Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł badawczy
To badanie wykorzystało sekwencjonowanie rRNA 16S w celu porównania mikrobioty jelitowej u zdrowych osób kontrolnych, nieleczonych pacjentów z PD oraz pacjentów z PD leczonych piribedylem i zidentyfikowało różnice w składzie mikrobioty związane z leczeniem piribedylem.
Niniejsze badanie miało na celu określenie, czy terapia piribedylem zmienia mikrobiotę jelitową pacjentów z chorobą Parkinsona (PD), dostarczając teoretycznego odniesienia do zrozumienia zmian mikrobioty jelitowej indukowanych przez piribedyl i ich potencjalnych implikacji klinicznych. Próbki kału analizowano za pomocą sekwencjonowania genu 16S rybosomalnego RNA (16S rRNA). Porównano pacjentów z PD przyjmujących piribedyl (grupa piribedyl), pacjentów z PD, którzy nie przyjmowali piribedylu (grupa PD) oraz zdrowe osoby kontrolne (grupa śleppa). W porównaniu z grupą ślepymi, względna obfitość Staphylococcus, Rhodococcus oraz innych rodzajów była wyższa w grupie PD, podczas gdy względna obfitość Achromobacter i Delftia była niższa. Co więcej, względna obfitość Achromobacter, Delftia i Stenotrophomonas była wyższa w grupie piribedyl w porównaniu z grupą PD, podczas gdy względna obfitość Staphylococcus, Rhodococcus oraz innych gatunków była niższa. W porównaniu ze zdrowymi osobami, mikrobiota jelitowa pacjentów z PD wykazywała istotne zmiany. Mikrobiota jelitowa pacjentów przyjmujących piribedyl znacząco różniła się od tej u pacjentów nie leczonych. Wyniki te sugerują związek między piribedylem a zmienioną mikrobiotą jelitową u pacjentów z PD.
Zachorowalność na chorobę Parkinsona (PD) stopniowo wzrasta; jednak jej etiologia i patogeneza nie zostały jeszcze w pełni wyjaśnione. Więcej badań wskazuje, że mikrobiota jelitowa jest ściśle związana z wystąpieniem i rozwojem PD. He i in.1dokumentowali, że skład mikrobioty jelitowej u pacjentów z PD różni się od tej u zdrowych osób, a wzrost patogenów jelitowych może być związany z wystąpieniem PD. Scheperans i in.2potwierdzili, że względna obfitość Prevotella i Bacteroides w jelitach pacjentów z PD jest zmniejszona, a te gatunki bakterii są silnie związane z funkcją bariery jelitowej.
Kilka badań zbadano związek między mikrobiotą jelitową a PD. Badania sugerują, że dysbioza może odgrywać kluczową rolę w patofizjologii PD, wpływając na objawy ruchowe i nieruchowe poprzez wiele mechanizmów, w tym stany zapalne i zaburzenia metaboliczne3. Ponadto wykazano, że leki stosowane w leczeniu PD zmieniają skład mikrobiomu jelitowego4,5, co podkreśla złożoną interakcję między lekami a mikrobiomem jelitowym.
Jako nieselektywny agonista receptorów dopaminowych, piribedil jest istotny w leczeniu PD; może poprawiać objawy ruchowe u pacjentów poprzez stymulację receptorów dopaminowych6. Jednak jego kliniczne zastosowanie jest często ograniczone przez działania niepożądane, głównie objawy żołądkowo-jelitowe, w tym nudności, wymioty i dyskomfort w jamie brzusznej7. Mechanizm leżący u podstaw tych działań niepożądanych pozostaje niejasny, a to, czy są one związane ze zmianami mikrobioty jelitowej indukowanymi przez piribedil, nadal nie jest znane.
Związek między mikrobiotą jelitową a niepożądanymi reakcjiami na leki wzbudza coraz większe zainteresowanie w ostatnich latach. Hill-Burns i in.8analizowali mikrobiotę jelitową u pacjentów z PD i stwierdzili, że różnorodność mikrobioty jelitowej była związana z reakcją na terapię lekową. Ponadto, agonisty dopaminy mogą wpływać na ruchliwość jelit i skład mikrobioty9. Uważa się, że mechanizmy leżące u podstaw tych zmian obejmują zmiany w czasie transportu jelitowego, które z kolei wpływają na różnorodność i obfitość mikrobioty. Co więcej, mikrobiota jelitowa może wpływać na wchłanianie i metabolizm leków10, wpływając tym samym na skuteczność i działania niepożądane tych leków. Jednak nadal brakuje systematycznych badań na temat tego, czy i jak piribedil, powszechnie stosowany lek w chorobie Parkinsona, modyfikuje strukturę mikrobioty jelitowej, a także związku między takimi zmianami mikrobioty a jego niepożądanymi reakcjiami żołądkowo-jelitowymi.
W niniejszym badaniu porównaliśmy strukturę mikrobioty jelitowej u zdrowych osób kontrolnych, nieleczonych pacjentów z PD i pacjentów z PD leczonych piribedilem. Założyliśmy, że leczenie piribedilem wiąże się z wyraźnymi zmianami w składzie mikrobioty jelitowej u pacjentów z PD i że te zmiany mikrobioty mogą być związane z działaniami niepożądanymi ze strony przewodu pokarmowego związanymi z piribedilem. Naszym celem było zidentyfikowanie określonych zmian mikrobioty związanych z piribedilem i zbadanie ich potencjalnego związku z działaniami niepożądanymi ze strony przewodu pokarmowego, zapewniając tym samym teoretyczną podstawę do zrozumienia mechanizmu niepożądanych reakcji związanych z piribedilem.
Mikrobiota jelitowa jest ważnym kierunkiem badań nad patogenezą PD11. Obserwując wpływ piribedilu na mikrobiotę jelitową u pacjentów z PD, niniejsze badanie pomaga wyjaśnić kliniczne znaczenie zmian mikrobioty jelitowej związanych z lekami i dostarcza odniesienia do optymalizacji klinicznego stosowania i zarządzania bezpieczeństwem piribedilu.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Badanie to zostało przejrzane przez Komitet Etyczny Pierwszego Szpitala Afiliacyjnego Uniwersytetu Medycyny Chińskiej w Anhui (Numer przeglądu etycznego: 2025AH-101, Data zatwierdzenia etycznego: 2025-07-02).
Osoby badane
W badaniu wzięli udział pacjenci z chorobą Parkinsona i zdrowi dorośli w Pierwszym Szpitalu Afiliacyjnym Uniwersytetu Medycyny Chińskiej w Anhui. Zebrano świeże próbki kału w celu dalszej analizy. Świeże próbki kału zebrano, podzielono na alikwoty do sterylnych probówek EP, natychmiast schłodzono błyskawicznie w ciekłym azocie i przechowywano w temperaturze −80 °C do dalszej analizy. Kryteria przyjęcia pacjentów z chorobą Parkinsona były następujące: (1) klinicznie zdiagnozowana choroba Parkinsona; (2) wiek >70 lat; (3) w grupie Piribedil: rozpoczęcie monoterapii pirybedylem po zgłoszeniu i brak wcześniejszego kontaktu z tym lekiem; w grupie PD: niepoddanie się leczeniu lekami przeciw chorobie Parkinsona; (4) brak innych poważnych chorób układowych, takich jak poważne choroby serca, wątroby, nerek lub nowotwory. Przed zgłoszeniem uzyskano pisemną zgodę świadomie wyrażoną od każdego uczestnika. Kryteria wykluczenia były następujące: (1) ciężkie powikłania choroby Parkinsona, takie jak ciężka dysfunkcja ruchowa; (2) niedawne leczenie antybiotykami; (3) obecność innych stanów zdrowia, które mogą wpłynąć na wyniki badania, takie jak zapalne choroby jelit, zespół jelita drażliwego itp.; (4) alergia na pirybedyl. Zdrowi dorośli (Grupa Blank) byli osobami dopasowanymi pod względem wieku (wiek >70 lat) bez wywiadu chorób neurologicznych lub poważnych chorób przewodu pokarmowego.
Wszyscy uczestnicy musieli przestrzegać swoich zwykłych nawyków żywieniowych przed zgłoszeniem. Żaden z nich nie przyjmował probiotyków, prebiotyków, suplementów błonnika pokarmowego ani innych suplementów żywieniowych. Ponadto wszyscy uczestnicy nie przyjmowali żadnego leczenia antybiotykami przez co najmniej trzy miesiące przed pobraniem próbek. Podczas badania nie przeprowadzono standaryzowanej interwencji dietetycznej, ale wszystkim uczestnikom polecono zachowanie stabilnego trybu życia i diety, aby zminimalizować potencjalne wpływy na mikroflorę jelitową.
Grupy badawcze
Kohorta badawcza została podzielona na trzy grupy: Grupa PD (n = 10): próbki kału zebrane od pacjentów z chorobą Parkinsona, którzy nie przyjmowali leków przeciw chorobie Parkinsona. Grupa Piribedil (n=10): próbki kału zebrane od pacjentów z chorobą Parkinsona po 21 kolejnych dniach leczenia pirybedylem (50 mg, dwa razy dziennie). Grupa kontrolna (n=5): próbki kału zebrane od osób zdrowych.
Sekwencjonowanie 16S rRNA
Sekwencjonowanie przeprowadzono na platformie sekwencjonującej, zgodnie z raportami z innych badań12,13. Krótko mówiąc, całkowite DNA mikrobiomu wyizolowano z próbek kału za pomocą metody siarczanu dodecylowego sodu (SDS)14,15,16. Integralność wyizolowanego DNA zweryfikowano za pomocą elektroforetycznej separacji na żelu agarozy 1%. Stężenie i czystość DNA wyznaczono za pomocą spektrofotometru. Region V3-V4 genu 16S rRNA bakterii wyamplifikowano z DNA genomowego za pomocą degenerowanych primerów 341F (5’-CCTAYGGGRBGCASCAG-3’) i 806R (5’-GGACTACNNGGGTATCTAAT-3’) z użyciem cyklu termicznego reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR). Amplifikacja genu 16S rRNA bakterii przeprowadzona została w następujących warunkach termicznych: początkowy krok predenumeryzacji w 94 °C przez 2 min, następnie 28 cykli składających się z denaturacji w 94 °C przez 30 s, hybrydyzacji w 55 °C przez 30 s i ekstensji w 72 °C przez 30 s. Końcowe ekstensja przeprowadzono w 72 °C przez 10 min, a następnie reakcję utrzymywano w 4 °C. Mieszanki PCR zawierały 2× mieszanki PCR master mix 25 μL, dodatkowy primer (10 μM) 2 μL, rewersowy primer (10 μM) 2 μL, DNA szablonu 10 ng i w końcu ddH2O do 50 μL. Reakcje PCR przeprowadzono w potrójnym powtórzeniu. Mieszanki PCR zawierały 2× mieszanki PCR master mix 25 μL, dodatkowy primer (10 μM) 2 μL, rewersowy primer (10 μM) 2 μL, DNA szablonu 10 ng i w końcu ddH2O do 50 μL. Reakcje PCR przeprowadzono w potrójnym powtórzeniu. Produkt PCR wyodrębniono z 2% żelu agarozy i oczyszczono za pomocą zestawu do ekstrakcji z żelu. Do zbudowania biblioteki wykorzystano zestaw Universal Plus DNA Library Prep Kit for MGI V2: (1) Splinter link; (2) Użycie selek
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Różnice w różnorodności mikrobiologicznej związane z leczeniem piribedylem
Wyniki kontroli jakości ekstrakcji DNA (zakres stężenia, czystość) są przedstawione w Tabeli uzupełniającej 1. Kontrolę jakości amplifikacji PCR (wielkość pasma, stężenia odzysku) przedstawiono w Tabeli uzupełniającej 2. Dane dotyczące kontroli jakości sekwencjonowania (liczba odczytów, głębokość, pokrycie) są szczegółowo opisane w Tabeli uzupełniającej 3. Analizę mikro...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Choroba Parkinsona zajmuje drugie miejsce pod względem częstości występowania wśród chorób neurodegeneracyjnych na całym świecie, poprzedzona tylko przez chorobę Alzheimera23. Od 1970 roku piribedyl, jako agonissta receptorów dopaminowych, jest szeroko stosowany w leczeniu choroby Parkinsona24. Jednak w praktyce klinicznej piribedyl może powodować pewne reakcje niepożądane, takie jak nudności, wymioty i dyskomfort żołądkowo-jelitowy. Rosnąca liczba badań pokazuje, że rozwój...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Autorzy stwierdzają, że nie ma żadnych rywalizujących interesów.
Badanie to zostało wsparte przez Projekt Funduszu Naukowego Kandydatów na Członków Rezerwy Liderów Akademickich Prowincji Anhui (nr 2022H287), Projekt Naukowego i Zdrowotnego Wybitnych Talentów Prowincji Anhui (nr ahsjhmypygc20230074), Prowincjonalny Projekt Badań Naukowych w dziedzinie Dziedzictwa i Innowacyjności Tradycyjnej Medycyny Chińskiej (2025CCCX017) oraz Specjalny Projekt Integracji Podstawowej i Klinicznej Medycyny Tradycyjnej Chińskiej Uniwersytetu Medycyny Chińskiej (JCLCA2025009).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| 2× reaction buffer (Taq MasterMix) | Kangweii | CW0690 | |
| Agarose | (ogólny) | nie dotyczy | klasa do biologii molekularnej |
| AxyPrep DNA Gel Extraction Kit | Axygen Biosciences | (nie podano) | |
| Benchtop high-speed freezing centrifuge | Hunan Kosei | GTR116C | |
| DNA extraction reagents (SDS, phenol, chloroform, ethanol) | (ogólny) | nie dotyczy | |
| DNBSEQ-G99 PE300 sequencing platform | MGI Tech Co., Ltd | DNBSEQ-G99 | |
| Gel electrophoresis apparatus | Beijing Liuyi | DYY-8C | |
| Gel imaging system | Shanghai Jiapeng | JP-2880 | |
| LEfSe software | (open source) | wersja online | |
| NanoDrop spectrophotometer | Hangzhou Haipe | Aurora-900 | |
| PCR machine | Hangzhou Langji | A200 | |
| Piribedil | Servier | 6094078 | |
| Primers: 341F and 806R (synthesized) | (custom synthesis) | nie dotyczy | |
| QIIME software | (open source) | http://qiime.org | wersja 1.8.0 |
| Quantus Fluorometer | Promega | E6150 | |
| Qubit 4.0 Fluorometer | Invitrogen | Q33226 | |
| SDS (sodium dodecyl sulfate) | (ogólny) | nie dotyczy | |
| UPARSE software | (open source) | http://drive5.com/uparse | wersja 7.0.1090 |
| VAHTS Universal Plus DNA Library Prep Kit for MGI V2 | Vazyme | NDM627-01 |