Opracowano trwały i możliwy do powtórzenia sposób utworzenia 2D pierwotnych kultur komórek wzbogaconych o strefę kłębuszkową i strefę prążkową kory nadnerczy u myszy. System ten zachowuje kluczowe cechy molekularne i funkcjonalne każdej strefy, umożliwiając skupioną analizę szlaków sygnałowych, produkcji hormonów oraz zachowania komórek kory nadnerczy ex vivo.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł badawczy
Ustanowienie kultur pierwotnych wzbogaconych strefami z kory nadnerczy myszy
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Gruczoł nadnerczy myszy jest otoczona warstwą komórek mezenchymalnych (kapsułą) i zawiera leżącą w głębi korę zorganizowaną w wyraźne strefę skoncentryczne o specjalistycznych funkcjach endokrynny: strefę ziarnistą (zG), która wytwarza aldosteron i strefę pręcikowatą (zF), która wytwarza kortikosteron. Nawa nadnerczy, znajdująca się w centrum gruczołu, wytwarza katecholaminy. Badania mechanizmu działania komórek z każdej strefy kory nadnerczy były ograniczone przez brak in vitro modeli, które zachowują ich strefowo-specyficzne cechy molekularne, komórkowe i funkcjonalne. Aby przezwyciężyć tę ograniczenie, opracowano podejście do frakcjonowania z wykorzystaniem mikrosekcji dorosłych gruczołów nadnerczy myszy. Metoda ta oddziela komórki nadnerczy od samców myszy na zewnętrzną frakcję wzbogaconą o zG (OF), zawierającą komórki kapsułki i zG oraz wewnętrzną frakcję wzbogaconą o zF (IF), która zawiera komórki zF i nadnerczy. Te frakcje zostały wykorzystane do wygenerowania dwuwymiarowych (2D) pierwotnych kultur wzbogaconych o komórki zG lub zF. Analiza ekspresji genów potwierdziła, że kultury wzbogacone o zG wykazują wysokie poziomy markerów zG (Cyp11b2, Dab2 i Shh), wraz ze zwiększoną liczbą markerów szlaku Wnt/β-kateniny (Wnt4, Lef1). W przeciwieństwie do tego, kultury wzbogacone o zF wykazywały wyższą ekspresję markerów zF (Cyp11b1 i Akr1b7) i niższe poziomy markerów szlaku Wnt/β-kateniny, zgodnie ze strefowym podpisem transkrypcyjnym zF. Ekspresja markerów steroidogenicznych (Nr5a1, Star) potwierdziła nadnerczowe pochodzenie obu frakcji komórek. Hydroksylaza tyrozyny wskazuje na obecność komórek nadnerczy w kulturach wzbogaconych o zF. Funkcjonalnie, kultury wzbogacone o zG wytwarzały aldosteron w warunkach podstawowych i wykazywały zwiększoną produkcję w odpowiedzi na angiotensynę II, potas i hormon aktywujący komórki wytwarzające kortykotropinę (ACTH). Z kolei kultury wzbogacone o zF wytwarzały kortikosteron w warunkach podstawowych i wykazywały zwiększone wydzielanie w odpowiedzi na stymulację ACTH. Ogólnie, ten protokół reprezentuje niezawodny, powtarzalny i biologicznie istotny model in vitro do badania biologii kory nadnerczy. System ten umożliwia strefowo-specyficzne badanie szlaków sygnałowych, mechanizmów molekularnych i reakcji fizjologicznych.
Wprowadzenie
Cienka torebka mezenchymalna otula gruczoł nadnerczy myszy, który składa się z dwóch głównych przedziałów: zewnętrznej kory i wewnętrznej rdzeni. Kora nadnerczy dorosłego samca myszy jest dalej podzielona na odrębne strefy, strefę cebulkowatą (zG) i strefę pręcikowatą (zF), każda z unikalnymi cechami morfologicznymi i funkcjonalnymi1,2,3,4. Główną funkcją kory nadnerczy jest produkcja hormonów steroidowych, w tym mineralokortykoidów (aldosteron) i glikokortykoidów (kortikosteron u myszy)5. ZG jest najbardziej zewnętrz....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Wszystkie eksperymenty przeprowadzono zgodnie z protokołami zatwierdzonymi przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki nad Zwierzętami i Ich Zastosowaniami w Dziedzinie Badań w Boston Children’s Hospital (IACUC) na podstawie zgody numer 00002611. Pełna lista wszystkich materiałów użytych w tym protokole, w tym reagentów, materiałów eksploatacyjnych i sprzętu, znajduje się w Tabeli Materiałów, wraz z odpowiednimi producentami i numerami katalogowymi, aby zapewnić możliwość powtórzenia eksperymentu.
Pierwotne kultury komórek strefy glomerularnej i fasciculata nadnerczy myszy
Metody użyte do ustanowienia pi....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Ustanowienie i charakterystyka strefowo wzbogaconych kultur pierwotnych komórek nadnerczy
Pierwotne kultury komórek nadnerczy zostały pomyślnie ustalone z OF, wzbogacone o komórki zG, oraz z IF, wzbogacone o komórki zF. Przedstawiające obrazy kulturalnych komórek przedstawiono na Rysunku 2A (OF-zG) i Rysunku 2B (IF-zF). Aby ocenić wzbogacenie komórek zG i nie-zG w tych kulturach, wykorzystano model myszy AS<.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
W niniejszym badaniu przedstawiono udoskonalony protokół, który generuję kultury komórek nadnerczy myszy pierwotnych wzbogaconych o komórki zG (OF) i zF (IF), które wiernie odtwarzają tożsamość strefową i funkcję steroidogeniczną każdej strefy. Protokół ten powinien umożliwić szczegółowe zbadanie biologii komórkowej i molekularnej kory nadnerczy w kontekście strefy, wspierając badania nad białkami, szlakami sygnałowymi oraz mechanizmami zaangażowanymi w rozwój, różnicowanie, funkcję i odnowę kory nadnerczy, przy zmniejsz.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy deklarują, że nie mają żadnych konkurencyjnych interesów finansowych związanych z tym badaniem.
Podziękowania
To dzieło zostało wsparte przez FAPESP (Fundacja Badań São Paulo, Brazylia), numer projektu 2024/14165–6 (BEPE – JLK), FAPESP: 2020/02988–7 (C.F.P.L), oraz wsparcie 2R01DK123694 (dla DTB) i fundusze z Działu Endokrynologii w Szpitalu Dziecięcym w Bostonie (DTB).
....Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Rozdzielacz stożkowy (50 mL ) | Corning (Corning, NY, USA) | 352070 | Sterile |
| Filtrostrzykawka 0,22 µm | MilliporeSigma (Burlington, MA, USA) | SLGV033RS | Filtracja roztworu trawiącego |
| 10 mL jednorazowa strzykawka | BD Plastipak (Franklin Lakes, NJ, USA) | 300912 | Sterile |
| 5 mL pipeta serologiczna | Corning (Corning, NY, USA) | 4487 | Sterile |
| 10 mL pipeta serologiczna | Corning (Corning, NY, USA) | 4488 | Sterile |
| Filtrowane końcówki pipet (P200) | Axygen (Union City, CA, USA) | TF-200-R-S | Sterile |
| Filtrowane końcówki pipet (P1000) | Axygen (Union City, CA, USA) | TF-1000-R-S | Sterile |
| Płytka kulturowa P60 | Corning (Corning, NY, USA) | 430166 | Przeznaczone do hodowania tkanek |
| 48-dołkowa płytka | Corning (Corning, NY, USA) | 3527 | Przeznaczone do hodowania tkanek |
| Sterylny papier filtrowy | N/A | N/A | Usuwanie tłuszczu i wsparcie w rozcinaniu |
| Środek DMEM/F-12 | Gibco, Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, USA) | 11320033 | Formuła 1:1 |
| Izolowane fetalne surowica bydła (FBS) | Gibco, Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, USA) | 10082147 | Inaktywowane termicznie |
| Dodatek ITS | Gibco, Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, USA) | 41400045 | 100X |
| Dodatek GlutaMAX | Gibco, Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, USA) | 35050061 | 100X |
| Penicylina-streptomycyna (100X) | Gibco, Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, USA) | 15140122 | Antybiotyk |
| PBS 1X | Gibco, Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, USA) | 10010023 | pH 7.4 |
| Kolagenaza typu I | Gibco, Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, USA) | 17100-017 | Trawienie tkanki |
| DNase I | Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA) | DN25-1 | Trawienie tkanki |
| Angiotensyny II (Ang II) | Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA) | A9525 | Stymulacja hormonalna |
| Adrenokortykotropinowy hormon (ACTH) | Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA) | A0298 | Stymulacja hormonalna |
| Forskolin | Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA) | F6886 | Stymulacja cAMP |
| Chlorku potasu (KCl) | Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA) | P9541 | Stymulacja aldosteronem |
| Chlorku sodu (NaCl) | Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA) | S7653 | Kontrola pojazdu |
| Małe nożyczki chirurgiczne | Fine Science Tools (Foster City, CA, USA) | 14060-09 | Rozcinanie |
| Skalpel z jednorazowym ostrzem | Fine Science Tools (Foster City, CA, USA) | 10003-12 | Mikrorozcinanie |
| Drążki | Fine Science Tools (Foster City, CA, USA) | 11252-00 | Rozcinanie |
| Zaokrąglone drążki | Fine Science Tools (Foster City, CA, USA) | 11251-10 | Rozcinanie |
| Kopułkowy dyfuzor powietrza | Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, USA) | N/A | Sterylne przetwarzanie tkanki |
| Inkubator | Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, USA) | N/A | Hodowla komórek |
| Centryfuga | Eppendorf (Hamburg, Germany) | N/A | Pelletowanie komórek |
| Komora do liczenia Neubauera | Hausser Scientific (Horsham, PA, USA) | 1490 | Liczenie komórek |
| Środek RIPA do lizy i ekstrakcji | Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, USA) | 89901 | Ekstrakcja białka |
| Kompleks inhibitorów proteaz Halt | Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, USA) | 87786 | Ekstrakcja białka |
| Fisherbrand Model 120 Sonic Dismembrator | Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, USA) | FB120 | Sonizacja |
| System RIA | Tecan (Männedorf, Switzerland) | MG13051 | Ilościowa analiza hormonów |
| Cobra II Auto-Gamma Counter | Berthold Technologies (Bad Wildbad, Germany) | N/A | Pomiar radioaktywności |
| Zestaw ELISA kortykosteronu (96-dołkowy) | Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, USA) | 55-CORMS-E01 | Pomiar hormonów |
| Środek montujący ProLong Gold Antifade | Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, USA) | P36930 | Środek montażowy |
| Przeciwciało pierwotne mysie przeciwko Dab2 | BD Biosciences (San Jose, CA, USA) | 610464 | Przeciwciało pierwotne |
| Przeciwciało pierwotne kurczaka przeciwko GFP | Aves Labs (Tigard, OR, USA) | GFP-1020 | Przeciwciało pierwotne |
| Przeciwciało pierwotne królicze przeciwko RFP | Rockland Immunochemicals (Limerick, PA, USA) | 600-401-379 | Przeciwciało pierwotne |
| Przeciwciało wtórne Alexa Fluor 594 kozła przeciwko myszy | Invitrogen (Carlsbad, CA, USA) | A-11005 | Przeciwciało wtórne |
| Przeciwciało wtórne Alexa Fluor 594 kozła przeciwko kurczakowi | Invitrogen (Carlsbad, CA, USA) | A-11042 | Przeciwciało wtórne |
| Przeciwciało wtórne Alexa Fluor 647 kozła przeciwko królikowi | Invitrogen (Carlsbad, CA, USA) | A-21244 | Przeciwciało |
Bibliografia
- Zelander, T. The ultrastructure of the adrenal cortex of the mouse. Z. Zellforsch. Mikrosk. Anat. 46 (6), 710-716 (1957).
- Nishimoto, K., et al. Adrenocortical zonation in humans under normal and pathological conditions. J. Clin. Endocrinol. Me....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
