Związek przyczynowy między udarem niedokrwiennym a otępieniem naczyniowym: badanie randomizacji mendlowskiej

Podsumowanie

Niniejszy protokół opisuje powtarzalny schemat pracy randomizacji mendlowskiej dla dwóch próbek w celu oceny potencjalnego związku przyczynowego między udarem niedokrwiennym a otępieniem naczyniowym, z wykorzystaniem publicznie dostępnych statystyk podsumowujących badania asocjacji całego genomu (GWAS).

Streszczenie

Udar niedokrwienny (IS) jest główną przyczyną niepełnosprawności i śmiertelności na całym świecie, a otępienie naczyniowe (VaD) to częsty podtyp otępienia związany z uszkodzeniami naczyń mózgowych. Badania obserwacyjne sugerowały istnienie związku między IS a VaD, jednak badania te są podatne na wpływ czynników zakłócających oraz odwróconą przyczynowość. Niniejszy protokół opisuje powtarzalny schemat randomizacji mendlowskiej (MR) dla dwóch próbek w celu oceny potencjalnego związku przyczynowego między IS a VaD z wykorzystaniem publicznie dostępnych statystyk zbiorczych z badań asocjacyjnych całego genomu (GWAS). Instrumenty genetyczne związane z IS wyekstrahowano z publicznego zbioru danych GWAS, a asocjacje z wynikiem dla VaD uzyskano z publicznego zbioru danych GWAS dla VaD. Odpowiednie identyfikatory zbiorów danych znajdują się w sekcji Protokół. Po dopasowaniu wyników i harmonizacji alleli, do końcowej analizy MR wybrano 51 polimorfizmów pojedynczego nukleotydu (SNPs). Schemat obejmuje wybór zmiennych instrumentalnych, grupowanie w obrębie nierównowagi sprzężeń (clumping), harmonizację alleli, ocenę siły instrumentów, analizę ważoną odwrotnością wariancji (IVW), analizę ważonej mediany, analizę MR-Egger, testowanie heterogeniczności, ocenę plejotropii horyzontalnej oraz analizę wrażliwości z pominięciem jednego elementu (leave-one-out). W analizie reprezentatywnej metoda IVW wykazała pozytywną korelację między genetycznie przewidywanym IS a ryzykiem VaD, a metoda ważonej mediany dostarczyła rezultatu zgodnego pod względem kierunku. Estymacja MR-Egger była zgodna pod względem kierunku, ale nie osiągnęła istotności statystycznej. Zatem wyniki te należy interpretować jako sugestywne dowody na możliwy efekt przyczynowy, a nie jako ostateczny dowód przyczynowości. Niniejszy protokół może pomóc badaczom w zastosowaniu przejrzystego i powtarzalnego schematu MR do badania wyników związanych z chorobami naczyniowymi mózgu przy użyciu publicznych danych GWAS.

Wprowadzenie

Udar niedokrwienny (IS) jest główną przyczyną ciężkiej niepełnosprawności i zgonów na całym świecie¹. Według najnowszych danych z badania Global Burden of Disease Study zapadalność na IS w skali globalnej spadła, jednak pozostaje on znacznym obciążeniem, szczególnie w Europie Wschodniej, Azji Wschodniej, Azji Środkowej oraz w Afryce Subsaharyjskiej^2,3. Ponadto zapadalność na IS rośnie w krajach o niskim wskaźniku socjodemograficznym (SDI) i przewiduje się, że tendencja wzrostowa utrzyma się w latach 2020–2030.

Liczne badania epidemiologiczne sugerowały potencjalny związek między chorobami naczyniowymi mózgu a otępieniem naczyniowym (VaD)^4,5. Szczególnie w Chinach VaD jest jednym z najczęstszych typów otępienia wśród osób starszych, a wysoka zapadalność na IS jest ściśle powiązana z występowaniem VaD. Jednak większość istniejących badań ma charakter obserwacyjny, a resztkowe zakłócenia, odwrócona przyczynowość oraz różnice w definicji choroby mogą ograniczać interpretację przyczynowo-skutkową. W związku z tym konieczne są dodatkowe podejścia analityczne, aby ocenić, czy IS potencjalnie bierze udział w rozwoju VaD.

IS może wpływać na wystąpienie VaD poprzez kilka mechanizmów. Uszkodzenia naczyniowo-mózgowe spowodowane przez IS mogą prowadzić do niewystarczającej perfuzji mózgowej i następujących po niej zmian neurodegeneracyjnych⁶. Ponadto VaD może być powiązane z przewlekłym uszkodzeniem naczyń mózgowych, uszkodzeniami mikro naczyniowymi oraz odpowiedziami zapalnymi po IS^7,8. Dlatego badanie związku między IS a VaD jest istotne dla zrozumienia potencjalnych powiązań chorobowych i wyznaczenia przyszłych strategii zapobiegawczych.

Randomizacja mendlowska (MR) jest metodą analityczną, która wykorzystuje warianty genetyczne jako zmienne instrumentalne do oceny potencjalnych związków przyczynowych między ekspozycją a wynikiem⁹. W porównaniu z konwencjonalnymi badaniami obserwacyjnymi, MR pozwala ograniczyć wpływ czynników zakłócających oraz błąd przyczynowości odwrotnej, pod warunkiem spełnienia założeń dotyczących poprawności zmiennych instrumentalnych. W porównaniu z randomizowanymi badaniami kontrolowanymi lub modelami eksperymentalnymi, MR umożliwia wykorzystanie istniejących statystyk zbiorczych z badań GWAS (badania asocjacyjne całego genomu) do oceny istotnych klinicznie zależności w sytuacjach, gdy bezpośrednie badania interwencyjne są niewykonalne, nieetyczne lub trudne do przeprowadzenia. Niedawne badania genetyczne z zastosowaniem podejścia randomizacji mendlowskiej analizowały związek między IS a VaD¹⁰. Niemniej jednak, szczegółowe opisy na poziomie protokołu dotyczące wyboru instrumentu ekspozycji, ekstrakcji danych o wyniku, harmonizacji alleli, oceny siły instrumentu, testowania heterogeniczności, oceny plejotropii oraz analiz wrażliwości pozostają kluczowe dla powtarzalnej implementacji metody.

Niniejszy protokół jest odpowiedni w sytuacjach, gdy dostępne są publicznie statystyki podsumowujące GWAS zarówno dla ekspozycji, jak i badanego punktu końcowego, można dobrać poprawne instrumenty genetyczne dla ekspozycji, a pytanie badawcze ma na celu ocenę potencjalnego związku przyczynowego, a nie bezpośrednie ustalenie mechanizmów biologicznych. W związku z tym badanie to przedstawia protokół dwupróbkowej analizy MR w celu oceny potencjalnego związku przyczynowego między IS a VaD z wykorzystaniem publicznie dostępnych statystyk podsumowujących GWAS. Celem jest zapewnienie odtwarzalnego schematu analitycznego, a nie ustalenie definitywnych mechanizmów biologicznych. Protokół ten opisuje dobór instrumentów genetycznych, dopasowanie punktów końcowych, harmonizację alleli, szacowanie MR oraz analizy wrażliwości, wykorzystując związek IS-VaD jako reprezentatywny przykład.

Protokół

W niniejszym badaniu wykorzystano publicznie dostępne statystyki podsumowujące GWAS. Pierwotne badania uzyskały zgodę komisji etyki oraz świadomą zgodę uczestników. W przypadku tej wtórnej analizy nie było wymaganych dodatkowych zgód etycznych.

1. Projekt badania i oświadczenie etyczne

1. Zastosuj dwupróbkowy projekt MR w celu oceny potencjalnego związku przyczynowego między IS a VaD.
2. Wykorzystaj wyłącznie publicznie dostępne statystyki podsumowujące GWAS. Ponieważ wszystkie oryginalne badania zawarte w zbiorach danych GWAS otrzymały zatwierdzenie komisji bioetycznej oraz świadomą zgodę uczestników, ta wtórna analiza nie wymaga dodatkowej zgody etycznej.
3. Przed ekstrakcją danych zdefiniuj IS jako ekspozycję, a VaD jako wynik.

2. Przygotowanie oprogramowania

1. Przeprowadź wszystkie analizy przy użyciu oprogramowania statystycznego R.
2. Załaduj pakiet TwoSampleMR do ekstrakcji instrumentów, ekstrakcji danych o wynikach, harmonizacji alleli, estymacji MR, testowania heterogeniczności oraz analiz wrażliwości. Załaduj pakiet MRPRESSO w celu oceny globalnej plejotropii horyzontalnej oraz potencjalnych wariantów odstających.
3. W ramach przepływu pracy wykorzystaj następujące funkcje rdzeniowe: extract_instruments, extract_outcome_data, harmonise_data, mr, generate_odds_ratios, mr_heterogeneity, mr_pleiotropy_test, mr_singlesnp, mr_leaveoneout, mr_scatter_plot, mr_forest_plot, mr_funnel_plot oraz mr_leaveoneout_plot. Użyj funkcji MRPRESSO::mr_presso do przeprowadzenia globalnego testu MR-PRESSO, a w razie potrzeby testów wariantów odstających i zniekształceń.

3. Wybór zbioru danych ekspozycji i przesiewanie zmiennych instrumentalnych

1. Wyodrębnić polimorfizmy pojedynczego nukleotydu (SNP) związane z IS z zestawu danych IEU OpenGWAS ebi-a-GCST90018864. Zestaw ten obejmuje 11 929 przypadków IS oraz 472 192 osoby z grupy kontrolnej, co daje całkowitą liczebność próby wynoszącą 484 121 uczestników.
2. Wybrać kandydatów SNP powiązanych z IS, stosując próg istotności p < 5 × 10^-6.
   1. Próg p < 5 × 10^-6 jest stosowany w tym reprezentatywnym protokole, aby zachować odpowiednią liczbę niezależnych instrumentów do analizy wrażliwości. Ponieważ próg ten jest mniej rygorystyczny niż konwencjonalny próg istotności dla całego genomu, wyniki oparte na tych instrumentach należy interpretować jako eksploracyjne i sugerujące, a nie rozstrzygające.
3. Przeprowadzić grupowanie (clumping) w celu usunięcia SNP w nierównowadze sprzężeń i zachowania niezależnych SNP. Zastosować próg r² wynoszący 0,001 oraz okno grupowania o szerokości 10 000 kb.
4. Użyć następującego polecenia w programie R, aby wyodrębnić instrumenty kandydackie:
   extract_instruments(outcomes = "ebi-a-GCST90018864", p1 = 5e-06, clump = TRUE)
5. Obliczyć statystykę F dla każdego zachowanego SNP, korzystając ze wzoru F = (β/SE)², gdzie β i SE oznaczają odpowiednio szacunek efektu SNP–ekspozycja oraz błąd standardowy.
6. Wykluczyć SNP ze statystyką F < 10, aby zmniejszyć ryzyko obciążenia słabym instrumentem. Podsumować rozkład statystyk F, podając wartość minimalną, maksymalną, medianę oraz rozstęp międzykwartylowy (IQR).

4. Ekstrakcja zbioru danych wynikowych

1. Wyekstrahuj powiązania z wynikiem VaD z zestawu danych FinnGen GWAS finn-b-F5_VASCDEM. Zestaw ten obejmuje 881 przypadków VaD oraz 211 508 osób z grupy kontrolnej.
2. Wyekstrahuj powiązania z wynikiem dla wszystkich wybranych SNP związanych z IS, korzystając z funkcji extract_outcome_data.
3. W przypadku braku bezpośredniej dostępności docelowych SNP w zestawie danych z wynikiem, wyszukaj SNP zastępcze (proxy SNPs). Zachowaj warianty dopasowane jako proxy, gdy dostępne są poprawne informacje o proxy oraz odpowiedniość alleli.
4. Użyj następującego polecenia R do wyekstrahowania zestawu danych z wynikiem:
   extract_outcome_data(snps = exp_dat$SNP, outcomes = "finn-b-F5_VASCDEM", access_token = NULL)

5. Harmonizacja alleli i retencja SNP

1. Zharmonizuj zestawy danych dla ekspozycji i wyniku przed przeprowadzeniem analizy MR.
2. Dostosuj allel efektowy oraz allel alternatywny w taki sposób, aby szacunki efektów dla par SNP–ekspozycja oraz SNP–wynik odnosiły się do tego samego allelu efektowego.
3. Podczas harmonizacji sprawdź polimorfizmy SNP, aby zidentyfikować niezgodności alleli, brakujące powiązania z wynikiem oraz niejednoznaczne dopasowanie alleli. Zachowaj SNP, dla których po harmonizacji dostępne są szacunki efektów ekspozycji i wyniku.
4. Do harmonizacji alleli użyj następującego polecenia w języku R: harmonise_data(exposure_dat = exp_dat, outcome_dat = out_dat, action = 1)
5. Zapisz liczbę SNP początkowo wyekstrahowanych z zestawu danych ekspozycji, liczbę SNP z dostępnymi powiązaniami z wynikiem, liczbę wariantów dopasowanych za pomocą proxy oraz liczbę SNP zachowanych do końcowej analizy MR.

6. Podstawowa analiza MR i analizy wrażliwości

1. Przeprowadź główną analizę MR przy użyciu metody odwrotnej wagi wariancji (IVW).
2. Przeprowadź uzupełniające analizy MR przy użyciu metod ważnej mediany oraz MR-Egger, aby ocenić spójność szacunków przyczynowych przy różnych założeniach.
3. Wygeneruj ilorazy szans (OR) oraz 95% przedziały ufności (CI) na podstawie szacunków MR.
4. Użyj następujących poleceń w programie R, aby przeprowadzić analizę MR i obliczyć OR:
   res <- mr(dat)
   res <- generate_odds_ratios(res)
5. Ponieważ ocenie podlega jedno predefiniowane główne powiązanie między ekspozycją a wynikiem, przyjmij próg skorygowany metodą Bonferroniego dla głównego wnioskowania MR jako 0,05/1 = 0,05. Jako próg istotności statystycznej dla głównej analizy IVW przyjmij dwustronną wartość p < 0,05.
6. Aby osadzić precyzję statystyczną głównej analizy w kontekście ograniczonej liczby przypadków VaD, przeprowadź post hoc obliczenia mocy dwustronnego testu Walda w oparciu o zaobserwowany szacunek IVW oraz jego błąd standardowy. Oblicz moc, korzystając z parametru niecentralności βIVW/SEIVW przy dwustronnym poziomie α równym 0,05. Oblicz minimalny wykrywalny efekt odpowiadający mocy 80% jako exp[(z0.975 + z0.80) × SE]. Ponieważ IS jest ekspozycją binarną, a powiązania między SNP a ekspozycją są wyrażone w skali logarytmu szans, przedstaw tę analizę jako opisową ocenę precyzji uwarunkowaną efektem, a nie jako predefiniowane obliczenie wielkości próby¹¹.

7. Analizy heterogeniczności, plejotropii horyzontalnej i analizy z pominięciem jednego badania (leave-one-out)

1. Oceń heterogeniczność między SNP, stosując statystykę Q Cochrana.
2. Użyj poniższej komendy w programie R, aby obliczyć statystyki heterogeniczności:
   mr_heterogeneity(dat)
3. Oceń kierunkową plejotropię horyzontalną za pomocą testu przecięcia MR-Egger.
4. Użyj poniższej komendy w programie R, aby obliczyć punkt przecięcia MR-Egger:
   mr_pleiotropy_test(dat)
5. Oceń globalną plejotropię horyzontalną oraz potencjalne warianty odstające za pomocą MR-PRESSO, przeprowadzając 10 000 symulacji, przy progu istotności 0,05 oraz włączonych testach wariantów odstających (outlier) i zniekształceń (distortion)¹².
6. Użyj poniższej komendy w programie R do analizy MR-PRESSO:
   set.seed(20260729)
   mr_presso(
   BetaOutcome = "beta.outcome",
   BetaExposure = "beta.exposure",
   SdOutcome = "se.outcome",
   SdExposure = "se.exposure",
   OUTLIERtest = TRUE,
   DISTORTIONtest = TRUE,
   data = dat,
   NbDistribution = 10000,
   SignifThreshold = 0.05
   )
7. Przeprowadź analizę pojedynczego SNP, aby oddzielnie oszacować efekt każdego SNP.
8. Użyj poniższej komendy w programie R do analizy pojedynczego SNP:
   res_single <- mr_singlesnp(dat)
9. Przeprowadź analizę z pominięciem jednego wariantu (leave-one-out), sekwencyjnie usuwając po jednym SNP i powtarzając analizę IVW.
10. Użyj poniższej komendy w programie R do analizy leave-one-out:
    res_loo <- mr_leaveoneout(dat)

8. Wizualizacja i wyniki

1. Wygeneruj wykres punktowy, aby przedstawić szacunki MR dla różnych metod.
2. Wygeneruj wykres leśny (forest plot), aby przedstawić szacunki dla pojedynczych SNP oraz ogólny szacunek MR.
3. Wygeneruj wykres lejkowy (funnel plot), aby wizualnie ocenić symetrię szacunków specyficznych dla poszczególnych SNP.
4. Wygeneruj wykres z pominięciem jednego elementu (leave-one-out plot), aby ocenić, czy ogólny szacunek jest determinowany przez pojedynczy SNP.
5. Użyj następujących poleceń w języku R, aby wygenerować wykresy:
   mr_scatter_plot(res, dat)
   mr_forest_plot(res_single)
   mr_funnel_plot(res_single)
   mr_leaveoneout_plot(res_loo)
6. Eksportuj wyniki MR, tabelę zmiennych instrumentalnych, tabelę powiązań z wynikiem oraz wyniki analizy wrażliwości w celu raportowania i zapewnienia powtarzalności.

Wyniki

Rycina 1 podsumowuje ogólny schemat postępowania w protokole mendlowskiej randomizacji dwóch próbek, od wyboru zbioru danych i screeningu instrumentów, po analizy wrażliwości i wizualizację wyników. Poniżej przedstawiono reprezentatywne wyniki z każdego etapu.

Genetyczne zmienne instrumentalne i kontrola jakości harmonizacji

Pierwotnie z zestawu danych GWAS dla ekspozycji wyodrębniono łącznie 52 SNP pow...

Dyskusja

Niniejsze badanie przedstawia protokół MR dla dwóch próbek służący do oceny potencjalnego związku przyczynowego między IS a VaD z wykorzystaniem publicznie dostępnych statystyk podsumowujących GWAS. W analizie reprezentatywnej metody IVW oraz ważona mediana potwierdziły pozytywny związek między genetycznie przewidywanym IS a ryzykiem VaD, podczas gdy szacunek MR-Egger był zgodny pod względem kierunku, ale nie osiągnął istotności statystycznej. W związku z tym wyniki te dostarczają sugestywnych dowodów na możliwy efekt pr...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Zbiór danych FinnGen GWAS	FinnGen	finn-b-F5_VASCDEM	Publiczny zbiór danych GWAS wykorzystany jako źródło wyników dla otępienia naczyniowego
Baza danych IEU OpenGWAS	MRC Integrative Epidemiology Unit, University of Bristol	ebi-a-GCST90018864	Publiczny zbiór danych GWAS wykorzystany jako źródło ekspozycji dla udaru niedokrwiennego
Oprogramowanie R	R Foundation for Statistical Computing	Nie dotyczy	Oprogramowanie statystyczne wykorzystane do analizy MR
RStudio	Posit Software, PBC	Nie dotyczy	Zintegrowane środowisko programistyczne wykorzystane do uruchamiania skryptów R
Pakiet TwoSampleMR	MRC Integrative Epidemiology Unit, University of Bristol	Nie dotyczy	Pakiet R wykorzystany do ekstrakcji instrumentów, harmonizacji, analizy MR oraz analiz wrażliwości
Pakiet MRPRESSO	CRAN	Wersja 1.0	Pakiet R wykorzystany do oceny globalnej plejotropii horyzontalnej i potencjalnych instrumentów odstających
Pakiet writexl	CRAN	Nie dotyczy	Pakiet R wykorzystany do eksportu tabel wyników do plików xlsx