Wraz ze wzrostem zainteresowania immunoterapią wnętrznowrzodową, wybór modeli nowotworów, które są dostępne i praktyczne, jest niezbędny. Guzy podskórne są łatwe do ustanowienia, ale trudne do wizualizowania i manipulowania. W tym protokole opisujemy metody generowania guzów śródskórnych, które zapewniają lepszą widoczność i dostępność.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Wszczepienie nowotworu śródskórnego jako solidny model badań nad immunoterapią guzów mysich wewnątrzguzikowych
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Ustanowienie reprodukowalnych modeli guzów u myszy jest niezbędne do oceny biologii raka i strategii immunoterapii. Wprzytułowa immunoterapia stosuje leki immunostymulujące do leczenia ustabilizowanych guzów, aby odwrócić miejscową supresję odpowiedzi immunologicznej i stymulować ogólnoustrojową odporność przeciwnowotworową. Większość badań nad rakiem na myszach tworzy guzy w przestrzeni podskórnej, co stwarza nieodłączne wyzwania dla eksperymentalnej immunoterapii wprzytułowej ze względu na niemożność wizualizowania iniekcji wprzytułowych. Wstrzyknięcie guzów podskórnie zapewnia niezawodne podejście do generowania wizualizacyjnych guzów, które wspierają dokładne i reprodukowalne wstrzyknięcia wprzytułowe oraz monitorowanie kinetyki wzrostu i odpowiedzi terapeutycznych. Przedstawiamy tutaj reprodukowalną metodologię ustanawiania i leczenia guzów wprzytułowych z wykorzystaniem mysiego modelu czerniaka B16F10 u myszy C57BL/6 jako przykład. Zawiesina komórek guzowych jest wstrzyknięta wprzytułowo, a 7–10 dni po implantacji guza, gdy guz osiągnie ~60 mm3, można zastosować iniekcję wprzytułową środków immunostymulujących lub fizyczne leczenie, takie jak elektroporacja lub ogrzewanie. Umożliwia to precyzyjne podawanie leków i pomiar wzrostu guza za pomocą dystansomierza i eliminuje wyzwanie związane z nieodłączną zmiennością wielokrotnych opracowań guzów podskórnych, które nie mogą być wizualizowane. Dzięki zapewnieniu szczegółowego wglądu w tę technikę, artykuł ten ma na celu wspieranie reprodukowalności i rozwój badań przedklinicznych w zakresie immunoterapii wprzytułowej.
Wprowadzenie
Modele tumorów u myszy stanowią niezbędne narzędzie w badaniach nad rakiem. W optymalnym modelu mysim, byłoby możliwe wywołanie guzów, które w znacznym stopniu naśladowałyby guzy ludzkie zarówno na poziomie genetycznym, jak i morfologicznym1. Umożliwia to ocenę i efektywność nowych podejść terapeutycznych w różnych dziedzinach, w tym intratumoralną immunoterapię (ITIT). ITIT to nowy obszar w leczeniu raka, który polega na bezpośrednim podaniu środków stymulujących układ odpornościowy do mikrośrodowiska guza (TME). Takie skoncentrowane podanie może zwiększyć lokalną aktywację odporności, odwrócić immunosupresyjne mikrośrodowisko guza i wywołać ogólnoustrojowe odpowiedzi odpornościowe przeciwnowotworowe, znane jako efekt abscopalny2. Jednak efektywność, dokładność i spójność doguzowowego podawania zależą od możliwości wizualizacji i kontroli parametrów wstrzyknięcia w różnych modelach nowotworów.
Większość przedklinicznych badań nad rakiem korzysta z podskórnego wszczepienia guzów. Jednak podejście to ma ograniczenia dla terapii doguzowowych, ponieważ guz nie może być bezpośrednio widziany podczas wstrzyknięcia, chyba że zostanie wykonana operacja. Wiele strategii doguzowowej immunoterapii wymaga precyzyjnego podania środków do małych guzów u myszy i często wymaga wykonania tego zadania wielokrotnie. Bez wizualnej potwierdzenia, dokładność wstrzyknięcia i zatrzymywanie środków w podskórnych guzach stają się słabo kontrolowanymi zmiennymi. Może to prowadzić do błędnej interpretacji/wariacji danych eksperymentalnych3.
Wszczepienie guza do skóry zapewnia bezpośrednią, dostępną, wizualizacyjną i powtarzalną alternatywę dla obserwacji, pomiaru i wstrzyknięć do guzów, zwiększając tym samym spójność. Co więcej, badania wykazały, że guzy wszczepione do skóry, w przeciwieństwie do wstrzyknięć podskórnych, zwiększają immunogenność i hamują zdolność nowotworową komórek nowotworowych4. Guzy wstrzyknięte do skóry wywoływały szybkie i silne przemieszczanie komórek dendrytycznych do węzłów chłonnych, co prowadziło do wcześniejszego i bardziej rozwiniętego aktywowania komórek T cytotoksycznych specyficznych dla nowotworu4. Niniejsze badanie opisuje szczegółowy i powtarzalny protokół dotyczący ustanawiania guzów melanomu B16F10 do skóry u myszy C57BL/6 i wykonywania późniejszych doguzowowych terapii.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Wszystkie procedury przeprowadzono za zgodą oraz zgodnie z wytycznymi Komitetu Opieki nad Zwierzętami Instytucjonalnymi (IACUC)5. Wszystkie procedury zwierzęce wykonano w zakładzie hodowli zwierząt w Dartmouth. Samice myszy C57BL/6, w wieku 6-8 tygodni, były trzymane w standardowych warunkach na wentylowanych stojakach z żywnością i wodą. Reagenty i użyte sprzęty są wymienione w Tabeli Materiałów.
1. Golenie myszy
UWAGA: Wszystko osoby muszą ukończyć szkolenie instytucjonalne w zakresie utrzymywania zwierząt żywych i znieczulenia przed wykonaniem tych procedur.
- Przed wstrzyknięciem do skóry, ogolić bok każdej myszy zgodnie z poniższym opisem; prawy bok był używany do wstrzyknięć i opisanych procedur. Ogolić myszy dzień przed wstrzyknięciem komórek nowotworowych.
- Umieść mysz na stabilnej powierzchni. Szczepnij mysz za skórę karku lewym kciukiem i wskazującym palcem, a lewa strona ciała delikatnie zanurzona w dłoni, aby odsłonić prawą stronę. Użyj palców serdecznych i/lub małego, aby trzymać lewą nogę i ogon, upewniając się, że prawy bok jest w pełni odsłonięty.
- Ogolić futro od tylnej nogi aż do dolnych żeber, aby stworzyć czysty obszar do wstrzyknięcia.
- Obie boki mogą być golone, jeśli potrzebna jest dodatkowa przestrzeń do ćwiczeń.
UWAGA: Początkujący mogą znieczulać myszy podczas nauki golenia i prawidłowego szczypania.
2. Ćwiczenia z wstrzyknięciami z barwnikiem
UWAGA: Ćwiczenia można wykonać zarówno na żywych (znieczulonych), jak i eutanatyzowanych myszach, oraz na obu płciach. Samce myszy zwykle mają grubszą i mniej elastyczną skórę w porównaniu z samicami, co sprawia, że procedura jest bardziej technicznie wymagająca. Z tego powodu ćwiczenie na samcach jest przydatne do rozwijania biegłości.
- Wymieszaj barwnik żywnościowy z buforem fosforanowym (PBS) w 1,5 mL probówce Eppendorfa, aż roztwór stanie się ciemny (w tym badaniu użyto niebieskiego barwnika żywnościowego).
- Uzyskaj myszy do ćwiczeń i znieczul je zgodnie z wytycznymi instytucjonalnej opieki nad zwierzętami. Nałożyć maść okulistyczną na oba oczy, aby zapobiec wysychaniu rogówki.
- Umieść znieczuloną mysz pod kapturem i przechylić ciało, aby odsłonić prawą stronę. Potwierdź odpowiednie znieczulenie, delikatnie szczypając poduszeczki stóp i obserwując brak reakcji.
- Włożyć 30 μL roztworu barwnika do strzykawki insulinowej 0,3 mL z igłą 29 G, ¾”. Usunąć wszystkie bąbelki powietrza.
- Używając niedominującej ręki, delikatnie szczypnąć i rozciągnąć nogę/skórę, aby stworzyć gładką, jędrną powierzchnię (unikaj podnoszenia skóry w górę). Wstawić igłę beczkowato do skóry pod kątem płaskim do skóry. Trzymaj igłę widoczną pod powierzchnią, aby potwierdzić umiejscowienie w skórze.
UWAGA: Podczas ćwiczeń testuj różne pozycje chwytu dłoni, aby utrzymać stabilne napięcie skóry, zachowując palce z dala od ścieżki igły. Wstawić igłę ~2 mm w skórę. Aby zmniejszyć wypływ, wstawić igłę ~3 mm, a następnie lekko wycofać, aby stworzyć "kieszeń" przed wstrzyknięciem. Pomaga to utrzymać barwnik w miejscu wstrzyknięcia. - Powoli wstrzyknąć wszystkie 30 μL roztworu barwnika, aż pod powierzchnią skóry utworzy się mała, wyraźna "bańka"
UWAGA: Brak widocznych bąbelek sugeruje, że wstrzyknięcie zostało wprowadzone podskórnie, a nie do skóry. Utrzymanie biecu w pozycji wzniesionej pomaga zapewnić dokładne umiejscowienie w skórze i zapobiega zbyt głębokiemu wstrzyknięciu. - Kontynuuj ćwiczenia, aż będziesz konsekwentnie tworzyć bańki do skóry. Na jedną stronę można wykonać do ośmiu wstrzyknięć.
- Po zakończeniu ćwiczeń wstrzyknięciowych, eutanatyzuj myszy zgodnie z zatwierdzonymi protokołami Instytucjonalnego Komitetu Opieki nad Zwierzętami i ich Wykorzystywania (IACUC)5.
3. Przygotowanie komórek nowotworowych do wstrzyknięcia
UWAGA: Przeprowadź wszystkie kroki związane z komórkami w sterylnym kapturze. Pamiętaj, że różne linie nowotworowe myszy rosną inaczej.
- Roztapiaj komórki nowotworowe (B16F10 użyte w tym badaniu) kilka dni przed wstrzyknięciami do skóry.
- Hodowaj komórki do 70-80% stężenia, zachowując odpowiednie świeże medium
UWAGA: Unikaj 100% stężenia, które powoduje zat
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Podczas ćwiczenia iniekcji z użyciem barwnika, pomyślne podanie śródskórne można zweryfikować bez uśmiercania myszy, obserwując powstanie widocznego „pęcherzyka” w miejscu wstrzyknięcia. Prawidłowo wykonana iniekcja śródskórna powoduje powstanie dużego, wyraźnie zarysowanego i wypukłego „pęcherzyka” (Rysunek 1A–F). Małe lub płaskie pęcherzyki sugerują, że iniekcja mogła zostać wykonana częściowo podskórnie. Jeśli „pęcherzyk” nie powstaje, a barwnik lub komórki rozprzestrzeni...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Sukces tego protokołu (Rysunek 4) zależy od utrzymania jednolitej głębokości wstrzyknięcia śródskórnego i precyzyjnego umieszczenia igły, aby zapewnić wstrzyknięcie do warstwy dermalnej, a nie podskórnej. Jeśli kąt igły jest zbyt stromy lub ciśnienie wstrzyknięcia jest zbyt wysokie, barwnik lub komórki nowotworowe mogą zostać zdeponowane przez skórę w przestrzeni podskórnej. Po wstrzyknięciu chwilowe zatrzymanie się przed powolnym wyjęciem igły pomaga zapobiec wyciekowi lub tworzeniu podwójn...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają żadnych sporów interesów do ujawnięcia.
Podziękowania
AS dziękuje Grantowi Szkoleniowymu z Immunologii, T32 AI007363. KSK wdzięcznie dziękuje Fundacji Schlumberger za wsparcie w ramach programu Faculty for the Future.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| 1.5 mL Natural Centrifuge Tube | USA Scientific | 1615-5500 | |
| 150 cm2 Cell Culture Flask | Corning | 430825 | |
| Fluriso | Vet One | 13985-528-60 | izofluran |
| Food Coloring | Durkee | do ćwiczeń | |
| Insulin syringe 0.33 x 12.7 mm | Exel | 26018 | |
| Mini Arco | Wahl | 08787-450A | maszynka do golenia myszy |
| PBS, 1X w/o calcium & magnesium | Corning | 06325002 | pH 7.4 +/- 0.1 |
| RPMI 1640, 1x | Corning | 12225004 | |
| SomnoFlo Low-Flow Electronic Vaporizer | Kent Scientific | SF-01 | urządzenie do znieczulania |
Bibliografia
- Zhang, W., Moore, L., Ji, P. Mouse models for cancer research. Chin J Cancer. 30 (3), 149-152 (2011).
- Silihe Kamga, K., Fiering, S. Intratumoral immunotherapy prior to cancer surgery a promising therapeutic approach. Front Immunol. 16, 1545000 (2025).
- Carlson, P. M., et al. Depth of tumor implantation affects response to in situ vaccination in a syngeneic murine melanoma model. J Immunother Cancer. 9 (4), e002107 (2021).
- Bonnotte, B., et al. Intradermal injection as opposed to subcutaneous injection enhances immunogenicity and suppresses tumorigenicity of tumor cells. Cancer Res. 63 (9), 2145-2149 (2003).
- Garber, J. C., et al. . Guide for the care and use of laboratory animals. , (2011).
- Ya, Z., Hailemichael, Y., Overwijk, W., Restifo, N. P. Mouse model for pre-clinical study of human cancer immunotherapy. Curr Protoc Immunol. 109, 20.1.1-20.1.43 (2015).
- Mao, C., Beiss, V., Ho, G. W., Fields, J., Steinmetz, N. F., et al. In situ. vaccination with cowpea mosaic virus elicits systemic antitumor immunity and potentiates immune checkpoint blockade. J Immunother Cancer. 10 (12), e005834 (2022).
- Ho, G. W., et al. Intratumoral expression of IL-12 and CD40 ligand (CD154) from plasmids generates antitumor responses that eliminate tumoral T regs. Sci Rep. 15 (1), 24439 (2025).
- Kim, Y. C., Jarrahian, C., Zehrung, D., Mitragotri, S., Prausnitz, M. R. Delivery systems for intradermal vaccination. Curr Top Microbiol Immunol. 351, 77-112 (2012).
- Chen, X. Emerging adjuvants for intradermal vaccination. Int J Pharm. 632, 122559 (2023).
- Hickling, J. K., Jones, K. R., Friede, M., Zehrung, D., Chen, D., et al. Intradermal delivery of vaccines: potential benefits and current challenges. Bull World Health Organ. 89 (3), 221-226 (2011).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
