Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Generowanie kultur organizmów guzowych z linii komórek raka gruczołowego płuca

295 wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/70387

⸱

12 czerwca 2026

 ,  ,  , 
1State Key Laboratory of Genetics and Development of Complex Phenotypes, School of Life Sciences, Fudan University, 2Shanghai Key Laboratory of Lung Inflammation and Injury, Department of Pulmonary Medicine, Zhongshan Hospital, 3National Demonstration Center for Experimental Biology Education, School of Life Sciences, Fudan University

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Przedstawiamy tutaj szybka, czysta i opłacalna metodę wytwarzania organoidów guzowych z linii komórkowej A549, nadająca się do wstępnych testów i celów edukacyjnych.

Streszczenie

Tu opisano jest protokół generowania organoidów guzowych pochodzących od linii komórkowych (CDTO) z ludzkiej linii komórek raka płuca A549. Protokół polega na osadzaniu rozszerzonych w dwóch wymiarach komórek A549 w Matrigelu i utrzymywaniu ich w 3D środowisku hodowli w celu długotrwałej kultury. Zalecana gęstość siewu 500 komórek/µL została określona jako wspierająca konsekwentne tworzenie organoidów. Powstałe CDTO charakteryzowały się barwieniem hematoksyliną i eozyną (H&E) oraz immunofluorescencją (IF). Organoidy utrzymywały wysokie ekspresje markerów raka płuca: Thyroid Transcription Factor 1 (TTF-1), białko adhezji E-Cadherin (ECAD) oraz białko cytoszkieletu Keratin 7 (KRT7). Ponadto ekspresja białka szczelnych złączy Zona Occludens 1 (ZO-1) wykazywała dysregulację polaryzacji organoidów guzowych. Ten protokół oferuje technicznie prostą, opłacalną i czysto guzową platformę organoidów dla badań nad rakiem płuca. Jego prostota i możliwość powtórzenia sprawiają, że jest również odpowiedni dla nauczania w laboratorium na poziomie licencjackim, gdzie może pomóc studentom zdobyć podstawowe techniki 3D kultury organoidów guzowych w ograniczonym harmonogramie laboratorium.

Wprowadzenie

Organoidy są in vitro. samoorganizującymi się trójwymiarowymi (3D) strukturami, które powstają z komórek macierzystych i są zdolne w znacznym stopniu odtworzyć złożoności biologiczne rzeczywistych narządów1. Komórki tworzące organoidy mogą pochodzić z komórek pluripotencjalnych indukowanych lub komórek pochodzących z tkanki, w tym normalnych komórek macierzystych/przodków, zróżnicowanych komórek i komórek nowotworowych2. W porównaniu z tradycyjnymi dwuwymiarowymi systemami kulturowymi i modelami zwierzęcymi, organoidy mogą bliżej naśladować fizjologiczne cechy ludzkiego ciała, oferując jednocześnie większą elastyczność eksperymentalną. W związku z tym, technologia organoidów została szeroko zastosowana w rozwoju leków3, medycynie spersonalizowanej4 oraz modelowaniu chorób5.

Liczne badania ustanowiły modele organoidalne dla szerokiego spektrum nowotworów, w tym raka jelita grubego6, prostaty7, trzustki8, żołądka9, wątroby10, dróg żółciowych11, piersi12 oraz guzów neuroendokrynnych. Jednak jednym z głównych wyzwań w badaniach nad organoidami nowotworowymi jest utrzymanie czystości. Na przykład badanie nad rakiem płuc niedrobnokomórkowym wykazało, że tylko 17% utworzonych organoidów było czysto nowotworowe, ponieważ próbki nowotworowe często zawierają mieszankę komórek normalnych i złośliwych, które są trudne do całkowitego rozdzielenia przed hodowlą13. Ten problem nieczystości może powodować eliminację komórek nowotworowych przez przerośnięcie komórek nienowotworowych, zakłócać wyniki testów podatności na leki oraz prowadzić do niedokładnych analiz molekularnych, takich jak RT-qPCR lub Western blot, gdzie RNA i białka z komórek nowotworowych są rozcieńczane przez niekontrolowany udział komórek zanieczyszczających.

Aby rozwiązać ten problem, naukowcy zbadali projekt selektywnych mediów kulturowych, które wykorzystują zmniejszoną zależność komórek nowotworowych od pewnych czynników wzrostu, hamując w ten sposób wzrost normalnych komórek i promując rozwój komórek nowotworowych14. Ponadto opracowywane są strategie takie jak sortowanie komórek czy identyfikacja klonalna, aby zbudować czyste organoidy nowotworowe.

Ten protokół opisuje wytwarzanie Organoidów Guzowych Pochodzenia Linii Komórkowych (CDTO) z wykorzystaniem ludzkiej linii komórek raka płuca A549, która miałaby częściowo wykazywać właściwości komórek macierzystych nowotworowych, a także zwiększoną klonogenność, potencjał proliferacyjny i zdolność nowotworową in vitro.15. Powstałe CDTO utrzymały ekspresję biomarkerów specyficznych dla linii komórkowych Czynnika Transkrypcyjnego Tarczycy (TTF-1)16, białka adhezji E-Kadheryna (ECAD)17 oraz białka cytoszkieletu Keratyna 7 (KRT7)16 i wykazywały fizjologiczne cechy charakterystyczne dla organoidów guzowych. Ten model jest łatwy do ustanowienia i zawiera określone składniki komórek nowotworowych, co sprawia, że jest odpowiedni dla badaczy początkujących w dziedzinie organoidów nowotworowych lub tych, którzy napotykają problemy z utratą tożsamości nowotworowej w pierwotnych hodowlach organoidów guzowych. Potencjalne zastosowania obejmują wstępne testy podatności na leki18, badania mikrośrodowiska nowotworu19 oraz szkolenie edukacyjne w technikach hodowli 3D.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Temperatura w pomieszczeniu laboratoryjnym wynosi 22–24 °C i jest określana jako RT. Zaleca się użycie wirówki z wiaderkiem oscylacyjnym. Substancje chemiczne i sprzęt użyty są wymienione w Tabeli materiałów.

1. Ustanowienie pierwotnych organoidów A549

  1. Przygotowanie i zbiór komórek A549
    1. Przygotuj 6 cm naczynie zawierające komórki A549 o 70% konfluencji. Podgrzej TrypLE i PBS do 37 °C. Oblicz ilość komórek i objętość Matrigel zgodnie z projektem eksperymentu i Tabela 1.
      1. Roztwiedz żądane alikwoty Matrigel z nadmiarem na lodzie przez co najmniej 60 min. Przygotuj naczynia polistyrenowe i płytki traktowane TC, aby kopuły pozostały półkulistymi.
      2. Świeżo przygotuj 2D medium (modyfikowane medium Dulbecco's Eagle's zawierające 10% surowicy wołowej płodowej) i 3D medium (Human Lung Adenocarcinoma Organoid Medium). 3D medium można wytworzyć z komercyjnych zestawów lub zgodnie z pracami Sachs, N. et al. z laboratorium Hansa Clever'a20.
        UWAGA: Jedno 6 cm naczynie może zazwyczaj dostarczyć około 5 000 000 komórek po trawieniu. Zmniejsz liczbę komórek wejściowych zgodnie z projektem eksperymentu. Płytki zaprojektowane do obrazowania konfokalnego z użyciem dna szklanego nie nadają się do tworzenia odpowiedniej 3D kształtu przez Matrigel.
    2. Aspiruj wykorzystane 2D medium i przemyj komórki raz z 1 mL PBS, aby usunąć resztki surowicy. Aspiruj PBS, dodaj 1 mL podgrzanego TrypLE i inkubuj płytkę w 37 °C przez 4 min.
    3. Obserwuj komórki pod mikroskopem. Gdy cytoplazma się cofa, a komórki tracą połączenia międzykomórkowe, dodaj równą objętość (1 mL) świeżego 2D medium, aby zakończyć reakcję enzymatyczną.
    4. Delikatnie pipetuj, aby oddzielić i resuspendować przywierające komórki z powierzchni kultury. Przenieś zawiesinę komórek do 1,5 mL probówek do wirówki i wiruj w 300 × g. przez 3 min w RT, aby osadzić komórki.
    5. Odsuń nadstaw i resuspenduj pellet komórek w 1 mL 2D medium. Rozcieńcz 10 μL zawiesiny komórek do 100 μL i policz liczbę komórek hemocytometrycznie. Oblicz wymaganą objętość zgodnie z krokiem 1.1.1 i aspiruj do 1,5 mL probówki do wirówki z wstępnie spłukanymi końcówkami.
    6. Wysiew zebranych komórek do Matrigel
      1. Przygotuj lód i wstępnie schłodź końcówki pipet w zamrażarce -20 °C przez 1 min. Użyj końcówek o niskiej retencji, jeśli to możliwe. Upewnij się, że w alikwotach Matrigel nie pozostały kryształki i że nie tworzą się bańki, gdy końcówka wchodzi w roztwór.
      2. Wiruj probówkę zawierającą zebrane komórki w 300 × g. w RT i odsuń nadstaw. Umieść probówkę na lodzie. Użyj schłodzonych końcówek pipet, aby powoli zasączyć wymaganą objętość Matrigel i dodać ją do pelletu na lodzie. Resuspenduj używając tylko pierwszego stopu pipety powoli na lodzie. Proszę, nie zostawiaj lodu przez więcej niż 10 s, jeśli wymagana jest obserwacja.
      3. Użyj schłodzonych końcówek pipet i utrzymuj mieszaninę na lodzie. Wlej jedną alikwotę mieszanki do środka każdego dołka. Powoli wycofaj pipetę podczas wylewania, używając tylko pierwszego stopu, aby uniknąć tworzenia bańek.
        UWAGA: Mieszanka powinna utworzyć kopułowatą strukturę 3D w środku. Resuspenduj mieszankę przed przejściem do następnego dołka. Jeśli to możliwe, unikaj używania dołków na krawędzi i dodaj PBS do tych dołków.
      4. Inkubuj płytkę w 37 °C w inkubatorze 5% CO₂ przez 40 min, aby pozwolić na polimeryzację żelu. Po zestaleniu się Matrigel, ostrożnie dodaj 3D medium wzdłuż ścianki dołka i kontynuuj hodowlę w 37 °C.
        UWAGA: Unikaj tworzenia bańek podczas wylewania. Jeśli powstaną bańki, unikaj używania tej części mieszanki.
      5. Podczas hodowli, wymieniaj 3D medium co 3 dni lub za każdym razem, gdy zauważysz zmianę koloru (z różowego na żółty). Podczas każdej zmiany medium, badaj wzrost organoidów pod mikroskopem odwróconym i udokumentuj morfologię fotograficznie, aby monitorować rozwój strukturalny.
        UWAGA: Organoidy powinny być gęste i skomplikowane o średnicach dłuższych niż 30 μm zamiast rozpadać się lub być fragmentowanymi, jak wskazano przez 5000 komórek/µL (Rysunek 1D).

    2. Fiksacja, osadzanie i cięcie organoidów

    1. Przygotuj kultury organoidów w dniu 6–9. Usuń medium kulturowe z płytki hodowlany komórek. Delikatnie oddziel organoidy pipetując 1 mL zimnego PBS i przenieś je do 1,5 mL probówki wstępnie spłukanej 5% BSA, aby zapobiec przywieraniu. Pozwól organoidom osiąść naturalnie na lodzie i ostrożnie odsuń nadstaw.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Ogólny proces tego protokołu obejmuje ekspansję komórek A549 2D do fazy wykładniczej (Dodatkowa Figura 1A) i przeniesienie do 3D Matrigel w celu utworzenia organoidalnych struktur (Rysunek 1A). Po otoczeniu w Matrigel, komórki proliferowały i samoistnie ułożyły się, przede wszystkim tworząc organoidy monoklonalne (Rysunek 1B). Jego gęsta i zawiła morfologia była jednolita w całym przebiegu (Dodatkowa Figura 1C). Natomiast w poró...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Ten protokół opisuje metodę generowania organoidów guzowych pochodzących od linii komórkowej raka płuca A549, zoptymalizowanych pod kątem prostoty technicznej, powtarzalności i zastosowania edukacyjnego. Trzy parametry krytycznie decydują o sukcesie: początkowy stan komórek, skład pożywki i skład macierzy. Ponadto, czas kultury nie powinien przekraczać 14 dni. Poniżej wymieniono kluczowe parametry i rozwiązania problemów.

Początkowy stan komórek
Komórki były utrzymywane ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają żadnych konfliktów interesów do ujawnienia.

Podziękowania

Praca ta była wspierana przez Program Dobrej Praktyki Dydaktycznej Uniwersytetu Fudan, Narodowy Instytut Badań nad Materiałami Dydaktycznymi oraz Narodowy Program Szkolenia Talentów w Dyscyplinach Podstawowych (nr. J1210012), a także Program Kształcenia Elity Studentów w Dyscyplinach Podstawowych Ministerstwa Edukacji (nr. 20211021). Rysunek 1A został stworzony w BioRender (Joe, Z. (2026) https://BioRender.com/0qi2gmd).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
1.5 mL Micro Centrifuge tubeBiofilCFT003015
A549 [A-549]human non-small cell lung cancer cellsZQXZbioZQ0003STR: Amelogenin: X,Y; CSF1PO: 10,12; D13S317: 11; D16S539: 11,12; D5S818: 11; D7S820: 8,11; TH01: 8,9.3; TPOX: 8,11; vWA: 14. Mycoplasma was negetive when purchased was tested every 2 weeks. Passage number within 10 passages from the P1 aliquots of the purchased batch was used.
Advanced DMEM/F12Gibco12634010
Anti-E Cadherin antibodyAbcam ab231303
Anti-Fade Mounting MediumYEASEN 36307ES08
Anti-HIF-1 alpha antibodyAbcam ab51608
Biological Safety CabinetNuaire LABGARDNU-540
Biological Tissue Embedding MachineKEDEEKD-BM
BSASigma A1933
Cell-Grade BSASigma A1933-100G
CentrifugeEppendorfCentrifuge 5702 RSwing bucket; Mild to low speed.
Centrifuge tubeBiofilCFT920150
Citrate Antigen Retrieval Solution (pH 6.0)ZSGB-BIO ZLI-9065
CryostageKEDEEKD-BL
Cytation 5 Cell Imaging Multimode
 Reader		BiotekCytation 5
Cytokeratin 7 (KRT7) Rabbit mAbAbclonal A4357
DMEMGibco11965092
DMSOSolarbio D8371
Donkey SerumSolarbioSL050
Dulbecco's Modified Eagle MediumGibco11965118
Eclipse Ts2 Inverted MicroscopeNikon Eclipse Ts2
Eosin Staining Solution (Alcohol-Soluble)Servicebio G1001
FBSNobimpexB118-500
Forma Steri-Cycle i160 CO2 IncubatorThermo Scientifici60
Hematoxylin Bluing SolutionServicebio G1040
Hematoxylin Differentiation SolutionServicebio G1040
Hematoxylin Staining SolutionServicebio G1004
HemocytometerSolarbioYA0810
Human Lung Adenocarcinoma Organoid Medium (3D medium)PMO Bio HC1001
Immunohistochemistry (IHC) PenZSGB-BIO ZLI-9305Store in 4°C
Laser Confocal Microscope  FV3000OlympusFV3000Usual parameter range: PMT Voltage: 500 ± 200 V; Laser Transmissivity: 5 ± 3%; Offset: 3 %
Manual Rotary MicrotomeLeicaRM2235
Metal BathALLSHENGMK-3000
Microwave OvenGalanz
Nail PolishLete
Neutral Balsam (Mounting Medium for Microscopy)BeyotimeC0173
Organoid-Specific Extracellular Matrix GelPMO Bio BM1001
PBSWISENT 311-010-CL
Peroxidase Blocking SolutionBeyotime P0100A
PipettesEppendorf312300063/312300020/312400083
Pipettes tipsAxygen14-222-692/14-222-723/14-222-869Consider using low retention tips if possible.
Three-Dimensional ShakerSCILOGEXSK-D3309-ProLow speed.
Tissue Flotation Water BathKEDEEKD-P
Triton X-100VWR92046-34-9
Trypan BlueGibco 15250061
TryPLEGibco12605028
TTF1 Recombinant Monoclonal AntibodyHUABIO HA720067

Bibliografia

  1. Huch, M., Koo, B. K. Modeling mouse and human development using organoid cultures. Development. , (2015).
  2. Hofer, M., Lutolf, M. P. Engineering organoids. Nat Rev Mater. , (2021).
  3. Kim, M., et al. Patient-derived lung cancer organoids as in vitro cancer models for therapeutic screening. Nat Commun. , (2019).
  4. Al Shihabi, A., et al. Personalized chordoma organoids for drug discovery studies. Sci Adv. , (2022).
  5. Clevers, H. Modeling development and disease with organoids. Cell. , (2016).
  6. Van de Wetering, M., et al. Prospective derivation of a living organoid biobank of colorectal cancer patients. Cell. , (2015).
  7. Gao, D., et al. Organoid cultures derived from patients with advanced prostate cancer. Cell. , (2014).
  8. Boj, S. F., et al. Organoid models of human and mouse ductal pancreatic cancer. Cell. , (2015).
  9. Yan, H. H. N., et al. A comprehensive human gastric cancer organoid biobank captures tumor subtype heterogeneity and enables therapeutic screening. Cell Stem Cell. , (2018).
  10. Guan, Y., et al. A human multi-lineage hepatic organoid model for liver fibrosis. Nat Commun. , (2021).
  11. Roos, F. J. M., et al. Human branching cholangiocyte organoids recapitulate functional bile duct formation. Cell Stem Cell. , (2022).
  12. Guillen, K. P., et al. A human breast cancer-derived xenograft and organoid platform for drug discovery and precision oncology. Nat Cancer. , (2022).
  13. Dijkstra, K. K., et al. Challenges in establishing pure lung cancer organoids limit their utility for personalized medicine. Cell Rep. , (2020).
  14. Xu, Z., et al. Establishment of novel colorectal cancer organoid model based on tumor microenvironment analysis. Life Med. , (2024).
  15. Xia, H., et al. Identification and isolation of cancer stem cells from A549 cells. Zhongguo Fei Ai Za Zhi. , (2013).
  16. Nakata, J., Whittall, I., Russo, M. G., Su, S., Friedberg, J. Systematic review of lung cancer with breast metastasis. J Thorac Dis. , (2025).
  17. Kumari, P., Dash, S., Samanta, D. E-cadherin a potential biomarker in cancer and a therapeutic target. Biochim Biophys Acta Rev Cancer. , (2025).
  18. Yun, W., et al. Tumor organoids may be more suitable for clinical personalized chemotherapeutic drug screening in lung adenocarcinoma. Front Cell Dev Biol. , (2025).
  19. Monleón-Guinot, I., et al. Morphological characterization of human lung cancer organoids cultured in type I collagen hydrogels a histological approach. Int J Mol Sci. , (2023).
  20. Sachs, N., et al. Long-term expanding human airway organoids for disease modeling. EMBO J. , (2019).
  21. Liu, Y., et al. Modeling lung adenocarcinoma metastases using patient-derived organoids. Cell Rep Med. , (2024).
  22. Peng, K., et al. HIF-1α promotes kidney organoid vascularization and applications in disease modeling. Stem Cell Res Ther. , (2023).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Przeglądaj więcej artykułów

Organoidy z linii komórkowychkomórki A549trójwymiarowa hodowla komórkowaosadzanie w Matrigeluformowanie organoidówbarwienie immunofluorescencyjnebarwienie hematoksyliną i eozynąekspresja markerów nowotworowych
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.