Zaawansowane zastosowanie elektroforezy kapilarnej w wysokorozdzielczej detekcji monoklonalnych białek w surowicy

Podsumowanie

Przedstawiamy tutaj protokół analizy białek surowicy o wysokiej rozdzielczości z użyciem elektroforezy kapilarnej. Pod wpływem wysokiego napięcia elektrycznego białka surowicy migrują przez kapilarę w zależności od ładunku i ruchomości elektroforetycznej. Powstały elektroferogram umożliwia wykrywanie, lokalizację i ilościowe określenie pików monoklonalnych białek.

Streszczenie

Monoklonalna immunoglobulina, znana również jako białko M lub parabiałko, powstaje w wyniku klonalnej proliferacji komórek osocza lub limfocytów B i pełni rolę kluczowego biomarkera gammopatii monoklonalnych. Dokładne wykrywanie i ilościowe określenie białka M w surowicy są niezbędne do wczesnej diagnozy chorób, klasyfikacji klinicznej oraz monitorowania terapeutycznego. Protokół ten opisuje metodę wykorzystującą elektroforezę kapilarną (CE) do wysokiej rozdzielczości białek surowicowych. Białka są rozdzielane w buforze alkalicznej pod wpływem elektroforezy wysokiego napięcia i wykrywane za pomocą absorbancji ultrafioletowej, co generuje elektroferogramy umożliwiające wyraźną wizualizację i ilościową identyfikację nieprawidłowych monoklonalnych pików białek. W porównaniu z tradycyjnymi metodami, CE zapewnia lepszą rozdzielczość regionu beta i umożliwia automatyczną, szybką analizę przy minimalnych wymaganiach dotyczących obsługi próbek. Pięć reprezentatywnych elektroferogramów wykazało migrację białek M w obszarach β1, β2 i γ, z poziomami białka M 0, 44,1% (45,8 g/L), 10,5% (8,6 g/L), 35,5% (28,4 g/L) oraz podwójnymi pikami 41,3% (46,0 g/L) i 12,4% (13,8 g/L). W retrospektywnym badaniu obejmującym 700 próbek surowicy klinicznej, CE osiągnęło pozytywny wskaźnik wykrywalności na poziomie 51,86%, w porównaniu do 52,86% dla elektroforezy immunofiksacyjnej (IFE). Stosując IFE jako metodę odniesienia, CE wykazało czułość na poziomie 92,70% i swoistość 93,94%. Wyniki te potwierdziły, że CE jest szybkim, zautomatyzowanym podejściem do przesiewowego i ilościowego określania białka M w surowicy w rutynowych laboratoriach klinicznych.

Wprowadzenie

Zaburzenia związane z białkiem M charakteryzują się obecnością monoklonalnej immunoglobuliny (białka M) w surowicy i/lub moczu. Białka te są zazwyczaj wydzielane przez klonalne komórki plazmatu lub limfocyty B i są głównie związane z złośliwymi dyskrazjami komórek plazmatycznych lub łagodnymi gammopatiami monoklonalnymi ^1,2. Spektrum kliniczne tych schorzeń obejmuje monoklonalną gammopatię o nieokreślonym znaczeniu (MGUS), samotnego plazmocytasa (SPC), tlącego się szpiczaka mnogiego (SMM), szpiczaka mnogiego (MM), białaczkę plazmokomórkową (PCL), makroglobulinemię Waldenströma (WM), układową amyloidozę łańcucha lekkiego (AL), chłoniaka nieziarniczego B-komórkowego (B-NHL) oraz inne zaburzenia limfoproliferacyjne limfoproliferacyjne komórek B (LPD)³. Badanie retrospektywne przeprowadzone w Hiszpanii wykazało, że spośród tych schorzeń MGUS jest najczęstszy, odpowiadając za 54,1% przypadków, następnie MM (31,3%) oraz inne złośliwe gammopatie (14,6%)^4. Warto również zauważyć, że białko M może być również produkowane w odpowiedzi na niektóre schorzenia nienowotworowe, takie jak zespół nerwózowy⁵.

Testowanie białek M odgrywa kluczową rolę w diagnozowaniu i monitorowaniu zaburzeń związanych z białkiem M⁶. Jednak wczesna diagnoza pozostaje wyzwaniem klinicznym, ponieważ pacjenci z MM często są bezobjawowi w początkowych stadiach, co prowadzi do opóźnienia w stosunkowo zaawansowanym stadium choroby. Około 1% osób z MGUS przechodzi rocznie w złośliwy stan nowotworowy, najczęściej w MM, WM lub SPC⁷. Chociaż uważa się, że niemal wszystkie przypadki MM wywodzą się z MGUS, mniej niż 10% pacjentów z MM ma udokumentowaną historię wcześniejszej diagnozy MGUS. W związku z tym terminowa identyfikacja białka M w surowicy i/lub moczu może dostarczyć cennych wskazówek do wczesnej diagnozy tych zaburzeń, co jest kluczowe dla poprawy przeżycia i prognozowania pacjentów. Badania wskazują, że pacjenci z MGUS zidentyfikowani za pomocą aktywnego badania przesiewowego doświadczają mniejszej liczby powikłań niż ci, którzy zdiagnozowano przypadkowo⁸. Podczas monitorowania terapeutycznego niezbędne są informacje dotyczące izotypu i wzorca migracji elektroforetycznego białka M, aby rozróżnić nawrót oryginalnego białka monoklonalnego od pojawienia się pasm oligoklonalnych lub wtórnego reaktywnego białka M⁹. Pojawienie się nowego białka M, często obserwowane po autologicznym przeszczepieniu komórek macierzystych, jest powszechnie uważane za korzystny wskaźnik prognostyczny dla większości pacjentów¹⁰. Zgodnie z tą obserwacją, porównawcze dane przeżywalności wskazują, że pacjenci, u których rozwija się wtórne białko M, wykazują medianę całkowitego przeżycia wynoszącą 115,3 miesiąca, w porównaniu do 31,0 miesiąca u tych, którzy nie otrzymali¹¹ miesięcy.

Elektroforeza białek to wysoce zaawansowana technika analityczna (BEA). Dostępnych jest szereg metod wykrywania białka M w surowicy, w tym elektroforeza białka surowicy (SPE), IFE, elektroforeza kapilarna immunotypowania (IT), test wolnych łańcuchów lekkich (FLC), wykrywanie łańcuchów ciężkich i lekkich (HLC) oraz spektrometria mas (MS). Każde z tych podejść oferuje unikalne zalety, ale jednocześnie napotyka na wrodzone ograniczenia. SPE można dalej podzielić na elektroforezę żelową agarozową (AGE) oraz CE. AGE, który wykorzystuje medium na bazie agarozy, jest prostą, opłacalną metodą odpowiednią do szybkiego rozdzielania i analizy. Jednak jest ograniczone stosunkowo niską czułością, z typowym limitem wykrywania 0,3-0,5 g/L¹², co może skutkować niewykrywalnością białek M o małej objętości lub niskim stężeniu. Ponadto technika ta jest podatna na zginanie i deformację pasmową, co ogranicza powtarzalność.

IFE jest powszechnie uznawane za złoty standard typowania białek M. Po początkowej elektroforezie stosuje się specyficzne przeciwciała (anty-IgG, anty-IgA, anty-IgM, κ, λ), które tworzą pasma immunoprecipitowane, umożliwiające identyfikację typu immunoglobuliny i podtypu łańcucha lekkiego. IFE wykrywa białko M w stężeniach tak niskich jak 0,05-0,15 g/L, zapewniając czułość ponad 10 razy wyższą niż SPE. Pomimo tej zalety, wymagana jest specjalistyczna wstępna obróbka dla niektórych próbek, takich jak te zawierające polimery białka M, aby zapewnić dysocjację z β-merkaptoetanolem. Nieodpowiednie leczenie może prowadzić do mylących rezultatów. Dodatkowo, pacjenci poddawani nowym terapiom skojarzonym (np. schematom zawierającym daratumumab, bortezomib, deksametazon oraz talidomid/lenalidomid) mogą prowadzić do fałszywie dodatnich wyników IFE¹³. Kluczowym ograniczeniem IFE jest to, że dostarcza jedynie wyników jakościowych, ponieważ nie jest w stanie ilościowo określić poziomu białek M, a zatem nie nadaje się do monitorowania skuteczności terapeutycznej¹⁴. Wśród leczonych pacjentów wyniki IFE mogą pozostać pozytywne nawet podczas spadku stężenia białka M podczas skutecznego leczenia.

Dla porównania, IT wykorzystuje bufory kapilarne jako medium separacyjne, oferując wyższą rozdzielczość niż konwencjonalne IFE. Niemniej jednak proces ten wymaga żmudnych etapów wstępnego przygotowania próbek, takich jak mieszanie przeciwskładników, co wydłuża cały proces wykrywania. FLC, czyli łańcuchy lekkie immunoglobuliny (κ i λ) niezwiązane z ciężkimi łańcuchami, są bezpośrednio ilościowe w surowicy za pomocą przeciwciał skierowanych do ich epitopów "strefy ukrytej", zapewniając wysoką czułość do wykrywania zaburzeń związanych z łańcuchem lekkim z limitem wykrywania już od 10–30 mg/L. W MM podwyższone poziomy FLC w surowicy korelują z obciążeniem guza i umożliwiają wcześniejszą ocenę odpowiedzi na leczenie, ze względu na krótszy okres półtrwania w porównaniu z nienaruszonymi immunoglobulinami¹⁵. Jednak jego zastosowanie kliniczne powinno być łączone z innymi metodami diagnostycznymi, takimi jak elektroforeza, aby wykluczyć inne schorzenia i zapewnić kompleksową ocenę. Na przykład zaburzenia funkcji nerek mogą prowadzić do fałszywie podwyższonych poziomów łańcucha świetlnego. Testy HLC stanowią kolejne podejście ilościowe, które wykorzystuje przeciwciała ukierunkowane na epitopy zarówno na łańcuchach stałych, jak i lekkich immunoglobuliny. Taki projekt pozwala na oddzielną ilościową ilościową liczbę par immunoglobulinowych specyficznych dla typu (np. IgGκ i IgGλ), a wyprowadzony stosunek HLC służy jako czuły wskaźnik klonalności. Jednak wyniki mogą być zależne od poziomów immunoglobuliny w tle, a metoda może być mniej wiarygodna przy analizie złożonych wariantów białek M. MS oferuje wyjątkową czułość i umożliwia dogłębną charakterystykę proteomiczną białek M. Jednak jego zastosowanie jest ograniczone przez wysokie koszty sprzętu, rozbudowane procedury analityczne oraz specjalistyczną wiedzę niezbędną do interpretacji danych.

CE to potężna analityczna technika separacji, która wykorzystuje elastyczne kapilary scalone krzemionki jako kanały separacyjne oraz wysokonapięciowe bezpośrednie pole elektryczne jako siłę napędową. Zapewnia rozdzielenie o wysokiej rozdzielczości, wykorzystując różnice w mobilności elektroforetycznej i/lub zachowaniu podziału analizowanych w celach. Od momentu powstania technologia ta rozwinęła się od konfiguracji jednonaczyniowatych do wysokoprzepływowych matryc kapilarnych oraz miniaturowych urządzeń mikrofluidycznych. Jego zastosowania obejmują obecnie różnorodne dziedziny, w tym analizę farmaceutyczną, diagnostykę biomedyczną i kliniczną, testy bezpieczeństwa żywności oraz charakterystykę bioterapeutyczną^16,17. CE jest coraz bardziej uznawane za kluczowe narzędzie do przesiewowego i ilościowej analizy białek M. Określa on procent białka M względem całkowitego białka, który następnie można pomnożyć przez całkowite stężenie białka, aby obliczyć bezwzględne poziomy białka M. Przede wszystkim minimalne wymagania dotyczące próbek sprawiają, że jest szczególnie odpowiedni do analizy cennych lub ograniczonych objętościowo próbek.

CE oferuje trzy kluczowe zalety techniczne. Po pierwsze, jego wysoka czułość analityczna (0,1–0,5 g/L) umożliwia skuteczne wykrywanie białek M o niskim stężeniu, co zmniejsza ryzyko błędnej diagnozy w takich stanach jak MGUS i choroby łańcucha lekkiego. Po drugie, w pełni zautomatyzowany przepływ pracy eliminuje subiektywne błędy interpretacyjne charakterystyczne dla tradycyjnych metod barwienia na bazie żelu. Na koniec czas badania zostaje znacząco skrócony do 15–20 minut, co jest znacznie krótsze niż 60–90 minut wymagane do konwencjonalnej elektroforezy. Jako kluczowa technika analityczna pomiędzy elektroforezą strefową a chromatografią cieczową, CE wykonuje separację elektroforetyczną w roztworze wolnym. Pod wpływem pola elektrycznego cząsteczki białka są przede wszystkim rozdzielane przez przepływ elektroosmotyczny w buforze zasadowym przy określonym pH. Po rozcieńczeniu dedykowanym buforem próbki są wstrzykiwane do anody kapilarnej pod wysokim napięciem, aby rozpocząć szybkie i efektywne rozdzielanie białek, a następnie wykrywane na katodzie przy 200 nm. Po każdym cyklu analitycznym kapilary przechodzą automatyczne czyszczenie i uzupełnianie buforów w celu przetwarzania kolejnych próbek. Separacja białek zachodzi w następującej kolejności: gamma-globulina, beta-2-globulina, beta-1-globulina, alfa-2-globulina, alfa-1-globulina oraz albumina, co umożliwia identyfikację nieprawidłowości w jednej lub kilku frakcjach białka surowicowego. Co istotne, CE zapewnia zwiększoną rozdzielczość w regionie beta, wyraźnie dzieląc go na składniki beta-1 i beta-2 globuliny, dostarczając tym samym bardziej szczegółowych informacji klinicznych¹⁸. Napędzana integracją sztucznej inteligencji oraz ciągłym postępem w wykrywaniu wieloparametrów, CE jest gotowe stać się pierwszą metodą przesiewową wykrywania białek M. Dlatego protokół ten opisuje zastosowanie elektroforezy kapilarnej do szybkiego wykrywania, lokalizacji i analizy ilościowej białek monoklonalnych w surowicy w próbkach klinicznych.

Protokół

Protokół badania został przeanalizowany i zatwierdzony przez Komitet Przeglądu Etyki Szpitala Ludowego Prowincji Guangdong (Numer Zatwierdzenia: KY2025-176-01). Wszyscy uczestnicy wyrazili pisemną świadomą zgodę przed pobraniem próbki.

1. Przygotowanie materiałów

UWAGA: Zestaw odczynnikowy powinien być przechowywany w temperaturze 2–30 °C i ma okres przydatności do spożycia do 3 lat.

1. Przechowuj bufor w temperaturze 2–8 °C i pozwól mu osiągnąć temperaturę pokojową przed użyciem. Po otwarciu roztwór pozostaje stabilny do 3 miesięcy. Używaj tego roztworu jako buforu biegowego do rozdzielania białek surowicy w elektroforezie kapilarnej.
   UWAGA: Bufor jest gotowy do użycia z pH 9,9 ± 0,5. Zestaw odczynników zawiera trzy butelki buforu alkalicznego po 700 mL używanych jako bufor do separacji białek surowicowych.
2. Przed użyciem rozcieńcz 75 mL skoncentrowanego roztworu płukania do 750 mL z wodą dejonizowaną. Przechowuj rozcieńczony roztwór do płukania w temperaturze pokojowej. Po otwarciu roztwór pozostaje stabilny do 3 miesięcy. Stosuj ten roztwór do czyszczenia rurek kapilarnych po elektroforezie.
   UWAGA: Roztwór do płukania zawiera wodorotlenek sodu i jest stosowany do czyszczenia naczyń włosowatych.
   UWAGA: Roztwór do płukania zawiera wodorotlenek sodu, substancję żrącą, która może powodować poważne oparzenia. W przypadku kontaktu wzrokowego natychmiast przepłukaj wodą i zgłoś się do lekarza. Jeśli skóra lub ubrania ulegną skażeniu, natychmiast usuń zanieczyszczone ubrania. Zawsze noś odpowiednie ubrania ochronne oraz stosuj ochronę oczu i twarzy.
3. Przechowuj kubki z odczynnikami w oryginalnym szczelnie zamkniętym opakowaniu w temperaturze 2–30 °C w czystym i suchym miejscu. Używaj kubków odczynników do rozcieńczania próbek na w pełni zautomatyzowanych instrumentach.
4. Przechowuj szczelny filtr w suchym miejscu w temperaturze pokojowej (15–30 °C). Używaj jednorazowych filtrów do filtrowania roztworów buforowych i wody dejonizowanej.
5. Przechowuj roztwór czyszczący kapilary (patrz Tabela materiałów) w temperaturze 2–8 °C i unikaj opadów.
   UWAGA: Każda butelka koncentratu roztworu czyszczącego kapilary (25 mL/butelka) zawiera enzymy proteolityczne, substancje powierzchniowo czynne i inne dodatki. Dodatki są nieszkodliwe w stężeniu aplikacji i są niezbędne dla optymalnej wydajności. Roztwór zapobiega blokadzie kapilarnej i utrzymuje optymalną wydajność.
6. Używaj filtrowanej wody dejonizowanej o porze o średnicy porów ≤ 0,45 μm, przewodności poniżej 3 μS/cm i rezystancji przekraczającej 0,33 MΩ·cm. Codziennie wymieniamy wodę, aby zapobiec skażeniu mikroorganizmami. Użyj tej wody do czyszczenia rurek kapilarnych analizatora elektroforezy.
7. Przygotuj roztwór podchlorynu sodu zawierający 2–3% dostępnego chloru. Używaj tego roztworu do czyszczenia próbek sond, aby usunąć adsorbowane białka. Przechowuj działający chlorowany roztwór w temperaturze pokojowej w zamkniętym pojemniku. Rozwiązanie pozostaje stabilne do 3 miesięcy. Nie przechowywać w pobliżu światła słonecznego, ciepła, źródeł zapłonu, kwasów ani amoniaku.

2. Zbieranie próbek

1. Upewnij się, że pacjenci poszczą co najmniej 8–12 godzin przed pobraniem krwi.
2. Poproś pacjentów, aby odpoczywali w pozycji siedzącej lub leżącej przez 10–15 minut, aby ustabilizować hemodynamikę.
3. Przygotuj następujące materiały: jednorazowe igły do krwi żylnej, próżniowe probówki do pobierania krwi (rurki do surowic), opaski uciskowe, sterylne patyczki kosmetyczne, środek dezynfekujący alkohol lub jodofory o stężeniu 75%, plaster medyczny oraz pojemnik na odpady biologiczne.
   UWAGA: Środkowa żyła łokciowa w dołku łokciowym jest preferowanym miejscem nakłucia.
4. Załóż opasku uciskową 3–5 cm nad miejscem ukłucia, aby odpowiednio nabrzmieć żyłę.
5. Dezynfekuj skórę alkoholem lub jodoforem w spiralnym wzorze odśrodkowym od środka na zewnątrz, pokrywając obszar o średnicy ≥5 cm, i pozwól środkowi naturalnie wyschnąć bez ponownego dotykania tego miejsca.
6. Trzymaj igłę z fazą do góry pod kątem 15–30° do skóry i gładko przekłuj skórę oraz ścianę żyły.
7. Po zaobserwowaniu powrotu krwi zabezpiecz igłę i podłącz rurkę próżniową. Pozwól, by krew wypełniała rurkę pasywnie pod ciśnieniem ujemnym, bez ręcznego ucisku, aby zapobiec hemolizie.
8. Po zebraniu najpierw zwolnij opaski uciskową, następnie delikatnie wyciągnij igłę i natychmiast uciskaj miejsce nakłucia sterylnym wacikiem przez 3–5 minut, aby zapewnić hemostazę.
9. Ustaw pobraną próbkę pionowo w temperaturze pokojowej i pozwól krwi naturalnie się skrzepnąć.

3. Ocena jakości próbek

1. Próbki surowicy w wirówce w dawce 2 095 x g przez 10 minut w temperaturze pokojowej.
2. Próbki surowicy poddane surowej ocenie jakości wizualnej przy odpowiednim świetle naturalnym na tle białym.
3. Oceń hemolizę, badając kolor i klarowność supernatantu. Klasyfikuj próbki jako niehemolizowane, jeśli supernatant wydaje się przezroczysty i żółty, podczas gdy każde różowe lub czerwone przebarwienie wskazuje na łagodną lub ciężką hemolizę.
   UWAGA: Hemoliza może powodować podwójną strefę alfa-2. Frakcja beta-2 może się zmniejszać w starzałych lub nieprawidłowo przechowywanych próbkach surowic.
4. Sprawdź interferencję fibrynogenu, sprawdzając widoczne włókna fibryny, zakrzepy lub sieci galaretowate w supernatancie, a także niepełne rozdzielenie fazowe, mętność lub niespójne sygnały analityczne.
   UWAGA: Fibrynogen migruje w pozycji beta-2 (ramię na beta-2 lub nałożone na strefę beta-2, z możliwym wzrostem tej frakcji). W niektórych próbkach (osocze, surowica nie w pełni zdefibrynowana, lub pacjenci na leczeniu antykoagulantowym) fibrynogen może zakłócać analizę i prowadzić do błędnej interpretacji, takiej jak podejrzenie o obecność pasma monoklonalnego lub wzrost frakcji beta-2.
5. Wykluczyć próbki wykazujące hemolizę, interferencję fibrynogenową lub inne nieprawidłowości przedanalityczne po wykryciu w analizie.
6. Pobierz nową próbkę krwi po ustandaryzowanej procedurze flebotomii i przetwarzania, zapewniając odpowiedni czas krzepnięcia i ustandaryzowane parametry wirówki. Do dalszych badań używaj wyłącznie próbek o zadowalającym wyglądzie — przezroczystych, wolnych od hemolizy, fibryny, lipemii lub zanieczyszczenia.
7. Przetestuj oddzielone próbki surowicy jak najszybciej w temperaturze pokojowej. Jeśli natychmiastowe testowanie nie jest możliwe, przechowuj próbki w temperaturze 2–8 °C przez maksymalnie 10 dni oraz w temperaturze -20 °C do 30 dni. Nie mroz i nie mroz próbek wielokrotnie.
   UWAGA: Unikaj próbek plazmy. Podczas analizy starzonych próbek osocza (co nie jest zalecane) zmienne składniki, takie jak dopełnienie C3, ulegają degradacji z czasem, więc strefa beta-2 zasadniczo odpowiada fibrynogenowi.
8. Przed testami przywróć próbki do temperatury pokojowej i dokładnie je wymieszaj. Upewnij się, że mrożone próbki są całkowicie rozmrożone przed użyciem.
   UWAGA: Używaj nierozcieńczonych próbek białka surowicowego. Niektóre surowice chłodzone mogą stać się lepkie lub mętne, szczególnie te zawierające krioglobuliny lub kriogel. Używaj próbek zawierających poliimmunoglobuliny bezpośrednio, bez dodatkowego wstępnego leczenia.

4. Procedury operacyjne

1. Zasilanie automatycznego analizatora kapilarnej elektroforezy (patrz Tabela materiałów) oraz podłączonego systemu komputerowego. Poczekaj, aż instrument zostanie w pełni zainicjalizowany.
   UWAGA: Długość kapilary i średnica wewnętrzna wynoszą odpowiednio 17,5 cm i 25 μm. Napięcie separacyjne mieści się w zakresie od 8 000 do 10 000 V. Stosuje się elektrokinetyczne wtryski, a temperatura separacji utrzymuje się na poziomie około 25 °C. Całkowity czas wykonania próbki wynosi około 10 minut.
2. Uruchom oprogramowanie PHORESIS (patrz Tabela materiałów) zainstalowane na komputerze do przetwarzania danych.
3. Z interfejsu oprogramowania wybierz program PROTEIN (E) 6 , a następnie włóż działającą butelkę buforową do instrumentu.
   UWAGA: Ten program to fabrycznie skalibrowany protokół presetowy, specjalnie zaprojektowany do frakcjonowania białek w surowicy. Wszystkie parametry są wstępnie skonfigurowane w oprogramowaniu PHORESIS instrumentu bez konieczności ręcznej modyfikacji.
4. W razie potrzeby umieść butelkę z odczynnikiem zawierającą rozpuszczony roztwór czyszczący w urządzeniu.
5. Zamontuj nowy kubek reagentowy na automatycznej platformie ładowającej analizator elektroforezy kapilarnej.
6. Zainstaluj nowy pojemnik na odpady w standardowej pozycji analizatora elektroforezy kapilarnej dla zużytych kubków odczynników.
7. Ładuj stojaki próbek do analizatora przez otwór po prawej stronie (maksymalna pojemność: 15 stojaków).
   UWAGA: Każdy stojak może pomieścić do 8 probówek. Kod kreskowy na każdej probówce musi być widoczny przez otwór regału.
8. Użyj stojaka na próbki nr 0 do serum kontrolnego. Stosuj zewnętrzne kontrole jakości opartą na średniej skumulowanej i współczynniku zmienności wyliczonych na podstawie 20 punktów testowych.
9. Wyjmij gotowy stojak na próbki z tacy rozładowującej po lewej stronie. W razie potrzeby wyjmij i wyrzuć pojemnik na odpady zawierający zużyte kubki odczynnikowe.
   UWAGA: Obchodz się z używanymi kubkami odczynnikowymi ostrożnie, ponieważ mogą zawierać próbki biologiczne.
10. Umieść roztwór czyszczący kapilary w pozycji S2 w komorze odczynnikowej wtórnej. Kliknij Konserwacja i czyszczenie na ekranie przyrządów, a następnie wybierz Start Capiclean.
11. Umieść 2-3% roztwór podchlorynu sodu w komorze odczynników wtórnych (pozycja T1). Kliknij Konserwacja i czyszczenie na ekranie przyrządów i wybierz Rozpocznij dekontaminację.
    UWAGA: Cały proces czyszczenia kapilar automatycznie trwa 45 minut.
12. Rozpocznij sekwencję czyszczenia przynajmniej raz w tygodniu.

5. Analiza wyników

1. Po zakończeniu każdego cyklu analizy przesyłaj surowe dane z instrumentu do oprogramowania do przetwarzania. Oprogramowanie generuje elektroferogram, który jest wyświetlany na ekranie komputera.
2. Przeanalizuj elektroferogram i określ względne intensywności absorpcji każdego pasma białka przy długości fali 200 nm za pomocą oprogramowania.
   UWAGA: Na podstawie całkowitych stężeń białek zmierzonych przez w pełni zautomatyzowany analizator biochemiczny, oprogramowanie oblicza stężenie każdego pasma białka.
3. Wykorzystaj wygenerowane elektroferogramy do oceny wizualnej i identyfikacji nieprawidłowych pasm.
   UWAGA: Domyślnie system wyświetla elektroferogramy w trybie ponownego rysowania.
4. Użyj standardowego trybu do prezentacji początkowych elektroferogramów pochodzących z surowych danych, jeśli to konieczne.
   UWAGA: Zakresy odniesienia elektroforetycznego analizatora kapilarnego zostały ustalone na podstawie analizy statystycznej 246 zdrowych dorosłych uczestników (zarówno mężczyzn, jak i kobiet) z prawidłowym poziomem trójglicerydów (Tabela 1). Zaleca się, aby każde laboratorium ustanowiło własne standardy.

6. Wyłączenie instrumentów

1. Na końcu każdej sekwencji analizy rozpocznij procedurę wyłączania analizatora elektroforezy kapilarnej, aby przechowywać kapilarę w idealnych warunkach.
   1. Aby rozpocząć procedurę wyłączania, wybierz "Wyłączenie" w menu głównym lub użyj szafy wyłączającej dołączonej do analizatora.
   2. Naciśnij "Wyłącz" w menu głównym. W oknie wyświetlanym na ekranie naciśnij przycisk , aby rozpocząć procedurę. Proces wyłączania rozpocznie się automatycznie po zakończeniu trwającego programu analiz.
   3. Stojak wyłączający jest oznaczony jako "EXTINCTION/SHUTDOWN CAPILLARYS 3 & MC". Włóż ten regał na koniec kolejki do próbek, a instrument automatycznie rozpocznie procedurę wyłączenia.
      UWAGA: Po zakończeniu procedury wyłączania instrument zostaje wyłączony, a ekran wyłączony.
2. Użyj fizycznego przełącznika zasilania z tyłu instrumentu, aby odłączyć analizator od zasilania z sieci.
3. Wyjmij wszystkie butelki z odczynnikami z dwóch komor odczynników i przechowuj je w zalecanych warunkach przechowywania. Typowe usterki, możliwe przyczyny oraz rozwiązania w pełni zautomatyzowanym analizatorze elektroforezy przedstawiono w Tabeli Uzupełniającej 1.

7. Parametry wydajności

1. Aby określić analityczną czułość procedury elektroforezy kapilarnej, przygotuj i przeanalizuj seryjne rozcieńczenia próbki surowicy zawierającej nieprawidłowe białko w strefie gamma w dawce 1,198 g/dL. Najwyższe rozcieńczenie z widoczną nieprawidłowością odpowiada stężeniu 19 mg/dL nieprawidłowego białka.
   UWAGA: W zależności od położenia nieprawidłowego białka i tła poliklonalnego w strefie gamma, granica wykrywania może się różnić.
2. Ocena dokładności – Wewnętrzna korelacja
   1. Aby zapewnić integralność próbki, przetwarzaj wszystkie próbki surowicy (w tym 18 próbek normalnych i 100 patologicznych) identycznie i obchodz się z nimi zgodnie z tymi samymi wytycznymi.
   2. Zmierz poziomy każdej frakcji białka zarówno za pomocą separacji elektroforetycznych uzyskanych metodą kapilarową na analizatorze, jak i inną komercyjnie dostępną techniką kapilarnej elektroforezy do analizy białek.
   3. Przeanalizuj zmierzone wartości z obu procedur za pomocą regresji liniowej procedury statystycznej. Uzyskane wyniki wykazały doskonałą korelację między obiema procedurami.

Wyniki

Pozycje migracji, charakterystyki szczytów oraz względne procenty każdego pasma białka zostały ilościowo przeanalizowane poprzez wykrywanie absorpcji białka surowicowego. Następnie przeprowadzono interpretację kliniczną na podstawie obecności i wzoru nieprawidłowych pasm zaobserwowanych w elektroferografii. Reprezentatywny elektroferogram kapilarny pokazujący normalny wzorzec migracji ułamek białek surowicy pokazano na Rysunku 1. Zmiany w szczytowych czasach migracji przypisuje się głównie r...

Dyskusja

SPE to podstawowa technika diagnostyczna w laboratoriach klinicznych, rozdzielająca białka surowicy na podstawie różnic w ich punktach izoelektrycznych, masach cząsteczkowych i konformacjach¹⁹. Badanie to systematycznie przedstawia protokół szybkiego wykrywania i ilościowego wykrywania białka M w surowicy przy użyciu CE. Protokół podkreśla doskonałe wyniki analityczne metody, a jej główne zalety to wysoka czułość, wysoka przepustowość oraz pełna automatyzacja²⁰. Ze względu ...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
CAPI 3 BIAŁKO (E) 6 bufor	SEBIA	2503	Bufor biegający używany do separacji białek surowicy w elektroforezie kapilarnej (w manuskrypcie określany jako bufor biegający).
Roztwór płukania de-lavage	SEBIA	2062	Rozcieńczony roztwór płukania używany do czyszczenia rurek kapilarnych po elektroforezie.
Kubki odczynnikowe	SEBIA	2582	Do rozcieńczania próbek w w pełni automatycznych instrumentach.
FILTRY KAPILARNE	SEBIA		Filtr jednorazowy używany do filtrowania roztworów buforowych i wody dejonizowanej podczas czyszczenia kapilarnego.
CAPICLEAN	SEBIA	2060	Do czyszczenia rurek kapilarnych instrumentów CAPILLARYS 3 OCTA (w rękopisie określanych jako roztwór czyszczący kapilary)
Roztwór podchlorynu sodu	Fabryka Odczynników Chemicznych w Kantonie	1703079	Do czyszczenia próbek sond.
Woda dejonizowana	Watsonowie	/	Stosowany do płukania kapilar w automatycznym analizatorze kapilarnym elektroforezy.
Kontrola jakości Randox	Randox	HN1530	Dla kontroli jakości.
W pełni zautomatyzowany analizator kapilarnej elektroforezy	SEBIA	KAPILARY 3 OCTA	Instrument używany do analizy białek surowicy o wysokiej rozdzielczości i wysokiej przepustowości.
Oprogramowanie PHORESIS 9.30	SEBIA	/	Oprogramowanie używane do automatycznego pozyskiwania i analizy wzorców elektroforezy.