Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Metagenomika frakcji wirusa DNA dla próbek ludzkiego kału

383 wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/70187

⸱

24 marca 2026

 ,  ,  ,  , 
1Department of Plant Pathology, University of California, Davis

W tym artykule

Podsumowanie

Przedstawiamy elastyczny protokół generowania wysokiej jakości metagenomów o rozmiarze wirusa (viromów) z próbek ludzkiego kału. Pierwotnie opracowany do wiromiki gleby, tutaj ten protokół został z powodzeniem zastosowany do próbek kału, umożliwiając solidną charakterystykę wirusosfery ludzkiego jelit.

Streszczenie

Zrozumienie zdrowej ludzkiej wirusosfery (wirusowego komponentu mikrobiomu) wymaga dokładnych pomiarów składu społeczności wirusowej w różnych typach wirusów. Opierając się na wcześniejszym doświadczeniu z metodami ekologii społeczności wirusowej gleby, prezentujemy tutaj serię metod laboratoryjnych wzbogacania i ekstrakcji DNA z wirusów DNA zewnątrzkomórkowych w próbkach ludzkiego kału. Przedstawiony jest działający protokół pierwotny wraz z opcjami odchyleń na różnych etapach. Ogólne podejście obejmuje dodanie buforu ciekłego (domyślnie: sól fizjologiczna z buforem fosforanowym wzbogaconym o białko, PPBS) ułatwiającym usuwanie wolnych cząstek wirusa z macierzy kału, wirowanie w celu rozdzielenia frakcji ciekłej zawierającej cząstki wirusa, filtrację (domyślnie: 0,2 μm porów) w celu usunięcia większości komórek, stężenie cząstek wirusowych (domyślnie: ultrawirowanie), usuwanie wolnych kwasów nukleinowych nukleazami przed lizą wirionu, a następnie ekstrakcja DNA do sekwencjonowania. Wspomniano także o alternatywnych technikach, w tym różnych buforach, rozmiarach filtrów i metodach koncentracji. Ogólnie rzecz biorąc, dostępnych jest wiele opcji generowania wysokiej jakości wirusomicznego DNA do sekwencjonowania. Zamiast dostosowywać podejście do konkretnego sprzętu i zasobów, elastyczność protokołu powinna umożliwić szerokie zastosowanie w laboratoriach z różnym standardowym sprzętem biologii molekularnej.

Wprowadzenie

Wirusomika, czyli nieukierunkowane sekwencjonowanie metagenomiczne udziałku o rozmiarze wirusa w mieszanych społecznościach, może dostarczyć wglądu w różnorodność, ewolucję i ekologię wirusów niehodowanych. Od wczesnych działań katalogujących społeczności wirusowe jelit, które wykorzystywały metody opracowane dla próbek środowiskowych, takich jak woda morska1, podejścia viromiczne nadal umożliwiają odkrycia w ekologii wirusowej w mikrobiomie człowieka2. Nie istnieje jednak jednolity uniwersalny protokół wirusomiczny, a różnice w technikach mogą wpływać na wyniki sekwencjonowania 3,4, ostatecznie wpływając na interpretację dynamiki społeczności wirusowej i utrudniając porównania między badaniami. Zoptymalizowane protokoły, połączone z dogłębnym zrozumieniem, jak wybory metodologiczne kształtują profile wirusomu, są potrzebne do solidnego charakteryzowania ludzkiej wirusosfery.

Chociaż nie istnieje uniwersalny protokół wirusomiki, ogólna podstawa metod wirusowych polega na fizycznym separowaniu i koncentrowaniu cząstek wirusopodobnych (wirusów) z zewnątrzkomórkowymi na podstawie ich rozmiaru i/lub gęstości, usuwaniu wolnych kwasów nukleinowych (pochodzących częściowo z odpadów komórkowych lub uszkodzonych kapsyd wirusowych) przed rozlewem wirionu oraz ekstrakcjonowaniu DNA i/lub RNA do sekwencjonowania. Niektóre techniki wirusomiczne wybierają lub przeciw określonym typom wirusa, czy to jako celowy wybór badaczy, czy niezamierzone ograniczenie metodologiczne. Filtracja strzykawkowa lub próżniowa jest często stosowana do usuwania komórek drobnoustrojów i innych zanieczyszczeń, a rozmiar filtra z natury wpływa na jakość i skład odzyskiwanego viromu. Na przykład filtracja może zwiększyć czystość wirusomu5, ale może wykluczyć większe cząstki wirusa 6,7. Metody stężenia wirionu, takie jak ultrawirowanie, wytrącanie glikolu polietylenowego (PEG), ultrawirowanie gradientu gęstości oraz ultrafiltracja, również mają kompromisy między czystością, przepustowością i kosztem sprzętu 3,8. Wiele chemii buforowych jest znane jako skuteczne w wirusomice. Mogą nie mieć nadmiernego wpływu na charakterystykę wirusomu9, ale bufory magazynowania i rezawiesji mogą nadal wpływać na odzyskiwanie wirusa oraz profile wirusomowe uzyskane w analizie bioinformatycznej10,11. Wreszcie, ponieważ stężenia kwasów nukleinowych wirusa mogą być niskie w naturalnych próbkach, wiele badań decyduje się na amplifikację wirusowego DNA przed rozpoczęciem budowy biblioteki (np. poprzez amplifikację wielokrotnego przemieszczenia (MDA) lub niezależną od sekwencji amplifikację pojedynczym primerem (SISPA)). Jednak niektóre z tych technik wprowadzają znaczące uprzedzenia12,13. Ogólnie rzecz biorąc, choć wiele metod wirusomicznych skutecznie generuje wirusomy, zoptymalizowane protokoły uwzględniające uprzedzenia i częściowo standaryzowane umożliwiają dokładne i powtarzalne badania wirusomów.

Ten artykuł przedstawia elastyczny sposób generowania wirusomów z próbek ludzkiego stolca. Opracowany na podstawie sprawdzonych technik wirusomiki gleby14, 15, 16, protokół ten zawiera kilka kroków ułatwiających modyfikacje, umożliwiając badaczom dostosowanie go do własnego sprzętu i potrzeb badawczych. Standardowa metoda wirusomiki gleby, opisana poniżej, skutecznie zastosowana zarówno na próbkach gleby, jak i zamarzniętego kału, daje wysokiej jakości wirusomy bez konieczności uwielbienia DNA wirusa przed budową biblioteki. Sugestie dotyczące modyfikacji protokołu były testowane w różnym stopniu w innych badaniach, ale ich specyficzny, późniejszy wpływ na sekwencje wirusomu w ludzkim stolcu nie został tutaj zbadany.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszyscy badani zrekrutowani do pobierania próbki kału wyrazili świadomą zgodę. Protokoły pobierania próbek zostały zatwierdzone przez Instytucjonalną Radę Przeglądową Uniwersytetu Kalifornijskiego w Davis, a badania są zgodne z Deklaracją Helsińską. Protokół ten jest zaadaptowany z Emerson i in. (2022)17.

1. Przygotowanie materiałów

  1. Przygotować sól fizjologiczną z buforem fosforanowym o wzbogaceniu białka (PPBS, 10x PBS, 1% cytrynian K, 150 mM MgSO4, 2% błonina surowicy bydła (BSA))18.
    UWAGA: Inne powszechnie stosowane bufory w protokołach wirusomicznych to magnez solny fizjologiczne (SM)19 oraz poprawiony bufor11 z cytrynianem potasu (AKC).
    1. Dodaj 10 mL 10x PBS, 10 g cytrynianu K, 18,05 g bezwodnego MgSO4 do butelki szklanej o pojemności 1 L i napełnij do 1 L ultraczystą wodą laboratoryjną. Dostosuj pH do 6,5 (zazwyczaj wymaga około 50 μL 6 M HCl lub około 100 μL 2 M HCl). Zostaw mieszankę w butelce do użycia w kroku 1.1.2.
    2. Butelkę podkłucuj z buforem i jedną pustą szklaną butelką o pojemności 1 L, którą można autoklawować. Po autoklawingu, gdy bufor ostygnie do temperatury pokojowej, umieść go na magnetycznej płycie mieszającej i powoli dodaj 20 g BSA bezpośrednio do butelki, dodając około 5 g BSA na raz (aby uniknąć pienienia, zminimalizować nadmierne mieszanie roztworu, np. zacząć od powolnego mieszania i stopniowo zwiększać).
    3. Przefiltruj całą objętość buforu przez sterylny filtr próżniowy o pojemności 0,22 μm do pustej autoklawowanej butelki 1 L od etapu 1.1.2. Przechowuj bufor w temperaturze 4 °C do użycia.
      UWAGA: Bufor PPBS może być przechowywany w temperaturze 4 °C przez około 3 miesiące, ale nie jest stabilny na dłuższą metę, gdy jest przechowywany powyżej zera.
  2. Przygotujcie rurki do ultrawirówki.
    UWAGA: Protokół ten wykorzystuje ultrawirówkę do koncentracji wirionów. Inne popularne podejścia to wytrącanie glikolu polietylenowego (PEG), ultrawirowanie gradientowe gęstości (np. gradienty chlorku cezu) oraz ultrafiltracja.
    1. Aby wyczyścić rurki ultrawirówki, najpierw szoruj je ultraczystą wodą laboratoryjną. Następnie przepłucz probówki ultraczystą wodą laboratoryjną.
    2. Napełnij rurki 1 M NaOH i namocz przez co najmniej godzinę (można namoczić przez całą noc). Czyść plastikowe/gumowe nasadki ultrawirówek oraz ich oringi, zanurzając je w 1 M NaOH.
      UWAGA: Nie zanurzaj metalowych nakrętek na nakrętkach w NaOH.
    3. Po moczeniu przepłukaj trzy razy ultraczystą wodą laboratoryjną, a następnie jedno przepłukanie wodą bez nukleazy, o jakości biologii molekularnej. Susz rurki, odwracając je i delikatnie stukając lub pozwalając im całkowicie wyschnąć przez noc. Każdą probówkę ultrawirówki oznacz identyfikatorem próbki.
  3. Wstępnie schłodzić rotor ultrawirówki w temperaturze 4 °C, zostawiając rotor na noc w lodówce lub chłodni.

2. Oczyszczanie i koncentracja wirionu

  1. Zważ stolec do sterylnej, wolnej od DNazy, RNazy i DNA, stożkowej probówki 50 mL.
    UWAGA: Ilość używanego kału może zależeć od ilości dostępnego materiału próbnego. Tutaj użyto 2 g stolca. Jeśli nieużywany materiał próbki musi być przechowywany zamrożony, rozważ alicytowanie całej próbki przed zamrożeniem, aby zminimalizować przyszłe cykle zamarzania i rozmrażania.
  2. Dodaj 8 mL buforu PPBS bezpośrednio do stożkowych rurek zawierających stolec (stożkowy #1). Dokładnie zawiesz przez wirowanie.
  3. Potrząsaj rurkami przy 300 obr./min i 4 °C przez 10 minut.
    UWAGA: W razie potrzeby potrząsanie można przeprowadzić w temperaturze pokojowej, ale zaleca się stosowanie 4 °C.
  4. Próbki z wirówki w stożkowym #1 w dawce 4000 x g w 4 °C przez 10 minut.
    UWAGA: Jeśli to możliwe, użyj obrotowego wirnika łyżkowego, aby ułatwić pionowe rozdzielanie gęstości i ułatwić kolejne kroki.
  5. Ostrożnie przelej supernatant do nowej, sterylnej stożkowej masy 50 mL (stożkowa #2) i przechowuj w temperaturze 4 °C (tutaj supernatant zawiera wiriony). Nie wyrzucaj stożkowej rurki zawierającej granulkę (stożkowa #1), ponieważ jest ona używana ponownie w kroku 2.6.
  6. Powtórz kroki 2.2-2.5 jeszcze dwa razy (tak, aby próbka w stożkowym #1 przeszła łącznie 3x resuspension z buforem, 3x potrząsanie i 3x wirowanie) i kontynuuj gromadzenie supernatantu w stożkowy #2.
    UWAGA: Trzy naboje powinny gromadzić łącznie ~24 mL supernatantu.
  7. Wiruj stożkową rurkę o pojemności 50 mL zawierającą nagromadzony supernatant (stożkowy #2) przez 8 minut w ilości 10 000 x g w 4 °C.
  8. Przeprowadź drugą rundę wirowania. Najpierw przelej supernatant z stożkowego #2 do nowej stożkowej rurki o pojemności 50 ml (stożkowa #3). Wirówka stożkowa #3 przez 8 minut w 10 000 x g w 4 °C.
  9. Używając filtracji strzykawkowej, sekwencyjnie filtruj supernatant z stożkowego #3, unikając peletu na dnie lub blisko dna rurki. Wstępny filtr za pomocą sterylnego filtra strzykawkowego o pojemności 5,0 μm polietersulfonu (PES), następnie sterylny filtr strzykawkowy PES o średnicy 0,20 μm, bezpośrednio do rurki ultrawirówki.
    UWAGA: Celem wstępnego filtrowania filtrami 5,0 μm jest zmniejszenie zatoru filtrów 0,20 μm. Nadal może być konieczne wyrzucenie i wymiana filtrów strzykawkowych, jeśli zostaną one zatkane. Filtracja może być przeprowadzona w jednym kroku, układając filtr 5 μm na filtrze 0,20 μm, podłączając do pojedynczej strzykawki i bezpośrednio do rurki ultrawirówki. Preferowane są membrany PES, ponieważ inne materiały membranowe mogą zatrzymywać wiriony (np. włókno szklane) lub szybciej się zatykać (np. fluorek poliwinylidenu, PVDF). 0,45 μm to kolejny popularny rozmiar filtra.
  10. Sprawdź masę wszystkich probarek ultrawirówek wraz z zawartością próbki i paruj probówki w ultrawirówce według masy. W razie potrzeby dodaj PPBS do lżejszej rury każdej pary, aby wyrównać wagę (z marginesem błędu 0,05 g dla lamp parowych).
  11. Ultrawirówka w 112 000 x g w temperaturze 4 °C przez 2 godziny i 25 minut.
    UWAGA: W zależności od użytego wirnika, czas trwania obrotu będzie się różnił (w zależności od współczynnika osadu = 58). Zapoznaj się z tabelą materiałów dla wirnika używanego tutaj. Przed wyjęciem rurek z ultrawirówki zwróć uwagę na orientację każdej rurki w wirniku, aby ułatwić lokalizację osadu wirusowego. Czasami po ultrawirowaniu osad wirusowy nie jest widoczny, dlatego należy zachować szczególną ostrożność przy usuwaniu supernatantu w kolejnym kroku.

3. Resuspendacja pelletów wirusowych i leczenie DNazą

  1. Usuń supernatant przez przelewanie lub pipetę, uważając, by nie ruszyć granula, który może być delikatny (granulat zawiera skoncentrowane wiriony).
    UWAGA: Jak wspomniano w kroku 2.11, osad może być widoczny lub nie, ale często można zobaczyć brązowy lub żółty okręt wielkości dziurka.
  2. Traktuj próbki DNazą.
    UWAGA: Jeśli zdecydujesz się nie poddawać próbkom DNazą, przejdź do kroku 4 i stosuj się do "Jeśli nie przeprowadzono zabiegu DNazy". Zapoznaj się z Dyskusją, aby rozważyć rozważenie przeprowadzenia leczenia DNazą.
    1. Ponownie zawiesz pellet w 100 μL wody wolnej od nukleazy o jakości biologii molekularnej w oznaczonej rurce mikrowirówki o pojemności 1,5 mL.
    2. Zrób mieszankę główną do zabiegu DNazy, dodając 10 μL buforu reakcji DNazy oraz 10 μL DNazy dla każdej próbki do obróbki. Pipetę dokładnie wymieszać.
      UWAGA: Przygotuj wystarczającą ilość mieszanki do leczenia DNazą, aby uzyskać dodatkowe reakcje i uwzględnić potencjalną utratę objętości podczas pipetowania w kroku 3.2.3.
    3. Dodaj 20 μL mieszanki głównej terapii DNazy do zawieszonych wirionów. Dobrze wymieszaj delikatnie pipetowanie. Inkubuj w 37 °C przez 30 minut.
    4. Dodaj 10 μL roztworu DNazowego zatrzymania, aby inaktywować nukleazy. Krótko wir.

4. Ekstrakcja wirusowych kwasów nukleinowych

  1. Wykonaj ekstrakcję DNA przy użyciu zestawu do ekstrakcji DNA wymienionego w Tabeli Materiałów.
    UWAGA: Wprowadź dwie modyfikacje do instrukcji producenta. 1) Po kroku 1 w procedurze zestawu podgrzej rurkę z wirionami w buforze CD1 w 65 °C przez 10 minut, a następnie przeprowadzić ekstrakcję zgodnie z instrukcjami producenta. 2) Podczas etapu elucii DNA (krok 16 w procedurze zestawu) inkubuj kolumny w temperaturze pokojowej przez 5 minut po dodaniu C6.
    1. Jeśli leczenie DNazą zostało przeprowadzone: Po inaktywacji nukleaz (w kroku 3.2.4) należy użyć całej objętości jako wejścia do ekstrakcji DNA (tj. w kroku 1 procedury ekstrakcji DNA dodać tę objętość do rurki z kulkami zawierającą 800 μL CD1). Upewnij się, że nie zostawisz żadnego roztworu (ten roztwór zawiera wiriony).
    2. Jeśli nie przeprowadzono zabiegu DNazy: Dodaj 100 μL wody wolnej od nukleazy molekularnej do rurki ultrawirówki zawierającej granulek od kroku 3.1. Delikatnie zeskrobaj granulki i ponownie zawiesnij. Użyj ponownie zawiesowanego pelletu jako wejścia do ekstrakcji DNA.

5. Ilościowa identyfikacja DNA

  1. Ilościowo określić wyodrębnione DNA metodą opartą na fluorescencji według wyboru.
    UWAGA: Wydajność DNA wirusomowego rzadko jest wystarczająco wysoka do ilościowej analizy opartej na absorpcji; Jednak nadal może to być pomocne w identyfikacji zanieczyszczeń chemicznych.
  2. Do przechowywania krótkotrwałego przechowuj DNA w temperaturze -20 °C po ilościowaniu. Do dłuższego przechowywania przechowywać w temperaturze -80 °C. DNA jest już gotowe do przygotowania i sekwencjonowania w bibliotece. Zapoznaj się z Tabelą Materiałów dotyczącą zestawu przygotowawczego biblioteki oraz platformy sekwencyjnej użytej tutaj.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Eksperyment badawczy polegający na zastosowaniu tego protokołu do pojedynczej próbki zamrożonego kału (przetworzonej w technicznym trójkopiu dla wirusomów) wraz z dwoma próbkami gleby wykazał skuteczność w produkcji wysokiej jakości wirusomów z różnych typów próbek. Korzystając z danych sekwencjonowania filtrowanych jakościowo oraz de novo złożonych kontigów generowanych przez ten protokół, domniemane sekwencje wirusowe zostały zidentyfikowane za pomocą otwartoźródłowego narzędzia do identyfikacji wirus...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Protokół ten przedstawia stosunkowo prostą i adaptowalną metodę generowania wirusomów. Udowodniono to w glebach 14,15,16,21, i z powodzeniem stosuje się je tutaj do próbek ludzkiego kału. Protokół ten najlepiej odzyskuje pozakomórkowe, nienaruszone wirusy DNA i nie jest zaprojektowany do celowego odzyskiwania wirusów wewnątrzkomórkowych lub profagów (choć niektóre mogą zostać odzyskane z komóre...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają żadnych konfliktów interesów do zgłoszenia.

Podziękowania

Dziękujemy dr Seanowi Adamsowi, Trinie Knotts oraz Mohamedowi R. Alemu (University of California, Davis School of Medicine) za zebranie i udostępnienie próbki stolca zgodnie z protokołami IRB i standardami etycznymi. Dziękujemy dr. Matthew R. Olmowi (University of Colorado, Boulder) za współpracę przy analizie próbki stolca. Badania te zostały wsparte przez NIH Common Fund (Program Wirusomu Człowieka), Nagroda #U01DE034198. LSH był również częściowo wspierany przez Departament Energii USA (DOE), Office of Science, Office of Biological and Environmental Research (BER), Program Genomic Science, numer nagrody DE-SC0023127 (grant dla JBE, grant PI Sydney Glassman).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Proszek bez DNazy i Proteazy z albuminy surowicy bydłej (BSA)BioReagenty FisheraBP9706100Przepis na PPBS (Krok 1.1)
Zestaw Pro DNeasy PowerSoilQIAGEN47016Zestaw do ekstrakcji DNA (Krok 4.1)
Zestaw biblioteczny KAPA DNA HyperPrepRocheNie maBiblioteki generowane przez ten zestaw były sekwencjonowane przy użyciu platformy Illumina NovaSeq 6000 (2 x 150 bp).
Siarczan magnezu (MgSO4), bezwodni, ≥ 99.5%Sigma-AldrichM7506Przepis na PPBS (Krok 1.1)
Sól fizjologiczna z buforem fosforanowym (PBS), 10x, pH 7,4, wolna od RNazyInvitrogenAM9624Przepis na PPBS (Krok 1.1)
Filtry membranowe z polietersulfonu (PES), sterylne, 28 mm, 0,2 μ mCorning431229Do filtracji strzykawkowej (Krok 2.9)
Stożkowe rurki wirówki z polipropylenu, sterylne, 50 mLOlympus Plastics28-108
Monohydrat cytrynianu potasu (krystaliczny/certyfikowany)Fisher ChemicalP222Przepis na PPBS (Krok 1.1)
Qubit  Probówki testoweInvitrogenQ32856Do ilościowej identyfikacji DNA (Krok 5.1)
Fluorometr Qubit 4InvitrogenQ33238Do ilościowej identyfikacji DNA (Krok 5.1)
Zestawy do kwantyfikacji qubitu dsDNAInvitrogenQ32850Do ilościowej identyfikacji DNA (Krok 5.1)
RQ1 DNaza wolna od RNazyPromegaPR-M6101Zawiera bufor reakcji, DNazę oraz roztwór stop
Filtry membranowe Supor hydrofilowe polietersulfonu (PES), sterylne, 32 mm, 5,00 & mikro; m Cytiva (dawniej Pall Lab)28150-956Do filtracji strzykawkowej (Krok 2.9)
Wirnik ultrawirówki: wirnik o stałym kącie typu 50.2 Ti, 50.000 obr./min, 302.000 x g, 12 x 39 mBeckman Coulter337901Używamy także wirnika tytanowego Beckman Coulter Type 70 Ti o stałym kącie (Cat. 337922). Wiruj przez 3 godziny, jeśli używasz 70 Ti.
Rurki ultrawirówki: butelka poliwęglanowa 26,3 mL z zespołem zakrętki, 25 x 89mmBeckman Coulter355618Kompatybilny z wirnikami Beckman Coulter Type 50.2 Ti (Cat. 337901) oraz Type 70 Ti (Cat. 337922)
Ultrawirówka: Podłogowa ultrawirówka Beckman Instruments Optima LE-80KBeckman Coulter365668Używamy także chłodniczej ultrawirówki Beckman Coulter L8-70M (Cat. 344196)

Bibliografia

  1. Breitbart, M., et al. Metagenomic Analyses of an Uncultured Viral Community from Human Feces. J Bacteriol. 185 (20), 6220-6223 (2003).
  2. Liang, G., Bushman, F. D. The human virome: assembly, composition and host interactions. Nat Rev Microbiol. 19 (8), 514-527 (2021).
  3. Callanan, J., Stockdale, S. R., Shkoporov, A., Draper, L. A., Ross, R. P., Hill, C. Biases in Viral Metagenomics-Based Detection, Cataloguing and Quantification of Bacteriophage Genomes in Human Faeces, a Review. Microorganisms. 9 (3), 524(2021).
  4. Garmaeva, S., Sinha, T., Kurilshikov, A., Fu, J., Wijmenga, C., Zhernakova, A. Studying the gut virome in the metagenomic era: challenges and perspectives. BMC Biol. 17 (1), 84(2019).
  5. Lewandowska, D. W., et al. Optimization and validation of sample preparation for metagenomic sequencing of viruses in clinical samples. Microbiome. 5 (1), 94(2017).
  6. Conceição-Neto, N., et al. Modular approach to customise sample preparation procedures for viral metagenomics: a reproducible protocol for virome analysis. Sci Rep. 5 (1), 16532(2015).
  7. Palermo, C. N., Shea, D. W., Short, S. M. Analysis of Different Size Fractions Provides a More Complete Perspective of Viral Diversity in a Freshwater Embayment. Appl Environ Microbiol. 87 (11), e00197-e00221 (2021).
  8. Kleiner, M., Hooper, L. V., Duerkop, B. A. Evaluation of methods to purify virus-like particles for metagenomic sequencing of intestinal viromes. BMC Genomics. 16 (1), 7(2015).
  9. Fudyma, J. D., et al. Exploring viral particle, soil, and extraction buffer physicochemical characteristics and their impacts on extractable viral communities. Soil Biol Biochem. 194, 109419(2024).
  10. Zhai, X., et al. The impact of storage buffer and storage conditions on fecal samples for bacteriophage infectivity and metavirome analyses. Microbiome. 11 (1), 193(2023).
  11. Trubl, G., Solonenko, N., Chittick, L., Solonenko, S. A., Rich, V. I., Sullivan, M. B. Optimization of viral resuspension methods for carbon-rich soils along a permafrost thaw gradient. PeerJ. 4, e1999(2016).
  12. Roux, S., et al. Towards quantitative viromics for both double-stranded and single-stranded DNA viruses. PeerJ. 4, e2777(2016).
  13. Kim, K. H., Bae, J. W. Amplification methods bias metagenomic libraries of uncultured single-stranded and double-stranded DNA viruses. Appl Environ Microbiol. 77 (21), 7668(2011).
  14. ter Horst, A. M., et al. Minnesota peat viromes reveal terrestrial and aquatic niche partitioning for local and global viral populations (vol 9, 233, 2021). Microbiome. 9 (1), (2021).
  15. Sorensen, J., Zinke, L., ter Horst, A., Santos-Medellín, C., Schroeder, A., Emerson, J. DNase Treatment Improves Viral Enrichment in Agricultural Soil Viromes. mSystems. 6 (5), e00614-e00621 (2021).
  16. Santos-Medellín, C., Estera-Molina, K., Yuan, M., Pett-Ridge, J., Firestone, M. K., Emerson, J. B. Spatial turnover of soil viral populations and genotypes overlain by cohesive responses to moisture in grasslands. Proc Natl Acad Sci U S A. 119 (45), e2209132119(2022).
  17. Emerson, J. B., Geonczy, S. E., Santos-Medellín, C., ter Horst, A. M., Fudyma, J. D. Soil Viromics Protocol - Emerson Lab v1. Protocols.io. , https://protocols.io/view/soil-viromics-protocol-emerson-lab-v1-b7nyrmfw/v1 (2022).
  18. Göller, P. C., Haro-Moreno, J. M., Rodriguez-Valera, F., Loessner, M. J., Gómez-Sanz, E. Uncovering a hidden diversity: optimized protocols for the extraction of dsDNA bacteriophages from soil. Microbiome. 8 (1), 17(2020).
  19. Larsen, F. SM buffer. , Protocols.io. https://www.protocols.io/view/sm-buffer-8epv5967jg1b/v1 (2021).
  20. Camargo, A. P., et al. Identification of mobile genetic elements with geNomad. Nat Biotechnol. , (2023).
  21. Santos-Medellín, C., Blazewicz, S. J., Pett-Ridge, J., Firestone, M. K., Emerson, J. B. Viral but not bacterial community successional patterns reflect extreme turnover shortly after rewetting dry soils. Nat Ecol Evol. 7 (11), 1809-1822 (2023).
  22. Halary, S., Temmam, S., Raoult, D., Desnues, C. Viral metagenomics: are we missing the giants. Curr Opin Microbiol. 31, 34-43 (2016).
  23. Williamson, S. J., et al. Metagenomic exploration of viruses throughout the Indian Ocean. PLoS One. 7 (10), e42047(2012).
  24. Liang, G., et al. The stepwise assembly of the neonatal virome is modulated by breastfeeding. Nature. 581 (7809), 470-474 (2020).
  25. Hillary, L. S., Knotts, T. A., Adams, S. H., Ali, M. R., Olm, M. R., Emerson, J. B. DNA extraction and virome processing methods strongly influence recovered human gut viral community characteristics. bioRxiv. , (2025).
  26. Santos-Medellín, C., Zinke, L. A., ter Horst, A. M., Gelardi, D. L., Parikh, S. J., Emerson, J. B. Viromes outperform total metagenomes in revealing the spatiotemporal patterns of agricultural soil viral communities. ISME J. 15 (7), 1956-1970 (2021).
  27. Gregory, A. C., Zablocki, O., Zayed, A. A., Howell, A., Bolduc, B., Sullivan, M. B. The Gut Virome Database Reveals Age-Dependent Patterns of Virome Diversity in the Human Gut. Cell Host Microbe. 28 (5), 724-740 (2020).
  28. Yilmaz, S., Allgaier, M., Hugenholtz, P. Multiple displacement amplification compromises quantitative analysis of metagenomes. Nat Methods. 7 (12), 943-944 (2010).
  29. Kosmopoulos, J. C., Klier, K. M., Langwig, M. V., Tran, P. Q., Anantharaman, K. Viromes vs. mixed community metagenomes: choice of method dictates interpretation of viral community ecology. Microbiome. 12 (1), 195(2024).
  30. Zhai, X., Gobbi, A., Kot, W., Krych, L., Nielsen, D. S., Deng, L. A single-stranded based library preparation method for virome characterization. Microbiome. 12 (1), 219(2024).
  31. Hillary, L. S., Adriaenssens, E. M., Jones, D. L., McDonald, J. E. RNA-viromics reveals diverse communities of soil RNA viruses with the potential to affect grassland ecosystems across multiple trophic levels. ISME Commun. 2, 34(2022).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Metagenomika wirusowaludzki wiromwirom ka uekstrakcja DNAultracentryfugacjask ad spo eczno ci wirusowejmetoda filtracjimetagenomika shotgunsekwencjonowanie wiromu
Metagenomika frakcji wirusa DNA dla próbek ludzkiego kału
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.