zrozumienia roli układu limfatycznego serca w przeszczepach serca.

Wprowadzenie

Odrzucenie przeszczepu serca pozostaje jednym z najczęstszych i najpoważniejszych powikłań po przeszczepie serca, dzielącym się głównie na ostre odrzucenie komórkowe oraz odrzucenie pośredniczone przez przeciwciała. Chociaż nowoczesne terapie immunosupresyjne znacząco poprawiły wskaźniki przeżycia przeszczepu, odrzucenie nadal jest głównym czynnikiem decydującym o wyniku przeszczepu. Według literatury około 12% pacjentów doświadcza co najmniej jednego epizodu umiarkowanego lub ciężkiego ostrego odrzucenia w pierwszym roku po^{transplantacji.}

Układ limfatyczny serca zyskuje coraz większą uwagę ze względu na swoją potencjalną rolę w odrzuceniu przeszczepów. Poza dobrze ugruntowanymi funkcjami w zakresie równowagi płynów i nadzoru immunologicznego, układ limfatyczny odgrywa ważną rolę w modulowaniu odpowiedzi immunologicznych. Naczynia limfatyczne pełnią rolę głównych kanałów dla komórek odpornościowych do wchodzenia i wychodzenia z tkanek ^2,3. W sercu sieć limfatyczna stanowi podstawową infrastrukturę transportu i recyrkulacji komórek odpornościowych, w tym limfocytów. Przez ten szlak limfocyty migrują z krwiobiegu do przestrzeni śródmiąższowej, gdzie prowadzą nadzór immunologiczny. Następnie są one odprowadzane do węzłów chłonnych i ostatecznie wracają do ogólnoustrojowego krążenia ^2,4. Ponadto badania wskazują, że limfocyty T i ich podgrupy odgrywają kluczową rolę w ostrych reakcjach odrzucenia, a aktywacja i migracja tych komórek mogą być zależne od układu limfatycznego⁵.

Chociaż znane są naczynia limfatyczne w sercu i tworzą sieci analogiczne do naczyń krwionośnych, ich znaczenie nie było przez lata równie dobrze traktowane. Badania wykazały, że brak funkcjonalnych naczyń limfatycznych prowadzi do wyraźnego przerostu serca i obrzęku, co wskazuje na kluczową rolę limfatyku w utrzymaniu homeostazy tkanek serca⁶. Ponadto upośledzony lub brak drenażu limfatycznego może obniżać efektywność oczyszczania komórek zapalnych, co nasila lokalne odpowiedzi zapalne i wpływa na proces przebudowy serca⁷.

W chorobach serca istnieją różne interwencje ukierunkowane na naczynia limfatyczne. W modelach mysich niedobór limfatyczny serca można wywołać przez generowanie myszy Vegfc+/-⁸. Klinicznie można stosować interwencyjną embolizację limfatyczną śródpiersiową^{9 oraz} małoinwazyjną operację okna osierdzia¹⁰ w leczeniu wysięku osierdziowego chylusowego. U pacjentów z fizjologią krążenia Fontana dekompresja limfatyczna może być przeprowadzona chirurgicznie¹¹, poprzez przezskórną dekompresję przewodu^{piersiowego 12} lub poprzez ustanowienie zespolenia^{limfatycznego 13}. Techniki zamykania obejmują embolizację przewodów piersiowych¹⁴, selektywną embolizację przewódu^{limfatycznego 15} oraz podwiązanie przewodów^{piersiowych 16}. Jednak bezpośrednie interwencje skierowane bezpośrednio na naczynia limfatyczne serca pozostają ograniczone.

Biorąc pod uwagę kluczową rolę naczyń limfatycznych serca, opracowaliśmy nowy model przeszczepu serca myszego poprzez ablację głównych naczyń limfatycznych w sercach dawcy za pomocą elektrokauteryzacji. Model ten został wykorzystany do badania wpływu dysfunkcji limfatycznego przeszczepu dawcy na ostre odrzucenie po transplantacji.

Protokół

Samce myszy C57BL/6J i BALB/c (samce, 6-8 tygodni, masa ciała 25-28 g) były utrzymywane w określonych warunkach wolnych od patogenów. Wszystkie procedury eksperymentalne były przeprowadzane zgodnie z protokołami zatwierdzonymi przez Komitet Etyki Zwierząt Szpitala Fuwai (Nr Zatwierdzenia: 0108-7-800-ZX(X)-019).

Wizualizacja i ablacja naczyń limfatycznych serca u myszy
Aby zasymulować dysfunkcję limfatyczną serca, główne naczynia limfatyczne serca zostały usunięte za pomocą elektrokauteryzacji.

Wszystkie myszy zostały znieczulone przez intraperitonealną iniekcję 1,25% tribrometanolu w dawce 0,2 mL na 10 g masy ciała i przez cały czas zabiegu były wentylowane mechanicznie. Po znieczuleniu tribrometanolem myszy BALB/c przeszły intubację endotchawicową za pomocą cewnika 22-gauge i były podłączone do elektroprzewodów EKG (Rysunek 1A, Ilustracja S1). W parametrach respiratora stosunek oddechów został ustawiony na 1:1 lub 1:2, z objętością pływową 0,3 mL i częstotliwością oddechów 100 oddechów na minutę. Po podłączeniu cewnika do respiratora stan myszy był ściśle monitorowany; Intubacja była uznawana za skuteczną, jeśli częstość oddechowa myszy odpowiadała respiratorowi, podczas gdy nieregularne częstości lub rozdęcie brzucha wskazywały na niewydolność wymagającą ponownej intubacji. Następnie wykonano torakotomię w lewej przestrzeni międzyżebrowej 3-4 z nacięciem o długości około 1 cm, a do odsłonięcia całego serca użyto retraktora (Rysunek 1B). Następnie 5 μL barwnika niebieskiego Evansa zostało wstrzykniętych domięśniowo do wierzchołka serca, aby zobaczyć naczynia limfatyczne, z 1-minutowym okresem oczekiwania po wstrzyknięciu umożliwiającym całkowitą opacjację (Rysunek 1C, E; Ilustracja uzupełniająca S2A-B), zauważając, że niebieski Evans należy podawać bardzo powoli. Po wizualizacji potwierdzono lokalizację głównych naczyń limfatycznych serca, porównując wcześniej zgłoszone dane anatomiczne^17,18, a ablację wykonano za pomocą elektrokauteryzacyjnego pena ustawionego na 10 W w trybie ciągłym, z czasem krzepnięcia około 3-7 sekund (Rysunek 1D,F). Elektrokardiografia (EKG) była monitorowana przed i po ablacji, aby upewnić się, że nie występuje uszkodzenie naczyń (rysunek 1G,H). Ostatecznie, po dużej ablacji limfatycznej, myszy zostały heparynizowane w przygotowaniu do kolejnego pobrania serca dawcy. Schematyczne przedstawienie zabiegu chirurgicznego znajduje się na Rysunku 2.

Przeszczep serca w jamie brzusznej heterotopii
Przeszczep serca heterotopowego w jamie brzusznej myszy wykonano zgodnie z opisanym wcześniej¹⁹. Krótki protokół podsumowany jest poniżej:

Procedura dawcy
Wykonano laparotomię wzdłuż linea alba u myszy BALB/c, a 1 mL soli heparynowej 50 U/mL w temperaturze 4 °C wstrzyknięto do żyły głównej dolnej, podczas gdy aorta brzuszna została przecięta, aby wywołać ogólnoustrojową heparynizację. Po tym serce zostało odsłonięte i 8-0 Do podwiązywania lewej i prawej żyły głównej górnej stosowano szwy, które następnie przecinano na dalszym końcu szwów (Rysunek 3A,B). Następnie aorta została odizolowana od otaczającej tkanki tłuszczowej i przecięta w pobliżu łuku aorty (rysunek 3C), a podobną procedurę przeprowadzono w celu izolacji i przecięcia tętnicy płucnej (rysunek 3D). Żyła dolna w odcinku piersiowym została podwiązana metodą 8-0 szwy i przecięte na końcu dystalnym (rysunek 3E), po czym żyły płucne zostały podwiązane i przecięte za pomocą szwów splecionych jedwabem 7-0 (rysunek 3F). Ostatecznie usunięte serce dawcy zostało zachowane w soli fizjologicznej w temperaturze fizjologicznej w temperaturze 4 °C do kolejnego przeszczepu, a wszystkie serca zachowano przez ten sam czas około 30 minut, aby zapewnić spójność eksperymentalną.

Procedura odbiorcza
Znieczulać myszy przyjmujące C57BL/6J w przygotowaniu do przeszczepu serca brzusznego. Wykonano laparotomię wzdłuż linii alba, aby odsłonić aortę brzuszną i żyłę dolną myszy biorcy (Rysunek 4A). Po podwiązaniu naczyń grzbietowych żyły głównej dolnej szwami nylonowymi 10-0, użyto klamer naczyniowych do zablokowania przepływu krwi przez aortę brzuszną i żyłę główną dolną (Rysunek 4B). Następnie utworzono okno w aorcie brzusznej i dolnej żyły głownej myszy biorcy, a krew została wypłukana z naczyń solą fizjologiczną z heparyną. Wykonano zespolenie od końca do boku za pomocą szwów nylonowych 11-0, aby połączyć tętnicę płucną serca dawcy z żyłą dolną biorcy oraz aortę serca dawcy z aortą brzuszną biorcy (Rysunek 4C-E). Na koniec zwolniono zaciski naczyniowe, aby przywrócić przepływ krwi do myszy biorcy (Rysunek 4F).

Projektowanie eksperymentalne
Grupa eksperymentalna: Naczynia limfatyczne serca u myszy BALB/c zostały zobrazowane za pomocą barwnika niebieskiego Evansa i astrasowane za pomocą elektrokauteryzacyjnego pena. Serca myszy BALB/c z ablacjami naczyń limfatycznych zostały przeszczepione do myszy C57BL/6J.

Grupa kontrolna: Naczynia limfatyczne serca u myszy BALB/c były wizualizowane za pomocą barwnika Evans Blue, jednak nie przeprowadzono ablacji. Serca myszy BALB/c zostały przeszczepione do myszy C57BL/6J.

W tym badaniu wielkość próby została ustandaryzowana we wszystkich grupach eksperymentalnych i punktach czasowych: n=5 myszy na grupę w testach przeprowadzonych 24 godziny po przeszczepie serca, n=5 w grupie w 7 dniach po transplantacji oraz n=5 w grupie do obserwacji czasu przeżycia przeszczepu serca.

Pobrane serca dawcy były przechowywane w lodowato zimnej soli fizjologicznej o temperaturze 4 °C przez 30 minut przed przeszczepem serca. Zarówno serca dawców z grupy eksperymentalnej, jak i kontrolnej były przechowywane w soli fizjologicznej przez ten sam czas.

Czas trwania bicia przeszczepów serca był codziennie oceniany palpacją w obu grupach (n=5 na grupę).

Ocena histologiczna i ocenę odrzucenia mięśmiu przyzębnego (PR)
Próbki tkanek sercowych zostały poddane fiksacji w 10% formalinie przez 48 godzin, po czym nastąpiła odwodnienie w wyniku serii stopniowego etanolu (70%, 80%, 95%, 100%), oczyszczania ksylenów, osadzania parafiny oraz sekcjonowania mikrotomowego (4 μm), a powstałe przekroje barwiono hematoksyliną i eozyną (H&E). Odrzucenie przeszczepu oceniano na podstawie wyniku PR dla przeszczepu serca, a stopień urazu przeszczepu oceniano w sposób ślepy²⁰.

Badanie echokardiograficzne
Funkcję serca oceniano za pomocą systemu ultradźwiękowego (przetwornik sondy 40 MHz 550). Myszy umieszczano na plecach na obrotowej platformie zwierzęcej o 360 stopniach. Po usunięciu owłosienia na brzuchu oceniono funkcję serca pod znieczuleniem izofluranowym 1,0%. Frakcja wyrzucenia (EF) przeszczepu serca została zmierzona za pomocą echokardiografii M-mode.

Wykrywanie markerów uszkodzeń mięśnia sercowego
Zakres uszkodzeń tkanki sercowej oceniono poprzez pomiar ekspresji enzymów specyficznych dla kardiomiocytów w surowicy. Poziomy troponiny I (cTnI) w sercu zostały przeanalizowane zgodnie z instrukcjami producenta.

Western blotting
Po 24 godzinach po przeszczepie serca pobrano tkankę mięśnia sercowego z głównych obszarów naczyń limfatycznych przeszczepów serca zarówno w grupie kontrolnej, jak i eksperymentalnej. Zgodnie z wcześniej opisanym protokołem²¹ przeanalizowano ekspresję markerów związanych z naczyniami limfatycznymi. Tkanki sercowe zostały dokładnie zlikwidowane w buforze lizy RIPA zawierającym inhibitory proteazy (fenylmetanowy sulfonylowofluorek). Przed denaturacją cieplną stężenie białka było określane za pomocą zestawu BCA i dostosowywano do równomiernego stężenia. Całkowite białko z każdej grupy zostało rozdzielone za pomocą SDS-PAGE i następnie przeniesione na membranę PVDF. Błona PVDF została zablokowana 5% odtłuszczonym mlekiem (temperatura pokojowa przez 1-2 godziny), a następnie inkubowano przez noc w temperaturze 4 °C z odpowiednimi przeciwciałami głównymi. Następnego dnia błona była traktowana przeciwciałem wtórnym (przeciwkrólikiem, 1:1000) w temperaturze pokojowej przez 30 minut. Paski membranowe były inkubowane roztworem ECL (1-2 mL) i naświetlane, aby uchwycić obrazy.

Stosowane przeciwciała były następujące: przeciwciało poliklonalne LYVE1 (1:500), przeciwciało podoplaninowe (1:500) oraz receptor anty-VEGF 3 (1:50).

Analiza statystyczna
Wszystkie wyniki wyrażane są jako średnia ± standardowy błąd średniej (SEM). Porównując dwie grupy, analizy statystyczne przeprowadzano za pomocą testu Studenta t-test lub testu sumy rangi Wilcoxona, w zależności od rozkładu danych i jego cech. Istotność statystyczna została zdefiniowana jako p < 0,05.

Wyniki

Ocena funkcji przeszczepu serca
Modele przeszczepów serca na mysich zostały opracowane zarówno w grupach kontrolnych, jak i eksperymentalnych, zgodnie z opisanym protokołem. Stan funkcjonalny przeszczepów oceniano 24 godziny po przeszczepie. Poziom ekspresji surowicy kardioniny I (cTnI) był wyższy w grupie eksperymentalnej niż w grupie kontrolnej, jednak różnica nie była statystycznie istotna (Rysunek 5A). Równocześnie echo kardiografia nie wykazała istotnej różnicy w f...

Dyskusja

Układ limfatyczny serca stanowi kluczowy element utrzymania homeostazy płynów tkankowych oraz wspierania funkcji odpornościowej serca. Ułatwiając reabsorpcję płynu śródmiąższowego, transport lipidów oraz transport komórek odpornościowych, zapewnia się funkcjonowanie serca zarówno w warunkach fizjologicznych, jak i patologicznych. W ostatnich latach rosnące dowody podkreślają kluczowe zaangażowanie układu limfatycznego serca w liczne choroby sercowo-naczyniowe, takie jak zawał mięśnia sercowego, niewydolność serca czy prz...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Pióro elektrokoagulacyjne	Weitai	V70
Mikroskopowe kleszcze	Jinzhong	WA3030
Mikroskopowe kleszcze	Jinzhong	WA2040
Uchwyt na igły mikroskopowy	Jinzhong	YZE010
Uchwyt na igły mikroskopowy	Jinzhong	YZE020
Nożyczki mikroskopowe	Jinzhong	YBC010
Nożyczki mikroskopowe	Jinzhong	YBC020
Uchwyt na igły	Jinzhong	J32010
Nożyczki	Jinzhong	Y00010
Respirator dla małych zwierząt	Zhuodi	DW-300