Metoda interakcji chromatyny DNA z DNA związanej z RNA

Podsumowanie

Przedstawiamy tutaj protokół umożliwiający wychwycenie interakcji chromatyny DNA z RNA w celu mapowania trójwymiarowej organizacji genomu powiązanej z RNA.

Streszczenie

Metoda interakcji chromatyny DNA z RNA (RDD) to ukierunkowana strategia mapowania interakcji chromatynowych opartych na konkretnym RNA. Jednocześnie identyfikuje loci genomowe związane z interesującym RNA oraz rozwiązuje dalekosiężne kontakty DNA-DNA między tymi loci, umożliwiając wnioskowanie o organizacji przestrzennej i relacjach regulacyjnych. W RDD biotinylowane sondy antysensowne uzupełniające docelowe RNA są stosowane do wzbogacania kompleksów RNA-chromatyny. Komórki są sieciowane, chromatyna jest fragmentowana i naprawiana na końcach, a ligacja bliskościowa przeprowadza się za pomocą zaprojektowanego linkera, który łączy fragmenty DNA sąsiadujące przestrzennie w przechwytywych kompleksach. Produkty ligacji są oczyszczane, przekształcane w biblioteki sekwencjonowania i analizowane przez sekwencjonowanie o wysokiej przepustowości w celu wygenerowania map interakcji zakotwiczonych w RNA. RDD jest stosowany zarówno do endogennych RNA, jak i egzogennych RNA pochodzących od mikroorganizmów i wirusów infekujących gospodarza, a także jest kompatybilny z różnymi typami komórek i warunkami doświadczalnymi. Metoda ta zapewnia specyficzne dla locus, wysokorozdzielcze profile kontaktów odpowiednie do rozkładania parowania enhancer-promotor, regulacji na długi zasięg oraz trójwymiarowej architektury genomu związanej z kodowaniem regulacyjnym i niekodującymi RNA. Integrując wzbogacenie biochemiczne z ligacją bliskościową i sekwencjonowaniem nowej generacji, RDD zapewnia solidny i powtarzalny przepływ pracy, który pozwala ujawnić, jak RNA organizują chromatynę i wpływają na ekspresję genów.

Wprowadzenie

Hi-C i ChIA-PET zrewolucjonizowały badania nad trójwymiarową (3D) organizacją genomu, przekształcając przestrzenną bliskość fragmentów chromatyny w kowalencyjne połączenia DNA, które można sekwencjonować, aby wnioskować o fizycznych kontaktach na skalach od pętli po przedziały ^1,2. Poza białkami, liczne RNA uczestniczą w interakcjach chromatynowych i wpływających na komunikację wzmacniacz/represor-promotor oraz organizację wyższego rzędu chromatyny³; jednak pomimo postępów w testach opartych na białkach, nadal trudno jest bezpośrednio określić, jak konkretne RNA organizuje interakcje DNA-DNA na odległość między swoimi locusami wiązanymi. Nadrzędnym celem metody interakcji chromatyny DNA-DNA (RDD)⁴ z RNA jest wygenerowanie wysokorozdzielczych, zakotwiczonych w RNA map interakcji chromatyny, które ujawniają, jak określony gatunek RNA wiąże się z chromatyną i koordynuje kontakty DNA-DNA w swoim lokalnym sąsiedztwie, umożliwiając mechanistyczne wnioski dotyczące komunikacji wzmacniacz/represor-promotor oraz wyższej architektury genomu skoncentrowanej na tym RNA⁵. Metodologicznie RDD wzbogaca połączone kompleksy RNA-chromatyny biotinylowanymi sondami antysensownymi przeciwko interesującemu się RNA, przeprowadza złożoną ligację bliskości z zaprojektowanym linkerem do łączenia przestrzennie sąsiadujących fragmentów DNA oraz konstruuje biblioteki sekwencjonowania, aby uzyskać profile kontaktów specyficzne dla locus, odpowiednie do analiz opartych na hipotezie w różnych typach komórek i stanach, w tym w kontekstach obejmujących egzogenne bakteryjne lub wirusowe RNA w zakażonych gospodarzach. Te cechy pozycjonują RDD jako odpowiednik RNA dla ustalonych metod konformacji chromosomów, dostarczając interpretowalnych informacji kontaktowych w rozdzielczości odpowiednich do analizy regulacyjnej.

Uzasadnienie RDD wynika z ograniczeń istniejących strategii mapowania RNA-chromatyny. Metody ukierunkowanego przechwytu, takie jak ChIRP-seq i CHART-seq, identyfikują obecność DNA w całym genomie pojedynczego RNA, czyli jedno RNA do całego DNA, które raportuje wiązanie, ale nie fizyczne kontakty DNA-DNA między zajętymi^{loci 6,7}. Badania globalne, w tym GRID-seq i MARGI, obejmowały wszystkie RNA i całe DNA, katalogując bliskość RNA-DNA w całym genomie, ale nie wykazując wyraźnej rozdzielczości kontaktów DNA-DNA w kompleksach centrowanych na RNA ^3,8. Metody multipleksowane, takie jak RD-SPRITE, zgłaszają wyższą współlokalizację między wieloma RNA i loci DNA oraz przekazują aspekty topologii jądrowej⁹, jednak sygnały są zazwyczaj zdominowane przez obfite RNA, które mogą zaciemniać RNA regulacyjne o niskiej ilości i ograniczać docelową głębokość sieci interakcji pojedynczego RNA. Strategie wzbogacenia plus ligacji oparte na białkach lub markach, takie jak ChIA-PET¹⁰,^{PLAC-seq 11} i HiChIP¹², skutecznie mapują pętle skoncentrowane na czynniku, ale nie zakotwiczają interakcji w zdefiniowanym RNA bez modułu chwytania specyficznego dla RNA, pozostawiając wymiar DNA-DNA zakotwiczony w RNA nierozwiązany. Integrując ukierunkowane wzbogacenie biochemiczne z ligacją bliskości na złożonym, RDD bezpośrednio rejestruje kontakty DNA-DNA wśród fragmentów chromatyny współzajętych przez interesujące RNA⁴, zwiększa czułość i swoistość dla RNA o niskiej i umiarkowanej obfitości oraz generuje wysokorozdzielcze, specyficzne dla locus mapy kontaktów, które uzupełniają globalne metody skoncentrowane na obsadzeniu (ChIRP/CHART)^6,7 oraz globalne metody skoncentrowane na bliskości (GRID-seq/MARGI/RD-SPRITE^{)3, 8,9}, jednocześnie koncepcyjnie równolegle do strategii ligacji opartej na czynnikach białkowych (ChIA-PET/PLAC-seq/HiChIP)10,11,12. Czytelnicy powinni rozważyć RDD, gdy pytanie biologiczne wymaga wyjaśnienia relacji przestrzennych między loci chromatyny specyficznie powiązanymi z docelowym RNA — szczególnie gdy hipoteza, że RNA to ma za zadanie wspierać, mostkować lub ograniczać dalekosiężne interakcje genomowe w celu dostrojenia transkrypcji — lub gdy priorytetowo przyjmuje potencjalne cele regulacyjne względem zestawu wiązań RNA, odróżniając bezpośrednio skoncentrowane na RNA huby od zwykłej współokupacji, wyznaczanie sieci wzmacniaczy/represorów dla konkretnych RNA lub śledzenie przeprogramowania kontaktów zakotwiczonych w RNA pomiędzy zaburzeniami, etapami rozwojowymi lub infekcjami. W takich sytuacjach RDD odpowiada na niezaspokojoną potrzebę, dostarczając informacje o interakcji DNA-DNA zakotwiczone w RNA z czułością, swoistością i rozdzielczością niezbędną do rygorystycznych badań mechanistycznych.

Protokół

UWAGA: W tej metodzie RDD przykładowy system wykorzystuje komórki Drosophila S2 oraz zarówno ncRNA roX2 , jak i 7SK ; reagenty reakcyjne wymieniono w Tabeli 1, skład buforu w Tabeli 2, szczegóły odczynników i instrumentów w Materiałach . Rysunek 1 przedstawia przegląd protokołu generowania bibliotek RDD. Procedury obrotu (F8) wykorzystują następujące parametry: F8, 20 rpm, uu20 i UU30. Dla wszystkich buforów używanych od Step 2 do Step 10, świeżo uzupełniaj inhibitorem proteinazy 1x (PI) i inhibitorem RNazy (RI, 0,05 U/μL).

Zasady projektowania sond: Dla nowatorskich, niezgłoszonych RNA, wykonuj sondy projektowe online za pomocą Stellaris Probe Designer, następnie filtruj niespecyficzne sekwencje za pomocą narzędzi do wyrównywania (np. wyrównanie podobne do BLAST) lub UCSC BLAT, a następnie wykonuj 3′-biotynowalację wybranych sond. Dla nowych RNA docelowych zaprojektuj sekwencje odpowiadające RNA docelowemu jako negatywne kontrole, również poddawane 3′-biotynowaniu. Kontrola jakości polega na projektowaniu primerów odwrotnej transkrypcji względem docelowego RNA do walidacji transkrypcji oraz primerów ukierunkowanych na genomowe DNA do qPCR w celu oceny skażenia; Uwzględnij primery lokalizujące miejsca wiązania genomowego i obszary niewiążące, aby ocenić specyficzność wiązania. sondy związane z roX2 i 7SK przedstawiono w Tabeli 1.

1. Pobieranie komórek i podwójne sieciowanie

1. Hodować komórki Drosophila S2 w temperaturze 27 °C. Celować w zgromadzenie około 3 x 10^{9 komórek} . Bezpośrednio zawiesz komórki w pożywce hodowlowej, a po liczeniu Trypan-blue zaznacz^{8 x} 10 komórek do każdej stożkowej rurki wirówki o pojemności 50 mL.
   1. Wymieszaj 2 μL komórek z 8 μL DPBS, dodaj 10 μL Trypan Blue, a następnie załaduj do hemocytometru do liczenia komórek.
      UWAGA: Komórki Drosophila S2 przedstawione są jako przykład. Zazwyczaj^{8 x} 10 8 komórek odpowiada około 40 mL objętości hodowli przetwarzanej w pojedynczej stożkowej probówce o pojemności 50 mL. Użytkownicy mogą dostosowywać warunki hodowli i pobierać ilości komórek zgodnie z typem komórek oraz liczebnością docelowego RNA.
2. Dodaj formaldehyd do końcowego stężenia 1% (w/v) i obróć w temperaturze 27 °C przez 20 minut.
   UWAGA: Fiksację wykonuj w temperaturze hodowli lub w temperaturze pokojowej (RT; 20-25°C). Jeśli nie zaznaczono inaczej, obróć mikser (F1, 12 rpm). Do komórek przylegających użyj wstrząsania oczodołowego (50 obr./min).
   UWAGA: Formaldehyd jest toksyczny; Użyj okapu oparowego.
3. Komórki granulkowe 845 x g przez 5 minut w RT; Zrzucaj supernatant do odpowiednich odpadów chemicznych/biologicznych. Pellet komórkowy z 8 x 10 komórek 8 S2 ma zazwyczaj około 1 cm³ objętości.
4. Ponownie zawiesić granulkę w świeżo przygotowanej 2 mM EGS do całkowitej objętości 40 mL w DPBS i obrócić w temperaturze 27 °C przez 40 minut.
   UWAGA: Rozpuść EGS w DMSO i przenieść do DPBS (patrz Tabela 2). EGS w DMSO jest niebezpieczny.
5. Hartuj przez dodanie 2 mL 2,5 M glicyny (końcowe 0,125 M); obróć w temperaturze 27 °C przez 10 minut.
6. Śrut 845 x g przez 5 minut w RT; Zrzucaj supernatant do odpowiednich odpadów chemicznych/biologicznych. Opłucz pellet dwukrotnie 40 mL podgrzanego DPBS w temperaturze 27 °C.
7. Pellet w dawce 845 x g przez 5 minut. Ponownie zawiesij pellet komórkowy w 10 mL DPBS i policz komórki. Liczba komórek może spadać podczas procesu sieciowania, zazwyczaj o około 30%.
8. Umieść 1 x 10⁹ ogniw do każdej probówki o pojemności 50 mL; granulacja 845 x g przez 5 minut w RT; Usuń supernatant. Przechowuj pellety w temperaturze −80 °C.
   UWAGA: Wszystkie poniższe kroki reakcji dotyczą jednej biblioteki RDD.

2. Liza komórek i permeabilizacja jąder

1. Z zamrażarki o temperaturze −80 °C wyjmij 1 x 10 9 S2 ogniw podwójnie usieciowanych. Rozmrażaj na wodzie lodowatej przez 30 minut.
2. Ponownie zawiesić ogniwa w 50 mL DPBS, wirować w 845 x g przez 5 minut w RT i wyrzucić supernatant.
3. Liza komórek: Ponownie zawiesić osad komórkowy w 20 mL buforu lizyzującego 0,1% FA (bez Triton X-100). Rotuj na RT przez 15 minut. Sprawdzam za pomocą mikroskopu; Dostosuj czas według typu komórki. Udana liza jest widoczna przez przepuszczalność błony plazmatycznej i uwalnianie cytoplazmatyczne, dzięki czemu jądra stają się łatwo widoczne jako odrębne struktury pod standardowym mikroskopem świetlnym (Rysunek 2A).
4. Permeabilizacja jąder: Dodaj 1,8 mL 10% SDS (ostateczne 1%). Obróć w temperaturze 37 °C przez 15 minut. Wiruj w 3 200 x g przez 20 minut w RT i odrzucaj supernatant. Kontrola mikroskopem (Rysunek 2B); Dostosuj czas według typu komórki. Jądra wydają się ciemniejsze, przypominają błonową zasłonę lub niektóre są odłączone. Powtarzaj, aż liza będzie zakończona.
5. Płukanie jądrowe: Ponownie zawiesić pellet w buforze lizy 0,1% FA o pojemności 20 mL (bez Triton X-100), obróć w RT przez 10 minut, następnie wirować w 3 200 x g przez 20 minut w RT, odrzucić supernatant i zaznaczyć wielkość granulek jądrowych. Przechowuj jądrowe granulki w temperaturze −80 °C do późniejszego użycia.

3. Fragmentacja chromatyny

1. Ponownie zawiesij jądro w 15 mL buforu lizyzującego 0,1% FA (z Triton X-100). Wystarczy 1,5 mL zawiesiny jąder do każdej probówki o pojemności 14 ml z okrągłym dnem, unikając powstawania pęcherzyków.
   1. Zaznacz rozmiar pelletu przed sonikacją dla porównania i powtórz sonikację, jeśli granulek pozostaje duży po sonikacji.
2. Sonikat z amplitudą 38% przez 4,5 minuty, z cyklami 30 sekund WŁĄCZONY / 30 sekund WYŁĄCZONY. Zbierz całą sonikowaną chromatynę do probówki 15 mL i wiruj w 3 200 x g przez 20 minut w RT, a następnie przelej supernatant (~13 mL) do nowej probówki 15 mL.

4. Chromatyna przedprzezroczysta z kulkami C1

1. Przygotuj koraliki Streptavidin C1: Nalej 400 μL kulek Streptavidin C1 do probówki o pojemności 1,5 mL (100 μL na 1 × 10 9 komórek S2), umieść na magnesie na 30 sekund i usuń supernatant. Dwukrotnie przemyj 200 μL buforu lizyzowego 0,1% FA (z Triton X-100), następnie ponownie zawiesz 100 μL buforu lizy 0,1% FA (z Triton X-100).
2. Chromatyna preclear: Dodaj 100 μL przygotowanych kulek Streptawidyny C1 do probówki zawierającej ~13 mL sonikowanego supernatantu chromatyny (od kroku 3.2); rotacja o 20 minut na RT; umieść na magnetycznym stojaku na 1 minutę i przelej supernatant (wstępnie oczyszczoną chromatynę) do nowych lamp 50 mL; weź 10 μL i przechowuj w temperaturze −20 °C dla QC1 (Rysunek 3A).

5. Hybrydyzuj sondę RNA z wcześniej oczyszczoną chromatyną

1. Dodaj 2 objętości (26 mL) świeżo przygotowanego buforu hybrydyzacyjnego do 1 objętości (13 mL) wstępnie oczyszczonej chromatyny; rotuj o 30 minut na RT.
2. Zrób mieszankę w trzech probówkach po 15 mL; do każdej próbki dodano 6 μL sond biotinylowanych 100 μM (oligonukleotyd DNA, Tabela 1) (2 μL na probówkę 15 mL); rotować w 37 °C w nocy. Uszczelnij nakrętki na rurkach folią.

6. Sonda unieruchomiająca – kompleks chromatyny na kulkach C1

1. Kulki blokowe Streptawidyny C1 z buforem blokującym: Weź 400 μL świeżych kulek streptawidyny C1 i myj dwa razy 800 μL buforu lizyzującego 0,1% FA (bez Triton X-100); dodaj 400 μL buforu blokującego i inkubuj na mieszaczu (F8) przez 30 minut w RT. Umieść magnes na 10 minut i wyrzuć supernatant; myj trzy razy z 800 μL buforu lizy 0,1% FA (bez Triton X-100). Przy każdym płukaniu delikatnie pipetuj do mieszania, przyłóż magnes na co najmniej 30 sekund, a następnie wyrzuć supernatant.
2. Ponownie zawiesić kulki C1 w 400 μL buforu hybrydyzacyjnego.
3. Unieruchomić kompleks sondy i chromatyny na kulkach Streptawidyny C1: Dodaj kulki streptawidyny C1 traktowane Blocking Buffer do odpowiadającej chromatyny hybrydyzowanej i obróć przez 2,5 godziny w RT.
4. Przenieś reakcję unieruchomienia z lamp 15 mL do rurki 1,5 mL za pomocą magnetycznego stojaka. Umieść każdą probówkę 15 mL na magnetycznym stojaku na 5 minut; Usuń supernatant. Ponownie zawiesz kulki z 1 mL buforu Wash i przelej do nowej probówki 1,5 mL.
5. Przemyj kulki pięć razy 800 μL buforu myjącego, a następnie dwa razy buforem TE. Do mycia dodaj bufor, inkubuj na mikserze (F1, 12 obr./min) przez 5 minut w 37 °C, umieść na magnetycznym stojaku na 30 sekund i wyrzuć supernatant.
6. Trzymaj kulki w 1000 μL bufora TE (1x PI) w stanie RT.

7. Blokowanie niezajętych miejsc na kulkach C1 za pomocą zdenaturowanej jodoacetylo-PEG2-Biotyny (IPB)

1. Rozpuścić 4,8 mg IPB w 400 μL buforu IPB Wash; rotuj na RT przez 15 minut.
2. Rozwiązanie β-ME: Dodaj 1 μL β-ME do 312 μL H₂O; Mieszaj i rotuj na RT przez 15 minut.
3. Denaturacja IPB: Dodaj 44 μL roztworu β-ME do 400 μL IPB; Mieszaj i rotuj na RT przez 15 minut.
4. Blokuj kulki C1: Dodaj 220 μL zdenaturowanego IPB do kulek C1 związanych z kompleksem sondy chromatyny (w 1 000 μL TE); rotuj na RT przez 15 minut.
5. Umyj koraliki C1 TE pięć razy. Dodaj bufor, inkubuj na mikserze (F8) przez 5 minut w RT, następnie umieść na magnetycznym stojaku przez 30 sekund i wyrzuć supernatant.

8. Naprawa końców chromatyny (na koralikach)

1. Dodaj 693 μL mieszanki naprawczej do chromatyny na kulkach C1 i dobrze wymieszaj; następnie dodaj 7 μL polimerazy DNA T4.
2. Inkubuj na termomikserze (800 obr./min) w temperaturze 12 °C przez 30 minut; następnie na mikserze (F8) w 16 °C przez 15 minut.
3. Trzykrotnie umyj kulki 800 μL lodowatego bufora ChIA-PET, a następnie raz TE. Przy każdym płukaniu delikatnie pipetuj do mieszania, przyłóż magnes na co najmniej 30 sekund, a następnie wyrzuć supernatant.

9. Chromatynowa A-tailing (na koralikach)

1. Dodaj 693 μL mieszanki A-tailing do chromatyny na kulkach C1 i dobrze wymieszaj, następnie dodaj 7 μL fragmentu Klenowa (3'-5' exo-).
2. Inkubuj na mikserze (F1, 12 obr./min) w 37 °C przez 50 minut. Przemyj kulki trzy razy 800 μL lodowatego bufora ChIA-PET, a następnie raz buforem elucijnym.

10. Wiązanie zbliżeniowe chromatyny (na koralikach)

1. Dodaj 1 390 μL mieszanki wiązającej bliskości do chromatyny na kulkach C1. Inkubuj na mikserze (F8) na RT przez 5 minut.
2. Następnie dodaj 10 μL ligazy DNA T4. Rotuj mikser (F8) na RT przez 5 minut, potem przełącz na F1 (12 rpm) na RT przez 50 minut, a potem 16 °C przez noc.
3. Przemyj kulki trzy razy 800 μL lodowatego bufora ChIA-PET, a następnie dwa razy buforem TE.

11. Uwalnianie chromatynowego DNA z blizkich wiązań z kulek C1

1. Dodaj 480 μL buforu elucijnego LC ChIP do chromatyny na kulkach C1, dobrze wymieszaj i dodaj 20 μL proteinazy K o stężeniu 20 mg/mL do odłączenia sieci.
2. Inkubuj na termomieszaczu (950 obr./min) w 65 °C przez noc.

12. Oczyszczanie DNA z ligowaniem bliskim (za pomocą fenolu: chloroformu: odczynników IAA)

1. Obróć rurę fazową o wysokiej gęstości w napięciu 13 500 x g przez 2 minuty w RT. Dodaj produkty odsieciowane (500 μL) do rury o wysokiej gęstości fazowej blokady.
2. Dodaj 500 μL fenol:chloroform:IAA (używając 5 mL końcówki pipety) do rurki o wysokiej gęstości fazowego blokowania. Delikatnie mieszaj ręcznie.
   UWAGA: Ćwicz w okapie spalinowym.
3. Wirówka w 13 500 x g przez 6 minut w stanie RT. Podczas wirowania przygotuj probówkę o pojemności 1,5 mL, dodając 52 μL 3 M octana sodu (pH 5,5) na dno. Nałóż 1 μL glikogenu z niebieskim barwnikiem na nakrętkę. Nie mieszaj ani nie zamykaj rurki w tym momencie.
4. Szybko przelej supernatant z rurki fazowej o wysokiej gęstości do przygotowanej rurki 1,5 mL.
5. Dodaj 520 μL lodowatego izopropanolu do rurki o pojemności 1,5 mL. Delikatnie wymieszaj, a następnie umieść w temperaturze -80 °C przez noc.
6. Wyjmij rurkę z temperatury -80 °C i rozmraź przy RT (~10 min). Wirować w 13 500 x g przez ~1 godzinę w 4 °C, aby wytrącić DNA. Na dnie rurki pojawi się niebieski osad.
7. Przemyj granulkę DNA 75% etanolem i ostrożnie usuń supernatant. Dodaj 800 μL 75% etanolu lodowatego, wiruj w 13 500 x g przez 5 minut w 4 °C i usuń supernatant. Powtórz mycie etanolem raz.
   UWAGA: Usuń supernatant natychmiast po wirówce: najpierw końcówką 1 mL, potem końcówką 100 μL. Ciepłe rurki mogą wypchnąć niebieski pellet.
8. Po ostatnim przemyciu etanolem wiruj w 13 500 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C, aby zebrać resztki etanolu na dnie, a następnie ostrożnie usuń pozostały etanol.
9. Susz granulat DNA w próżni (zazwyczaj 1 min 30 s do 2 min). Ponownie zawiesij pellet DNA w 10 μL buforu elucijnego i inkubuj w RT przez około 2 godziny. Ilościowo zmierz DNA za pomocą kwantyfikatora kwasów nukleinowych i oceniaj jakość za pomocą automatycznego systemu elektroforezy kapilarnej (Rysunek 3B-C).

13. Oznaczenie DNA Tn5 z ligowaniem bliskości

1. Testowanie tagmentacji Tn5: Przygotuj całkowitą objętość reakcji 50 μL zgodnie z Tabelą 1. W probówce PCR na lodzie kolejno dodaj 50 ng DNA QC1, ddH₂O oraz 12,5 μL buforu 4x tagmentacyjnego. Na koniec dodaj wymaganą ilość enzymu Tn5. Mieszaj delikatnie, pipetując pipetami 10 do 20 razy po każdym dodaniu, unikając powstawania bąbelków. Krótko skręcaj w dół rury, jeśli trzeba.
   UWAGA: Delikatne mieszanie i unikanie bąbelków jest kluczowe dla tagowania. Dodatkowo ilość Tn5 powinna być empirycznie zoptymalizowana, aby osiągnąć pożądany rozkład fragmentów (głównie 200 bp-1 kb), a użytkownicy mogą regulować zakres rozmiarów, dostrojając wejście Tn5.
2. Reakcja tagmentacji: Inkubuj reakcję w temperaturze 55 °C przez 10 minut w przyrządzie PCR z pokrywką ustawioną na 70 °C, następnie utrzymuj ją w 4 °C.
3. Uwalnianie Tn5 i oczyszczanie DNA: Dodaj 50 μL buforu elucijnego ChIP oraz 1 μL Proteinazy K do oznaczonego DNA (co daje końcowe stężenie SDS 0,5%). Wymieszaj i inkubuj na termomikserze w temperaturze 65 °C i 900 obr./min przez 30 minut. Oczyść DNA zestawem do oczyszczania DNA i ilościowo określić DNA za pomocą automatycznego systemu elektroforezy kapilarnej (rysunek 3D).
   UWAGA: Na tym etapie fragmenty DNA powinny mieć przeważnie od 200 bp do 1 kb. Stosunek enzymów Tn5 do DNA powinien być empirycznie optymalizowany.
4. Skalowanie tagmentacji Tn5: Na podstawie wyników testów Tn5 zwiększ reakcję na DNA ligowane w bliskości, używając tych samych warunków. Po oznaczeniu usuń próbkę z instrumentu PCR i umieść ją w lodzie. Krótko zwalniamy obrot, inkubujemy w RT przez 2 minuty, następnie dodaję 5,5 μL 10% SDS (w/v; końcowe stężenie SDS: 1%). Mieszaj, pipetując pipetami 10 do 20 razy, unikając bąbelków, i krótko skręcaj. Inkubuj próbki w temperaturze 37 °C w przyrządzie PCR przez co najmniej 15 minut. Tagowane DNA można przechowywać w temperaturze -20 °C przez kilka dni.

14. Blokowanie koralików M280

1. Weź 20 μL kulek M280 i myj dwa razy z 200 μL 1x buforu czarno-białego. Do mycia dodaj bufor, ponownie zawiesz koraliki pipetowaniem, krótko obróć w dół, załóż magnes na 30 sekund i usuń supernatant.
2. Blokowanie kulek za pomocą bufora blokującego: Ponownie zawiesić kulki M280 w 100 μL bufora blokującego; rotuj na mikserze (F8) na RT przez 45 minut.
3. Mytnie kulkami: Krótko się obróć, umieść na magnesie na 10 minut i odrzuć bufor blokujący. Płucz kulki dwa razy z 200 μL buforu 2x czarno-białego.
4. Blokowanie kulek z DNA genomowego: Ponownie zawiesij kulki w 100 μL buforu 2x czarno-białego, dodaj 100 μL ścinanego DNA genomowego (~500 ng, 300-500 bp), dobrze wymieszaj i obróć na mikserze (F8) na RT przez 30 minut.
5. Usuń mieszankę DNA genomowego i myj koraliki dwukrotnie z 200 μL buforu czarno-białego 1x B&W.

15. Unieruchomienie podwiązanego DNA na koralikach M280

1. Wiązanie podwiązanego DNA z kulkami M280: Usuń 1x bufor czarno-biały. Dodaj całe rozfragmentowane, podwiązane DNA do kulek M280, wymieszaj i obróć na mikserze (F8) w RT przez 45 minut.
2. Krótko się zwalniaj, załóż na magnes i wyrzucaj supernatant. Zmywaj kulki pięć razy z 500 μL wcześniej podgrzanego buforu płukania w temperaturze 37 °C; raz z 500 μL 1x czarno-białego; a raz z 200 μL 1x czarno-białego. Umieść na magnesie na 1 minutę, delikatnie wymieszaj na dnie rurki i wyrzuć supernatant. Dodaj 30 μL bufora elucijnego do kulek (nie mieszaj).
   1. Do mycia dodaj bufor, inkubuj 5 minut na mikserze (F8), umieść magnes na 30 sekund, a następnie wyrzuć supernatant. Koraliki z powiązanym podwiązanym DNA można przechowywać w temperaturze -20 °C.

16. Amplifikacja ligowanego DNA na koralikach M280

1. Przygotuj reakcję PCR (zgodnie z zestawem do przygotowania biblioteki DNA). Przenieś lampy PCR do maszyny PCR i skonfiguruj program.
   UWAGA: Cykle amplifikacji PCR są kluczowe dla ostatecznej jakości biblioteki; zwiększenie liczby cykli zmniejsza złożoność biblioteki. Optymalizuje liczbę cykli empirycznie i zazwyczaj nie przekracza 15 cykli.
2. Oczyść produkt PCR za pomocą kulek magnetycznych (rysunek 3E). Wybór rozmiaru: Użyj (0,8-0,61) magnetycznych kulek do podwójnego wyboru rozmiaru biblioteki RDD.
   1. Ostateczna biblioteka DNA powinna przeważnie wahać się od 250 do 600 bp (rysunek 3F). Upewnij się, że 10-30 ng DNA bibliotecznego jest mierzonych za pomocą kwantyfikatora kwasów nukleinowych do sekwencjonowania.
3. Sekwencjonowanie: Subject do sekwencjonowania Illumina z 2x 150 bp. Głębokość sekwencjonowania zależy od ekspresji RNA, gęstości miejsc wiązania oraz wzorców obejmujących cały genom. Tutaj roX2 nasyca się przy ~23 mln odczytów, a 7SK przy ~8 M, więc ten drugi wymaga mniejszej głębokości. Zacznij od gatunku, a następnie oceń redundancję pod kątem większej głębokości: ~5M dla Drosophila, ~20M dla człowieka/myszy, dostosowując się do metryk QC.

Wyniki

Protokół ten opisuje metodę RDD do wykrywania interakcji chromatyny DNA z DNA powiązanej z RNA. Proces rozpoczyna się od biochemicznego wzbogacenia kompleksów RNA-chromatyny za pomocą biotinylowanych sond, a następnie następuje ligacja bliskościowa w celu połączenia przestrzennie sąsiadujących fragmentów DNA. Po zbudowaniu bibliotek sekwencjonowania wykonywane jest sekwencjonowanie o wysokiej przepustowości.

Analiza bioinformatyczna danych RDD jest usprawniona przez platformę^{ChIA-PIPE 13}. Kluczowe etapy w tym potoku analitycznym obejmują: przycinanie linkerów sekwencjonowania z surowych odczytów, mapowanie odczytów parowanych na genom referencyjnym, filtrowanie unikalnie mapowanych par odczytów, usuwanie duplikatów PCR oraz przypisywanie interakcji do wybranych miejsc RNA na podstawie współrzędnych sondy. Zazwyczaj około 50% sekwencjonowanych odczytów zostaje pomyślnie zachowywanych po filtrowaniu linkerów i jakości. Następnie agregowano ważne zdarzenia interakcji, aby wygenerować mapy kontaktów specyficzne dla locus, dostarczając szczegółowych profili architektury chromatyny kierowanej RNA. Dla danych RDD wdrożyliśmy trzy korekty ChIA-PIPE: sekwencja linkera RDD ("ACGCGATATCTCTCTGACT") została użyta zamiast domyślnego linkera ChIA-PET ("ACGCGATGGCTCTCTGACT"); klasteryzacja pętli wykonano ze skróconym rozszerzeniem PET o 50 bp oprócz domyślnych 500 bp, aby zwiększyć precyzję pozycyjnej miejsc interakcji RNA; a pokrycie wzbogacenia RNA było obliczane za pomocą deepTools (bamCoverage v3.5.1) przy użyciu pojemności 1 bp. Te modyfikacje konfiguracji linkera, zmniejszenie rozszerzenia PET dla precyzyjniejszego klastrowania oraz wysokiej rozdzielczości ChIA-PIPE do adaptacji pokrycia dla bibliotek RDD.

Rysunek 4 przedstawia reprezentatywne wyniki RDD dla dwóch niekodujących RNA: roX2¹⁴ (Rysunek 4A,C; zielony), kompleksowego RNA kompensującego dawkę zaangażowanego w regulację struktury chromosomu X i ekspresji genów u Drosophila, oraz 7SK¹⁵ (Rysunek 4B,D; fioletowy), wysoce zachowanego małego jądrowego RNA, które moduluje wydłużenie transkrypcji poprzez regulację aktywności P-TEFb u metazoów. Wiązanie RNA i interakcje chromatyny wykryte przez RDD są wizualizowane wraz z danymi RNAPII ChIA-PET (niebieskie łuki), podkreślając strukturalne powiązania między pętlami związanymi z RNA a kluczowymi elementami regulacyjnymi, takimi jak promotory (P), wzmacniacze (E) oraz miejsca startu lub końca transkrypcji (TSS/TES). Wyraźne szczyty interakcji w danych agregowanych wspierają model, w którym zarówno roX2, jak i 7SK pośredniczą w kontaktach z chromatyną krytycznego lub o długim zasięgu.

Analizę wielowymiarową uzyskuje się poprzez integrację interakcji zakotwiczonych w RDD z mapami konformacji chromatyny obejmującej cały genom Hi-C (czerwone mapy ciepła na dolnym panelu) oraz znakami epigenomicznymi (H3K27ac, H3K27me3), transkrypcją powstającą (RNA-seq) oraz danymi RNAPII ChIA-PET (rysunek 4C,D). W tych regionach topologicznie widoczne są domeny asocjacyjne (TAD), a pętle chromatynowe kierowane RNA często znajdują się na granicach TAD lub obejmują wiele TAD. Dodatkowe adnotacje z danymi z modyfikacji i transkrypcji histonów umożliwiają rozróżnienie między aktywnymi a nieaktywnymi regionami chromatyny. Kluczowe centry regulacyjne skoncentrowane na RNA są zakreślone na rysunku.

Dla różnych ncRNA wyłaniają się różne wzorce. roX2 charakteryzuje się wiązaniem w regionach TES oraz pętlami do TSS, często lokalizując się na granicach TAD i tworząc kontakty dalekiego zasięgu, które mogą przekraczać wiele TAD. Dla porównania, 7SK głównie wiąże się z wzmacniaczami i tworzy krótszy zasięg pętli z sąsiednimi promotorami, zazwyczaj bez przekraczania granic TAD.

Łącznie wyniki potwierdzają, że RDD jest niezawodną i wysokorozdzielczą metodą rozkładania specyficznej dla RNA organizacji chromatyny 3D. Takie podejście umożliwia bezpośrednie badania przestrzennych ról regulatorowych RNA w architekturze genomu i ekspresji genów w różnych środowiskach biologicznych.

Rysunek 1: Schemat procesu generowania bibliotek RDD. Centralne kroki workflow dotyczące generowania bibliotek RDD są przedstawione w sekwencji i opatrzone odpowiednimi schematami ilustracyjnymi. Procedura rozpoczyna się od podwójnego usieciowania i tagmentacji chromatyny, następnie następuje hybrydyzacja sondą RNA zmodyfikowaną biotyną oraz unieruchomienie za pomocą streptawidyny. Kolejne kroki obejmują A-tailing, ligację bliskości za pomocą linkerów modyfikowanych biotyną oraz budowę biblioteki. Po ligacji DNA przeprowadzane są oczyszczanie, fragmentacja pośredniczona Tn5, wzbogacenie biotyny oraz amplifikacja bibliotek. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.

Rysunek 2: Reprezentatywne obrazy mikroskopowe komórek Drosophila S2 pokazujące wizualne kryteria kontroli jakości dla lizy komórek i permeabilizacji jąder . (A) Udana liza komórek charakteryzuje się przepuszczalnością błony plazmatycznej i uwalnianiem cytoplazmatycznym, co czyni jądra łatwo widocznymi. (B) Udana permeabilizacja jąder jest widoczna przez obrzęk komórek, częściowe odwarstwienie błony plazmatycznej oraz nienaruszone, wyraźnie widoczne jądra. Pasek skali = 100 μm. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego wykresu.

Rysunek 3: Analiza elektroferograficzny preparatów chromatyny. Zrzut ekranu systemu elektroforezy kapilarnej profilujący różne próbki chromatyny. (A) Pokazuje fragmentowaną chromatynę (sonikację) o rozmiarze od około 1000 do 3000 bp, co wskazuje na udaną fragmentację. (B) Ilustruje chromatynę związaną z RNA (sondy związane z RNA + niezwiązane sondy), z mniejszym pikiem reprezentującym niezwiązane sondy, jak wskazuje strzałka. (C) Wykazuje chromatynę związaną z RNA, również wykazującą zakres stężeń od 1000 do 3000 bp, odzwierciedlającą kompleksy RNA-białka. (D) przedstawia chromatynę oznaczoną Tn5, ujawniając zakres wskazujący na efektywność tagmentacji. (E) Pokazuje rozkład wielkości fragmentów biblioteki sekwencjonującej po amplifikacji, obejmujący około 180-1000 bp. (F) Pokazuje rozkład rozmiarów fragmentów biblioteki sekwencjonującej po wyborze rozmiaru, z fragmentami wzbogaconymi głównie w zakresie ~250-600 bp. Wartości RFU (względne jednostki fluorescencji) są wskazywane dla każdej próbki, co pokazuje efektywną ilościową ilościowość integralności i rozmiaru chromatyny. Fioletowe szczyty symbolizują ten znak. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.

Rysunek 4: Reprezentatywne wyniki RDD dla interakcji chromatyny związanych z ncRNA. (A-B) Pokazuje lokalizacje genomowe wiązania ncRNA roX2 (zielone) i 7SK (fioletowe), wraz z odpowiadającymi odległymi pętlami interakcji chromatyny. Dane z RNAPII ChIA-PET (niebieski) pokazują wyraźną zależność regulacyjną między tymi ncRNA a ekspresją genów, z pikami wskazującymi na siłę interakcji. Skróty: TSS = miejsce rozpoczęcia transkrypcji; TES = końcowe miejsce transkrypcji; P = promotor; E = wzmacniacz. (C-D) Zapewnia wyższy wymiarowy obraz związku między pętlami chromatynowej i TAD powiązanymi z ncRNA roX2 i chromatycznymi z 7SK (czerwony), a także różnicami w stanach aktywnej i nieaktywnej chromatyny oraz poziomach ekspresji genów. Kręgi podkreślają obszary o istotnych interakcjach między TAD. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.

Tabela 1: Odczynniki reakcji RDD. Prosimy kliknąć tutaj, aby pobrać tę tabelę.

Tabela 2: Skład bufora RDD. Prosimy kliknąć tutaj, aby pobrać tę tabelę.

Dyskusja

Kluczowe kroki w metodzie
Szacowanie ilości sond RNA oraz odpowiadających im poziomów RNA w chromatynie jest kluczowe. Nadmiar sond może prowadzić do zajęcia miejsc w miejscach streptawidyny przez niezwiązane podczas etapu unieruchomienia, co może utrudnić zamierzone wychwycenie interakcji docelowego RNA. Dodatkowo, dodanie zbyt dużej ilości streptawidyny powoduje marnowanie materiałów i wymaga większej ilości zdenaturowanego IBP do skutecznego blokowania pustych terenów. Niewystarczające blokowanie może negatywnie wpłynąć na efektywność późniejszej ligacji bliskościowej, zwłaszcza że linker ligacji bliskości również posiada modyfikacje biotyny. Jeśli blokowanie nie zostanie wykonane odpowiednio, części linkera mogą wiązać się bezpośrednio z kulkami paciorkowca, co komplikuje wyniki. Ponadto stosunek linkera do chromatyny musi być starannie oszacowany – zbyt duża ilość linkera może spowodować oznakowanie obu końców DNA chromatyny, co hamuje efektywną wiązaniem bliskości.

Modyfikacje metody
W tym badaniu ilustrujemy metodę RDD, wykorzystując komórki Drosophila S2 z ncRNA roX2 jako przykład. Objętości odczynników wymagają regulacji w zależności od typu komórki i poziomu ekspresji ncRNA; jeśli ekspresja ncRNA jest wysoka, można zmniejszyć ilość komórek lub zwiększyć stężenie sondy RNA, i odwrotnie. Chociaż protokół ten unieruchamia chromatynę na kulkach, alternatywne podejście polega na przeprowadzeniu ligacji bliskości in situ , a następnie wzbogaceniu sond RNA.

Specyficzność, sterowanie i kontrola jakości
Wcześniej opisaliśmy i zweryfikowaliśmy RDD oraz przeprowadziliśmy równoległe RDD na wielu RNA, wykazując silną swoistość; czytelnicy mogą odwołać się do wcześniejszych utworów ^4,16. RDD wymaga wzbogacenia zależnego od sondy, specyficznego dla locus, które jest powtarzalne i, gdzie to możliwe, ortogonalnie zweryfikowane. Prawdziwe interakcje spełniają trzy kryteria: wzbogacenie na locusach ukierunkowanych na sondę w porównaniu do pobliskich obszarów niewiążących; zależność od sond (brak lub znacznie zmniejszona w kontrolach negatywnych); oraz powtarzalność w powielonych replikacjach biologicznych i niezależną walidację (np. RT-qPCR). Sondy antysensowe zaprojektowano ze Stellarisem, przesiewano przez BLAST/BLAT w celu usunięcia niecelnych, zamówiono z 3'-biotyną oraz zweryfikowano przez RT i qPCR (w tym testy zanieczyszczenia DNA oraz wzbogacenie miejsc w porównaniu z nie-miejscem). Zalecamy trzy badania kontrolne – bezsondową, bez-celowaną, sondy niepowiązane z RNA lub niezwiązane z RNA lub niewiążące – oraz oceniamy swoistość poprzez porównanie qPCR lub sekwencjonowania pokrycia między próbkami docelowymi i kontrolnymi, raportując wzbogacenie fałdowania i tło. Dla RNA o niskiej ilości, zwiększ gęstość sondy (w ramach ograniczeń poza celem), podnieś głębokość sekwencjonowania i wykonaj walidację ortogonalną.

Rozwiązywanie problemów z metodą
Jeśli przechwycone interakcje RNA-chromatyna są wyraźnie niskie, efektywność ligacji bliskości może wymagać optymalizacji poprzez korektę ilości linkera i chromatyny. Dodatkowo wysokie piki niezwiązanych sond obserwowano za pomocą automatycznych elektroferogramów kapilarnych. Wyniki wskazują, że dodano zbyt wiele sond, co można naprawić, zmniejszając ilość użytych sond.

Ograniczenia metody
Kluczową zaletą metody RDD jest jej efektywność w wychwytywaniu specyficznych interakcji chromatyny związanych z RNA, co oznacza, że każdy eksperyment może skupić się tylko na jednym konkretnym RNA naraz. Ponadto, ponieważ ligacja bliskości jest zaprojektowana do wykrywania interakcji parowych, nie można oceniać interakcji w wielu miejscach jednocześnie.

Znaczenie metody
Metoda RDD nie tylko ujawnia miejsca wiązania RNA, ale także wyjaśnia relacje interakcji między tymi miejscami, poszerzając naszą wiedzę o architekturze chromatyny.

Praktyczne zastosowania i przyszły potencjał RDD
RDD jest odpowiednie dla różnych RNA związanych z chromatyną, w tym endogennych RNA gospodarza oraz egzogennych RNA wirusów lub innych mikroorganizmów, co podkreśla jego szerokie zastosowanie w różnych dziedzinach badań.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
0,5 mln EDTA	Invitrogen	AM9260G
1 M octan magnezu	Sigma-Aldrich	63052-100ML
1 M Tris-HCl pH 7,0	Invitrogen	AM9851
1 M Tris-HCl pH 8,0	Invitrogen	AM9856
Rurki 1,5 mL	Eppendorf	30108051
10 mM dATP	Invitrogen	18252015
10% SDS (wt/vol)	Invitrogen	AM9822
10& razy; Bufor ogonowy A-tailing	NEB	B7002S
10& razy; Bufor naprawczy końcowy	NEB	B6002S
10& razy; Bufor ligazy DNA T4	NEB	B0202S
10& razy; Bufor TBE	Invitrogen	AM9863
14-mL probówki z okrągłym dnem	Corning	352057
2& razy; PCR master mix	NEB	M0541
20& razy; Bufor SSC	Invitrogen	AM9770
200-μ Lampy PCR L	Sangon Biotech	F611541-0010
250 mL kwadratowe butelki PET do przechowywania	Corning	431531
2-Merkaptoetanol (β-ME)	Sigma-Aldrich	M6250-100mL	! UWAGA β-ME jest toksyczny; Zawsze używaj go w okapie do spalin.
Lampy 2 mL	Eppendorf	22431048
3 M Octan sodu pH 5,5	Invitrogen	AM9740
5 M NaCl	Invitrogen	AM9759
5 M octan potasu	Sigma-Aldrich	95843-100ML-F
Butelki PET o pojemności 500 mL Square	Corning	431532
Bilans analityczny	Sartorius	BP211D
Automatyczny licznik komórek komórkowych	Counterstar	IC1000
Automatyczny system elektroforezy kapilarnej	Bioptic	C100100
Sondy biotynylowane	GENEWIZ		Zobacz Tabela 1
Proszek blokujący	Invitrogen	T2015
Oligologie mostka łączącego	GENEWIZ		Zobacz Tabela 1
Inkubator CO2	Thermo Scientific	51033549
Dimetylsulfotlenek (DMSO)	Sigma-Aldrich	D2650-100mL
Zestaw do przygotowania biblioteki DNA V2 dla Illumina	Vazyme	TD501
Zestaw do oczyszczania DNA	Zymo	D4013
Dulbecco' fosforanem buforowana sól fizjologiczna (DPBS) (1&razy;)	Gibco	14190250
Koktajl inhibitorów proteazy wolnych od EDTA	Roche	11836170001
EGS (Glikol etylenowy bis[succiniMidylsukcynian])	Thermo Scientific	21565
Bufor elucijny	Qiagen	19086
Alkohol etylowy, czysty	Sigma-Aldrich	E7023-500mL
Roztwór z formaldehydem	Sigma-Aldrich	47608-250mL-F	! UWAGA: Formaldehyd jest toksyczny; Zawsze używaj go w okapie do spalin.
Formamid	Invitrogen	AM9342
System obrazowania żelowego	Tanon	3500R
Glycine	Invitrogen	50046-1kg
Glikogen z niebieskim barwnikiem	Invitrogen	AM9516
Wkład o wysokiej czułości	Bioptic	C105105
Lampy o wysokiej gęstości fazowej blokady (1,5 mL)	Qiagen	129046
Zestaw fluorometryczny dsDNA o wysokiej czułości	Invitrogen	Q32851
Zestaw indeksowy V2 dla Illumina	Vazyme	TD202
Jodoacetyl-PEG2-Biotyna (IPB)	Thermo Scientific	21334
Alkohol izopropylowy	Sigma-Aldrich	I9030	! UWAGA: Alkohol izopropylowy jest toksyczny; Zawsze używaj go w okapie do spalin.
Bazowy nabój kilo	Bioptic	C105106
Fragment Klenowa (3'→ 5' exo-)	NEB	M0212L
Koraliki magnetyczne	Beckman	A63881
Magnetyczna szafa separacyjna  do rurki 15 mL	Invitrogen	12301D
Magnetyczna szafa separacyjna  do rurki 2 mL	Invitrogen	12321D
Szafa separacji magnetycznej dla lamp PCR	NEB	S1515S
Inkubator mikrobiologiczny	Thermo Scientific	IMH180
Mikroskop	Nikon	Eclipse TS2
Mikser	ELMI	RM-2L
N,N-dimetyloformamid (DMF)	Sigma-Aldrich	227056-100ML	! UWAGA: DMF jest toksyczny; Zawsze używaj go w okapie do spalin.
Mikrowirówka niechłodzona	Eppendorf	5405000204
Woda wolna od nukleazy (nie poddawana DEPC, 1000 mL)	Invitrogen	AM9932
Woda wolna od nukleazy (nie poddawana DEPC, 50 mL)	Invitrogen	AM9937
Kwantyfikator kwasów nukleinowych	Invitrogen	Q33226
Orbitalny potrząsacz	Crystal	SYC-2102
Fenol:Chloroform:IAA	Solarbio	P1012-100mL
Roztwór proteinazy K	Invitrogen	AM2548
Wirówka chłodzona	Eppendorf	22628180
Inkubator chłodzony	Thermo Scientific	IMP180
Mikrowirówka chłodzona	Eppendorf	5404F1621754
Lodówka	Haier	DW-25L262
Inhibitor RNazy	Ambion	AM2696
Probówki 15 ml wolne od RNazy	Invitrogen	AM12500
Probówki 50 mL wolne od RNazy	Invitrogen	AM12502
Sonicator	Soniki i Materiały	VCX130
Magnetyczne kulki C1 pokryte streptawidyną	Invitrogen	65001
Magnetyczne kulki M-280  pokryte Streptawidyną;	Invitrogen	11205D
Ligaza DNA T4	NEB	M0202S
Polimeraza DNA T4	NEB	M0203S
pH bufora TE 8,0	Invitrogen	AM9849
Cykler termiczny	Bio-Rad	1851148
Termomieszarka	Eppendorf	5382000023
Triton X-100	Acros Organics	327371000-100mL
Zamrażarka ultra-niskiej temperatury	Thermo Scientific	995
Koncentrator próżniowy	TOMY	MV-100