W tym artykule opisaliśmy powtarzalny, kontrolowany temperaturą protokół dla spektroskopii rezonansu magnetycznego fosforu-31 ex vivo , umożliwiający seryjną, ilościową ocenę energetyki mięśnia sercowego podczas zachowania narządów.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
* These authors contributed equally
W tym artykule opisaliśmy powtarzalny, kontrolowany temperaturą protokół dla spektroskopii rezonansu magnetycznego fosforu-31 ex vivo , umożliwiający seryjną, ilościową ocenę energetyki mięśnia sercowego podczas zachowania narządów.
Niezawodna konserwacja narządów jest kluczowa dla zwiększenia dostępności dawców i poprawy wyników przeszczepów. Chociaż statyczne przechowywanie pozostaje standardem dla serca dawcy, istnieje potrzeba precyzyjnych metod monitorowania energii mięśnia sercowego podczas konserwacji.
Spektroskopia rezonansu magnetycznego-31 (31P MRS) umożliwia bezpośrednie, dynamiczne pomiary kluczowych metabolitów energii, w tym fosfokreatyny (PCr), adeninozynotrifosforanu (ATP), nieorganicznego fosforanu (Pi) oraz pH wewnątrzkomórkowego. Technika ta pozwala na podłużną, ilościową i precyzyjną ocenę stanu metabolicznego mięśnia sercowego podczas przechowywania ex vivo . Zalety MRS obejmują dynamiczną ocenę stanu energetycznego oraz globalną ocenę energii komory.
Protokół rozpoczyna się od odzyskania od dawcy świń, podania kardioplegii oraz kardiotektomii. Łuk aorty jest przecięty blisko pnia ramiennogłowego, aby zmaksymalizować długość aorty wstępującej. Żebrowana kanyla jest mocowana w dalszej aorcie wstępującej, lewy przedsionek jest oznaczany, a serce umieszczane jest w cylindrycznym, izolowanym pojemniku z dodatkiem kardioplegii specyficznej dla temperatury. Pokrywka łączy się z kaniulą, zawieszając serce w środku, a pojemnik jest szczelnie zamknięty, utrzymując temperaturę w granicach 1 °C przez 1 godzinę.
Pojemnik umieszczany jest w dopasowanym pudełku ze styropianu z otworem na cewkę strojoną fosforowo, ustawiając środek cewki do środka lewej komory (LV). Zdjęcia Scout potwierdzają położenie LV w pobliżu cewki 31P. Podkładanie B0 zapewnia równomierne wzbudzanie, po czym następuje uzyskanie nielokalnego widma MR 31P. Postprocessing identyfikuje piki widmowe do obliczania PCr/ATP, stosunków PCr/Pi oraz pH wewnątrzkomórkowego.
W naszym protokole 31P MRS jest wykonywane w punktach szeregowych między h 0 a 8. Między punktami czasowymi serce jest przechowywane w standardowym urządzeniu magazynującym w pożądanej temperaturze.
31P MRS pozwoliło nam badać zależne od czasu zmiany wyczerpania energii oraz rolę temperatury magazynowania w ograniczaniu wyczerpywania energii w czasie.
Przeszczep serca pozostaje ostatecznym leczeniem dla wybranych pacjentów z końcowym stadium niewydolności serca1. Jednak utrzymujący się niedobór odpowiednich narządów dawcy oraz ograniczenia obecnych strategii zachowania są głównymi barierami dla optymalnych wyników i zwiększonej dostępności przeszczepów 2,3. Tradycyjnie serca dawcy są konserwowane przy użyciu zimnego, statycznego magazynowania, co jest proste i opłacalne, ale jest podatne na podkliniczne wyczerpanie energetyczne podczas długotrwałego transportu 2,4. W miarę jak programy coraz częściej akceptują narządy o wyższym ryzyku i geograficznie odległe, rośnie zapotrzebowanie na obiektywne narzędzia charakteryzujące stan metaboliczny mięśnia sercowego podczas konserwacji, zamiast polegać wyłącznie na czasie niedokrwiennym i ogólnej inspekcji 5,6,7. Ponadto metabolizm mięśnia sercowego i tolerancja niedokrwienna są silnie zależne od temperatury, a zarówno niewystarczające chłodzenie, jak i nadmierna hipotermia mogą pogłębiać wyczerpanie energetyczne i uszkodzenia komórek podczas magazynowania. Ocena serca dawcy w wielu klinicznie istotnych temperaturach konserwacyjnych pomaga więc zidentyfikować stany najlepiej utrzymujące żywotność mięśnia sercowego w czasie3.
Dokładna, dynamiczna ocena bioenergetyczności mięśnia sercowego podczas przechowywania jest niezbędna do ulepszania technik konserwacji i maksymalnego wykorzystania narządów. Obecnie standardowa praktyka opiera się na statycznym przechowywaniu w chłodni w temperaturach około 4-8 °C8. Chociaż protokół ten wykazał sukcesy w krótkich okresach przechowywania, długotrwałe przechowywanie w tej temperaturze może zagrozić integralności mięśnia sercowego. Dlatego niezbędne jest przeprowadzanie seryjnego pomiarów aktywności metabolycznej w zakresie temperatur i czasów, aby określić optymalne warunki przechowywania niezbędne do pomyślnego przeszczepu narządu. Konwencjonalna ocena urazów zachowawczych często opiera się na badaniu histologicznym lub testach biochemicznych z biopsji mięśnia sercowego, które są inwazyjne, destrukcyjne i dostarczają jedynie przerywanych, regionalnych zdjęć statusu tkanek9. Natomiast spektroskopia rezonansu magnetycznego-fosfor-31 (31P MRS) to potężna, nieniszczycielska metoda umożliwiająca bezpośrednie, seryjne pomiary kluczowych metabolitów energii, w tym fosfokreatyny (PCr), trójfosforanu adenozyny (ATP), fosforanu nieorganicznego (Pi) oraz pH wewnątrzkomórkowego, w nienaruszonej tkance sercowej 6,10,11,12 . Umożliwiając powtarzane pomiary w tym samym narządzie bez dodatkowej manipulacji tkankami, 31P MRS dostarcza globalnych i podłużnych informacji o stanie energetycznym mięśnia sercowego, zwiększając precyzję eksperymentalną i powtarzalność w porównaniu z podejściami opartymi na biopsji lub surogat surowicy 6,13.
Ocena żywotności przeszczepu serca przy MRS 31P została przeanalizowana przez Bernarda i in.14. Przedstawiono tutaj szczegółowy, kontrolowany protokół MRS ex vivo 3 Tesla 31P serca świń podczas konserwacji. Metoda ta stanowi praktyczne ramy do monitorowania wyczerpywania podłoża, testowania zmiennych magazynowych oraz weryfikacji interwencji konserwacyjnych. Protokół ten jest szczególnie odpowiedni dla laboratoriów, które poszukują seryjnych, całkomorowych pomiarów podczas statycznego przechowywania w zimnie, takich jak badania konserwowania zależnego od temperatury, urazów niedokrwieniowo-reperfuzji lub optymalizacji roztworów dla serc dawców o marginalnych i rozszerzonych kryteriach.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół ten jest zgodny z wytycznymi instytucjonalnej opieki nad zwierzętami i został zatwierdzony przez Komitet ds. Opieki i Użycia Zwierząt Johns Hopkins (Protokół numer SW24M319) dla wszystkich procedur z udziałem żywych zwierząt, w tym chirurgicznego pobrania. Wszystkie kolejne eksperymenty ex vivo przeprowadzono na tkankach pobranych po eutanazji.
1. Procedura przedżalna
2. Procedura zbioru
3. Protokół spektroskopii
4. Analiza danych
5. Równania

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Zlokalizowane podłożenie2. rzędu16 skutkowało bardziej jednorodnym polem magnetycznym B0 w obszarze zainteresowania, co jest wskazane przez zmniejszenie odchylenia standardowego w każdym punkcie czasowym (0 h: 14,0 do 4,0 Hz; 4 h: 17,5 do 3,2 Hz; 8 h: 16,0 do 3,2 Hz). Zapewniało to, że w każdym momencie osiągano doskonałą jakość widmową (rysunek 7). Zmiany metaboliczne mięśnia sercowego podczas magazynowania zimna ex vivo wskazują na szy...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Niniejszy manuskrypt opisuje przygotowanie chirurgiczne oraz protokół pozyskiwania i analizy MRS 31P do seryjnej oceny energetyki mięśnia sercowego podczas zachowania serca. 31P MRS umożliwia seryjną, niedestrukcyjną ocenę kluczowych metabolitów serca w różnych temperaturach magazynowania w chłodzie, co dostarcza nowatorskich informacji na temat metabolicznej żywotności tkanki mięśniowej. Ten protokół MRS 31P jest stosunkowo szybki, wymaga minimalnego czasu na obserwacji, co pozwala oceni...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Nie mamy żadnego konfliktu interesów.
Chcemy podziękować naszemu zespołowi w Johns Hopkins w dziale chirurgii kardiochirurgii i radiologii, który pomoże w pomyślnym przeprowadzeniu tych badań. Badanie to zostało sfinansowane przez Amerykańskie Stowarzyszenie Chirurgii Klatki Piersiowej (AATS).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Inkubator | Benchmark Scientific | H2265-HC | Inkubator chłodzenia podgrzewczym MyTemp 65HC |
| Chłodnica izolacyjna | Gatorade | UPC 052000047097 | Chłodnica do napojów Gatorade Insulated Sport |
| jMRUI wersja 7.0 | Java | www.jmrui.eu | Graficzny interfejs użytkownika do analizy danych |
| Sonda temperatury mięśnia sercowego | DeRoyal | 81-030415 | Sonda temperatury mięśnia sercowego serii DeRoyal 400 (15 mm) |
| Skaner rezonansu magnetycznego | Philips | https://www.philips.com/healthcare/diagnostic-imaging/magnetic-resonance-imaging | Achieva 3T, Philips Healthcare |
| Jednopętlowa cewka fosforowa | Philips Healthcare | https://www.philips.com/healthcare/diagnostic-imaging/magnetic-resonance-imaging | P140, Philips Healthcare |
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Ten artykuł został opublikowany
Film wkrótce dostępny