Artykuł metodologiczny

Metoda chirurgiczna polegająca na ustanowieniu mysiego modelu osteoartrozymy kolana za pomocą zmodyfikowanego zabiegu Hultha

143 wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/70379

⸱

15 maja 2026

 ,  ,  ,  ,  , 
1Longhua Hospital, Shanghai University of Traditional Chinese Medicine, 2Spine Institute, Shanghai University of Traditional Chinese Medicine, 3Key Laboratory of theory and therapy of muscles and bones, Ministry of Education (Shanghai University of Traditional Chinese Medicine), 4School of Traditional Chinese Medicine, Shanghai University of Traditional Chinese Medicine

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Protokół ten określa udoskonalone kroki chirurgiczne zmodyfikowanego modelu Hultha, zapewniając standaryzowaną, powtarzalną metodę indukowania eksperymentalnej choroby zwyrodnieniowej stawów.

Streszczenie

Choroba zwyrodnieniowa stawów kolan (KOA) to przewlekła zwyrodnieniowa choroba stawów charakteryzująca się degeneracją chrząstki stawowej, przebudową kości podchrząsniowej, tworzeniem osteofitów oraz zapaleniem mazi, które jest najczęstszym typem choroby zwyrodnieniowej stawów.

Protokół ten przedstawia metodę chirurgiczną ustalenia mysiego modelu choroby zwyrodnieniowej stawów kolana przy użyciu zmodyfikowanego zabiegu Hulth. W porównaniu z modelami chirurgicznymi indukowanymi zastrzykami lub konwencjonalnymi, takimi jak destabilizacja łąkotki przyśrodkowej (DMM) i przecięcie więzadła krzyżowego przedniego (ACLT), zmodyfikowany model Hultha wywołuje wcześniejszy początek choroby i silniejszy stan zapalny stawów. Przecinając więzadło poboczne przyśrodkowe, łąkotkę przyśrodkową oraz więzadło krzyżowe przednie, ta metoda zakłóca mechaniczne ustawienie stawu kolanowego i tym samym sprzyja postępowi OA. Model ten jest szczególnie odpowiedni do badania ostrej patologii OA oraz oceny potencjalnych interwencji terapeutycznych. Aby ocenić nasilenie artretyzmu, zastosowaliśmy USG u małych zwierząt połączonych z trójwymiarową (3D) rekonstrukcją jamy stawowej, aby ilościowo określić jej objętość i ocenić nagromadzenie płynu maziowego. Ponadto wykonano barwienie histologicznych przekrojów safraniną/szybkim zielonym kolorem dla oceny Osteoarthritis Research Society International (OARSI) w celu oceny niszczenia chrząstki.

Wprowadzenie

Choroba zwyrodnieniowa stawów kolana (OA) to powszechna, przewlekła, zwyrodnieniowa choroba stawów, która klinicznie charakteryzuje się bólem, sztywnością, ograniczonym zakresem ruchu oraz osłabieniem mięśni wokół kolana. Występuje ona częściej u kobiet niż u mężczyzn. Jeśli nie jest odpowiednio kontrolowana, OA może prowadzić do postępującej utraty zdolności fizycznej, zaburzeń snu, przewlekłego zmęczenia, a w końcu do niepełnosprawności. Wraz ze starzeniem się populacji na świecie liczba zachorowań na kolano stale rośnie, stanowiąc poważne wyzwanie dla systemów opieki zdrowotnej i gospodarek na całym świecie 1,2.

Patofizjologicznie utrata chrząstki stanowi centralną cechę OA, towarzyszącej jej strukturalnym i funkcjonalnym uszkodzeniom całego stawu oraz tkanek okołostawowych. Aby wyjaśnić mechanizmy choroby i ocenić interwencje terapeutyczne, opracowano różnorodne modele zwierzęce, które odwzorowują kluczowe aspekty ludzkiej OA. Spośród nich najczęściej stosuje się modele indukowane chirurgicznie. Na przykład destabilizacja łąkotki przyśrodkowej (DMM)3 oraz przecięcie więzadła krzyżowego przedniego (ACLT)4 zakłócają prawidłową strukturę stawu, co prowadzi do zwyrodnienia chrząstki i zmian podobnych do OA. Alternatywnie, modele chemiczne opierają się na intrastawowym wstrzykiwaniu środków degradujących macierz zewnątrzkomórkową (np. kolagenaza lub jodoacetan monosodu), co prowadzi do szybkiej śmierci chondrocytów i erozji chrząstki 5,6. Podczas gdy modele zastrzykowe zazwyczaj osiągają patologię punktu końcowego w ciągu kilku tygodni, modele chirurgiczne zazwyczaj wymagają dłuższego cyklu pracy.

Spośród dostępnych technik chirurgicznych wybraliśmy i dodatkowo udoskonaliliśmy model Hultha ze względu na przyspieszone wystąpienie OA7. Łącząc przecięcie więzadeł krzyżowych przednich i tylnych z resekcją więzadła pobocznego przyśrodkowego oraz całkowitą łąkotką przyśrodkową, model ten niezawodnie indukuje poważne, szybko postępujące uszkodzenia chrząstki oraz zmiany kości podchrząstkowe. Krótki czas do uszkodzenia stawu strukturalnego sprawia, że zmodyfikowany model Hultha jest szczególnie odpowiedni do badań ostrych lub podostrych OA, a nasz zoptymalizowany protokół stanowi praktyczną, powtarzalną platformę dla przyszłych badań przedklinicznych.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszystkie procedury eksperymentalne zostały zatwierdzone przez Komitet Etyki Zwierząt Uniwersytetu Tradycyjnej Medycyny Chińskiej w Szanghaju. Samce myszy C57BL/6 w wieku 6-8 tygodni i ważące około 20 g zostały zakupione od sprzedawców komercyjnych (patrz Tabela materiałów) (Numer zatwierdzenia etyki: PZSHUTCM2312210005).

1. Opieka przedoperacyjna

  1. Pozwól myszom przyzwyczaić się co najmniej tydzień przed operacją.
  2. Przed zabiegiem sterylizuj wszystkie narzędzia chirurgiczne i zdezynfekuj miejsce pracy chirurgicznej.
  3. Włącz gazową anestezjologię i umieść mysz w komorze indukcyjnej na 5 minut, używając 2-3% izofluranu, aby rozpocząć znieczulenie ogólne.
    UWAGA: Upewnij się, że przepływ tlenu utrzymuje się w zakresie od 0,5 NL/min do 1 NL/min.
  4. Po znieczuleniu przenieś mysz na platformę chirurgiczną i utrzymuj znieczulenie przy użyciu 1-1,5% izofluranu za pomocą maski znieczulliwej aż do zakończenia operacji (1-1,5% izofluran).
  5. Ustaw mysz w pozycji leżącej na plecach, z kolanami skierowanymi do góry, zapewniając stabilność i prawidłowy dostęp do miejsca operacji.
  6. Potwierdź głębokość znieczulenia, sprawdzając brak odruchów, a następnie nałóż krem depilacyjny, aby całkowicie usunąć owłosienie wokół stawu kolana.
  7. Ostrożnie usuń resztki kremu za pomocą gazy lub patyczków kosmetycznych, następnie najpierw zdezynfekuj odsłoniętą skórę 75% etanolem, a następnie nalewką jodową, aby zapewnić warunki aseptyczne.

2. Zabieg chirurgiczny (Rysunek 1)

  1. Wyprostuj tylną kończynę myszy i zastosuj napięcie, aby usztywnić skórę. Wykonaj 0,5-1 cm podłużne nacięcie wzdłuż przyśrodkowej strony prawego stawu kolanowego za pomocą sterylnego ostrza chirurgicznego.
    UWAGA: Wszystkie opisane poniżej zabiegi chirurgiczne przeprowadzono pod mikroskopem chirurgicznym.
  2. Wycofaj skórę i wykonaj tępe przecięcie powięzi pod spodem, aby całkowicie odsłonić torebkę stawową i zwizualizuj więzadło rzepki.
  3. Przeszukaj i nacinaj powięzi nad przyśrodkowym więzadłem bocznym (MCL), używając cienkiej igły do wstrzykiwania.
  4. Przeciąć MCL za pomocą mikronożyc pod powiększeniem.
  5. Przemieszczenie więzadła rzepki za pomocą igły, aby odsłonić przestrzeń wewnątrzstawową i zidentyfikować łąkotkę przyśrodkową.
  6. Po przecięciu przetnij przyśrodkowe więzadło łąkotkowo-piszczelowe (MMTL) mikronożyczkami i delikatnie zbadaj tkankę igłą, aby potwierdzić całkowite odwarstwienie i ruchomość łąkotki.
  7. Zidentyfikuj i przeciąż więzadło krzyżowe przednie (ACL), uważając na to, aby uniknąć uszkodzenia tylnego więzadła krzyżowego (PCL) lub łąkotki bocznej. Zazwyczaj skutkuje to dodatnim znakiem przedniej szuflady po operacji, potwierdzającym niestabilność stawów.
    UWAGA: Test szuflady: Przed zamknięciem rany kość udowa była stabilizowana jedną ręką, a kostka była chwytana drugą ręką, utrzymując piszczelę i kość udową w pozycji prostopadłej. Względne przemieszczenie przednio-tylne między piszczelą a kością udową zostało zastosowane ręcznie; Obserwowalny ruch translacyjny wskazywał na pozytywny znak szuflady, potwierdzający uszkodzenie więzadeł krzyżowych.
  8. Aby wywołać cięższą chorobę zwyrodnieniową stawów, alternatywnie wykonaj jednoczesne przecięcie zarówno więzadła krzyżowego przedniego (ACL), jak i tylnego więzadła krzyżowego (PCL) w połączeniu z łąkotką przyśrodkową (MMT) (jak w klasycznym modelu Hultha).
    UWAGA: Ten krok jest opcjonalny i może być wykonany w razie potrzeby; jeśli zostanie wybrany, stanowi to podejście modelujące klasycznego modelu Hultha.

3. Opieka pooperacyjna

  1. Zamknąć nacięcie szwami nylonowymi 4-0 i zdezynfekować miejsce operacji nalewką jodową.
  2. Połóż mysz na termoforze grzewczej, aż odzyska przytomność i zacznie wykazywać prawidłowy oddech oraz aktywność ruchową. Gdy całkowicie wyzdrowieje i nie wykazuje oznak stresu, należy odłożyć go do klatki domowej.
  3. Monitoruj integralność szwów przez 3-5 dni po operacji. Jeśli zauważymy pęknięcie szwów, ponownie znieczulaj mysz i wykonaj ponowne zszycie
  4. Podawaj antybiotyki domięśniowe do 3 dni po operacji, aby zapobiec infekcji pooperacyjnej.
    UWAGA: Antybiotyk stosuje się w profilaktyce przeciwko zakażeniu pooperacyjnym. Analgezja pooperacyjna jest określana przez cele eksperymentalne; W badaniach nad chorobą zwyrodnieniową stawów leki przeciwbólowe są zazwyczaj wstrzymywane w fazie ostrej, aby uniknąć zakłóceń oceny skuteczności terapeutycznej.
  5. Codziennie monitoruj miejsce operacji pod kątem oznak obrzęku, wydzieliny lub miejscowego stanu zapalnego.
  6. Uśpienie myszy w miejscu badania, zgodnie z zatwierdzonymi protokołami, oraz rozcięcie stawu kolanowego do analizy histologicznej lub obrazowej.
    UWAGA: Na tym etapie przyjęliśmy protokół eutanazji zwierząt doświadczalnych za pomocą znieczulenia przedawkowania. Osiągnięto to poprzez podanie roztworu sodu pentobarbitalu w dawce >100 mg/kg u myszy.

4. Ocena rozwoju OA

  1. Przed eutanazją ocenić obrzęk stawów i wykonać USG w celu oceny zmian strukturalnych w stawie kolanowym. Oceń sprawność ruchową myszy, wykonując test rotarod.
    UWAGA: Do badania USG u myszy wymagana jest znieczulenie izofluranowe.
  2. Po eutanazji rozcinaj staw kolanowy i ostrożnie usuń otaczające mięśnie oraz powięzi, zachowując jednocześnie piszczel, strzałkę i kość udową.
    Napraw połączenia i odwapnij je w roztworze 10% kwasu etylendiaminetetraoctowego (EDTA) przez co najmniej 30 dni, wymieniając roztwór dwa razy w tygodniu, aby zapewnić całkowitą odwapnięcie.
  3. Osadzić zdewapnifikowane stawy kolanowe w parafinie i przygotować przecięcia strzałkowe o grubości 4 μm8.
  4. Rozpocznij pobieranie przekrojów, gdy łąkotka będzie wyraźnie widoczna. Przekroje pokoloruj safraniną O i szybkim zielonym, aby zobrazować morfologię chrząstki i kości podchężnobiałowej. Oceń degradację chrząstki za pomocą systemu punktacjiOARSI 9 .
  5. Procedura barwienia Safranin O-Fast Green (Zestaw komercyjny używany, patrz Tabela materiałów)
    1. Deparafinizacja i nawodnienie
      1. Odparaffiniuj sekcje w ksylenie przez 3 minuty, powtarzaj 3 razy.
      2. Rehydruj przez serię ethanolu o stopniu (100%, 90%, 80%), aby usunąć pozostałości ksylenu, po 2 minuty każdy.
        UWAGA: Serie etanolowe muszą być stosowane w kolejności malejącej koncentracji.
      3. Przepłukuj w wodzie destylowanej przez 1 minutę i krótko odlej.
    2. Barwienie hematoksyliną Weigerta
      1. Nałóż roztwór roboczy Weigerta na przekroje, bejcuj przez 5 minut.
      2. Przepłukuj w wodzie destylowanej przez 1 minutę i krótko odlej.
    3. Różniczkowanie kwasów
      1. Nakładaj roztwór różnicujący kwasem na przekroje przez 15 sekund.
      2. Pierz w wodzie przez 10 minut i odlej nadmiar wody.
        UWAGA: Czas różnicowania jest kluczowy – długotrwałe różnicowanie zapobiega szybkiemu zielonemu barwieniu, podczas gdy niewystarczające zróżnicowanie prowadzi do głębokiego, szybkiego zielonego barwienia z słabym pobieraniem safranyny
    4. Szybkie zielone barwienie
      1. Na fragmenty nakładam szybki zielony roztwór przez 5 minut, odlewaj krótko.
      2. Nałóż słaby roztwór kwasowy, aby usunąć pozostałą szybko zieloną plamę przez 15 sekund, a następnie krótko odcedź.
    5. Barwienie Safranin O
      1. Stosuj roztwór safraniny O na przekroje przez 4,5 minuty.
      2. Szybko przelej sekcje do 90% etanolu, aby usunąć nadmiar safryny O, 2-3 s.
        UWAGA: Ten etap może być odpowiednio przedłużony w zależności od intensywności barwienia safraniną.
    6. Odwodnienie i oczyszczanie
      1. Susz fragmenty w 100% etanolu przez 1 minutę.
      2. Przezroczyste fragmenty w ksylenie dla całkowitego odwodnienia, 2 minuty, powtarzaj 3 razy.
        UWAGA: Ksylen użyty w tym kroku nie może być mieszany z tym użytym w sekcji 4.5.1; Zanieczyszczenie krzyżowe może zaszkodzić jakości przekroju.
    7. Montaż z neutralnym balsamem
      1. Umieść fragmenty w okapie oparowym, aby nadmiar ksylenu mógł odparować.
      2. Usuń fragmenty, nałóż odpowiednią ilość neutralnego balsamu na okaz i ostrożnie przykryj folią przykrywczą.
      3. Zbadaj sekcje pod mikroskopem świetlnym pod kątem pęcherzyków powietrza i ostrożnie usuń wszelkie obecne.
      4. Przechowuj kawałki w pudełku na ślizgi i umieść w piekarniku 60 °C na 24 godziny, aby zapewnić całkowite utwardzenie neutralnego balsamu.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Podłużne skany stawu kolanowego wykonano za pomocą systemu mikro-ultradźwiękowego8 o kroku skanowania 4 mm i rozdzielczości osiowej 0,04 mm. W 7. dniu pooperacyjnym rekonstrukcja 3D wykazała wyraźny wzrost objętości jamek stawowych w grupie modelowej w porównaniu z grupą pozorowaną (Rysunek 2A,B). Testy zmęczenia Rotarodu10,11 potwierdziły to wynik, wykazując istotne spadek wytrzymałości biego...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

W porównaniu z innymi metodami modelowania chirurgii, takimi jak destabilizacja łąkotki przyśrodkowej (DMM) i przecięcia więzadła krzyżowego przedniego (ACLT), zmodyfikowany model Hultha indukuje chorobę zwyrodnieniową stawów poprzez połączone uszkodzenie więzadel i łąkotki. Specyficzne zakłócenia strukturalne determinują zmiany w biomechanice stawów na różnych płaszczyznach. ACLT4 obniża stabilność obrotową (wewnętrzną i zewnętrzną) oraz obniża stabilność przedniotylną, co skutkuje pozytywnymi sy...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy deklarują brak konkurencyjnych interesów.

Podziękowania

Badanie to zostało sfinansowane przez Plan Działań na rzecz Innowacji w Dziedzinie Nauki i Technologii w Szanghaju (23YF1447900 do CJM), Program Chenguang Fundacji Rozwoju Edukacji Szanghaju oraz Miejską Komisję Edukacji Szanghaju (23CGA53 do CJM) oraz Narodową Fundację Nauk Przyrodniczych Chin (U24A6013 do XH).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
1 mL strzykawki do zastrzyków//Specyfikacja: 30 G & razy; 0,13 mm
System obrazowania 3D Ultrasound Vevo 3100OptykaVevo 2100System obrazowania ultradźwiękowego o wysokiej częstotliwości zintegrowany z oprogramowaniem Vevo LAB do analizy danych.
Szew nylonowy 4-0//
75% etanoluShanghai Titan Scientific Co., Ltd.G73537O
C57BL/6J samce myszy (6-8 tygodni)Shanghai Jiesijie Laboratory Animal Co., Ltd./
Krem do depilacjiVeetLot: C021123001
Nalewka jodu//
IzofluranRWD R650-IE
MikrokleszczeRWD F12013-10
MikronożyczkiRWD S11035-08
Zmodyfikowany zestaw Safranin O i szybki zielony plamSolarbioG1371
Uchwyt na igłyRWD F21001-12
Ostrza chirurgiczne (10#)RWD S31010-01
Mikroskop chirurgicznyOlympusSZ61

Bibliografia

  1. Sharma, L. Osteoarthritis of the Knee. N Engl J Med. 384 (1), 51-59 (2021).
  2. Chen, D., et al. Osteoarthritis: toward a comprehensive understanding of pathological mechanism. Bone Res. 5, 16044(2017).
  3. Glasson, S. S., Blanchet, T. J., Morris, E. A. The surgical destabilization of the medial meniscus (DMM) model of osteoarthritis in the 129/SvEv mouse. Osteoarthritis Cartilage. 15 (9), 1061-1069 (2007).
  4. Zhou, X., et al. Antioxidant taurine inhibits chondrocyte ferroptosis through upregulation of OGT/Gpx4 signaling in osteoarthritis induced by anterior cruciate ligament transection. J Adv Res. 77, 551-567 (2025).
  5. Jal Janusz, M., et al. Moderation of iodoacetate-induced experimental osteoarthritis in rats by matrix metalloproteinase inhibitors. Osteoarthritis Cartilage. 9 (8), 751-760 (2001).
  6. Meng, X., et al. An impaired healing model of osteochondral defect in papain-induced arthritis. J Orthop Translat. 26, 101-110 (2021).
  7. Rogart, J. N., Barrach, H. J., Chichester, C. O. Articular collagen degradation in the Hulth-Telhag model of osteoarthritis. Osteoarthritis Cartilage. 7 (6), 539-547 (1999).
  8. Xu, H., et al. Utilization of longitudinal ultrasound to quantify joint soft-tissue changes in a mouse model of posttraumatic osteoarthritis. Bone Res. 5, 17012(2017).
  9. Glasson, S. S., Chambers, M. G., Van Den Berg, W. B., Little, C. B. The OARSI histopathology initiative - recommendations for histological assessments of osteoarthritis in the mouse. Osteoarthritis Cartilage. 18 (Suppl 3), S17-S23 (2010).
  10. Lubrich, C., Giesler, P., Kipp, M. Motor behavioral deficits in the Cuprizone model: Validity of the rotarod test paradigm. Int J Mol Sci. 23 (19), 11342(2022).
  11. Piel, M. J., Kroin, J. S., van Wijnen, A. J., Kc, R., Im, H. J. Pain assessment in animal models of osteoarthritis. Gene. 537 (2), 184-188 (2014).
  12. Obeidat, A. M., et al. A standardized approach to evaluation and reporting of synovial histopathology in two surgically induced murine models of osteoarthritis. Osteoarthritis Cartilage. 32 (10), 1273-1282 (2024).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Degeneracja staw wdestrukcja chrz stkiprzeci cie kotki przy rodkowejwi zad o krzy owe przednieultrasonografia ma ych zwierz tp yn stawowybarwienie safranin O
Film wkrótce dostępny

Powiązane artykuły