Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Nowatorski, bezsurowy system hodowli 2D i 3D, składający się z dwóch małych cząsteczek do hodowli komórek nabłonka gruczołów łzowych myszy

257 wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/70438

⸱

10 lutego 2026

 ,  , 
1Department of Ophthalmology Optometry Center, China-Japan Union Hospital of Jilin University, 2Eye Institute & Affiliated Xiamen Eye Center, School of Medicine, Xiamen University, 3Huaxia Eye Hospital of Quanzhou, 4Shen Zhen Research Institute of Xiamen University

W tym artykule

Podsumowanie

Wprowadzono nowatorski system hodowli wolnych od surowicy wykorzystujący kombinację małych cząsteczek 2C (Y27632 i SB431542), który efektywnie rozszerza komórki nabłonkowe gruczołów łzowych (LGEC) zarówno w hodowlach 2D, jak i 3D, umożliwiając precyzyjną kontrolę ich proliferacji i różnicowania.

Streszczenie

Dysfunkcja gruczołów łzowych (LG) jest główną przyczyną niedoboru suchości oka z niedoborem wodnych, a terapie komórkowe i inżynieria tkankowa wykazują znaczący potencjał w tym schorzeniu. Jednak ograniczona dostępność wystarczającej liczby komórek nasion hodowanych w warunkach wolnych od surowicy utrudniła ich szerokie zastosowanie. W tym badaniu opracowaliśmy nowy system hodowli wolnej od surowicy wykorzystujący dwie małe cząsteczki, Y27632 i SB431542 (2C), aby efektywnie rozszerzać komórki nabłonkowe LG (LGEC). Dla 2D pierwotnej hodowli LGEC LG izolowano z myszy w wieku 6-8 tygodni i enzymatycznie trawiono przy użyciu Dispaze II i kolagenazy A. Powstała zawiesina komórkowa została zasiewana do posiewów o gęstości 7 500 komórek/cm2 i hodowana z 2C przez 12-14 dni. Gdy konfluencja komórek osiągnęła 80-90%, rozpoczęto podhodowlę w stosunku 1:2. Do hodowli 3D 10 000 LGEC P1 zostało ponownie zawieszonych w 10 μL 2C i 10 μL żelu matrycowego, a następnie zasiano w centrum płytki z 24 dołkami. Po 30-minutowym okresie zastygania w temperaturze 37 °C dodano 600 μL 2C do kontynuacji hodowli. W celu różnicowania 3D sferoidy hodowano 2C przez 7 dni, następnie usunięto 2C i kontynuowano hodowlę przez kolejne 7 dni. LGEC hodowane z użyciem 2C wykazywały wysoką proliferację, z podwyższoną ekspresją ptenia i markerów proliferacji (Ki67, K14, P63, K5, K15 [P = 0,0011, 0,0002, 0,0012, 0,0003, 0,0014 odpowiednio]), a także utrzymywały morfologię i zdolność proliferacji nawet po dziesięciu przejściach. Ponadto, w warunkach 3D LGEC tworzyły sferoidy o cechach preniazowych/przekowych, które dalej różnicowały się w struktury mikrogruczołowe zawierające wiele typów komórek LG (AQP5, K19, α-SMA-dodatnie) oraz dojrzałe funkcje sekretoryczne po usunięciu 2C. Oczekuje się, że takie podejście zapewni stabilne źródło komórek nasiennych do inżynierii tkankowej oraz zaoferuje nowy model in vitro do badania fizjologii LG.

Wprowadzenie

Gruczoł łzowy (LG) jest niezbędny do produkcji wodnej warstwy filmu łzowego, co jest kluczowe dla utrzymania homeostazy powierzchni oka1. Dysfunkcja LG, spowodowana urazem lub stanem zapalnym, prowadzi do niedoboru wody suchego oka (ADDE). To schorzenie może prowadzić do ciężkiego zapalenia powierzchni oka, przewlekłej choroby rogówki, a w ciężkich przypadkach do trwałej utraty wzroku2. Obecne leczenie ADDE koncentruje się głównie na objawach, nie zajmując się leżącą u podstaw zaburzeniem czynności gruczołów, które ograniczają ich długoterminową skuteczność1. Rozwój terapii celowanych dla dysfunkcji LG wiąże się z wieloma wyzwaniami, w tym brakiem długoterminowych, prostych modeli in vitro, które ograniczają zrozumienie patofizjologii LG i utrudniają rozwój skutecznych terapii. Chociaż przeszczep komórek wykazał potencjał w stymulowaniu regeneracji LG, ograniczona zdolność do rozszerzania komórek in vitro oraz złożoność istniejących systemów hodowli stanowią istotne przeszkody dla zastosowań klinicznych 1,3. Dlatego ustanowienie prostego, długoterminowego systemu hodowli dorosłych myszy LG jest niezbędne dla pogłębienia wiedzy o fizjologii i patologii LG, a także dla zapewnienia wiarygodnego źródła komórek macierzystych/progenitorowych LG do naprawy i regeneracji urazów LG.

Istniejące systemy kultury in vitro dla LG poczyniły znaczące postępy, ale nadal napotykają znaczące ograniczenia. Wiele z tych metod opiera się na nośnikach uzupełnianych surowicą, co wprowadza kilka problemów, takich jak zmienność partia do partii, nieokreślone składniki oraz ryzyko zakażenia fibroblastów lub komórek mezenchymalnych 4,5,6,7,8. Ponadto systemy oparte na surowicy nie nadają się do badania patogennych mechanizmów chorób LG i stanowią wyzwanie dla terapii transplantacji komórek ze względu na potencjalne ryzyko odrzucenia układu odpornościowego9. W odpowiedzi na te ograniczenia opracowano kilka metod bezsurowicowych do hodowli komórek nabłonka LG (LGEC) zarówno u myszy, jak i u ludzi. Na przykład Ueda i in. z powodzeniem zastosowali metodę bezsurowicową do hodowli LGEC z nowo narodzonych myszy10. Jednak metoda ta była ograniczona przez niemożność przepuszczenia komórek przez podkultury oraz konieczność posiadania dużej liczby gruczołów noworodkowych, aby uzyskać wystarczającą ilość LGEC. Podobnie Kobayashi i in. opracowali system hodowli bez surowicy z toksyną cholery, ale napotkali trudności w utrzymaniu morfologii komórkowej podczas pasusu11. Najnowsze osiągnięcia obejmują opracowanie systemu hodowli 3D dla komórek macierzystych LG myszy oraz systemu hodowli organoidów LG Bannier-Hélaouët i in. dla myszy i ludzi 12,13,14,15. Jednak systemy te opierają się na złożonych formułach mediów z wieloma małymi cząsteczkami, czynnikami wzrostu i dodatkami, co komplikuje proces hodowli i ogranicza skalowalność. Te wyzwania podkreślają potrzebę uproszczonego, skutecznego systemu hodowli wolnego od surowic, który umożliwi efektywną ekspansję LGEC, jednocześnie zachowując ich właściwości proliferacyjne i stem/progenitorowe do dalszych zastosowań terapeutycznych i badań.

W ostatnich latach szybki rozwój przeprogramowania chemicznego pośredniczonego przez małe cząsteczki wprowadził nowe strategie utrzymania i rozbudowy pierwotnych komórek dorosłych in vitro16. Regulując szlaki sygnalizacyjne wewnątrzkomórkowe, interakcje między macierzą komórkową i adhezję komórkową, małe cząsteczki znacząco zwiększają proliferację i plastyczność komórek, poprawiając efektywność ekspansji komórek i kontrolę losu17. Dzięki kontrolowanej produkcji, niskiej immunogeniczności oraz integracji niegenomowej, małe cząsteczki są idealne do budowy systemów in vitro dla rozszerzających się dorosłych komórek nabłonkowych16. Wykazano, że kombinacje różnych małych cząsteczek skutecznie podtrzymują ekspansję in vitro różnych typów komórek pierwotnych, w tym komórek macierzystych skóry, rogówki i nabłonka spojówkowego 18,19,20. Dlatego opracowanie strategii opartej na małych cząsteczkach w celu rozszerzenia LGEC wykazuje potencjał do przyszłych zastosowań zarówno w badaniach, jak i terapii.

W tym protokole opracowano prosty i wydajny system hodowli wolnej od surowicy wykorzystujący dwie małe cząsteczki, Y27632 i SB431542 (2C), aby wspierać rozszerzanie LGEC. Łącząc zalety tych dwóch cząsteczek, powstał system wolny od surowicy zarówno dla hodowli 2D, jak i 3D. LGEC hodowane z użyciem 2C wykazywały wysoką zdolność proliferacji oraz cechy komórek macierzystych/progenitorowych, zachowując typową morfologię komórek nabłonkowych po co najmniej 10 przejściach in vitro. W hodowli 3D LGEC nie tylko zachowały cechy komórek macierzystych i progenitorowych, ale także wykazywały zdolność dalszego różnicowania się w struktury sekretyczne po usunięciu 2C, tworząc struktury mikroglandołowe o funkcji sekrecyjnej. Ten system bezsurowicowy nadaje się do modelowania in vitro fizjologii i patologii LG, a także stanowi znaczące źródło komórek do inżynierii tkankowej LG i zastosowań regeneracyjnych. Jednak obecny protokół zapewnia jedynie wstępne zbadanie kultury 3D. Długoterminowa kultura 3D wykracza poza zakres tych badań na tym etapie. Ważne jest, aby zauważyć, że metoda ta została zaprojektowana specjalnie dla dorosłych myszy LGEC i może nie być stosowalna do innych gatunków bez dalszej optymalizacji.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszystkie eksperymenty przeprowadzono zgodnie z przepisami Stowarzyszenia Badań nad Wzrokiem i Okulistyką (ARVO) oraz Komitetu Etyki Zwierząt Eksperymentalnych Uniwersytetów Jilin i Uniwersytetu Xiamen.

UWAGA: Wszystkie procedury hodowli komórek przeprowadzano w szafce biobezpieczeństwa sterylizowanego UV, w sali operacyjnej komórek.

1. Podstawowa kultura LGEC

  1. Izolacja tkanki LG
    1. Uśpienie znieczulonych myszy C57BL/6J (6-8 tygodni) przez zwichnięcie szyjki macicy i dezynfekuj okolice ucha (wokół LG) 75% etanolem, aby uniknąć zanieczyszczenia.
    2. Wykonaj nacięcie od zewnętrznego kantusa do skóry pod uchem, aby odsłonić LG. Używając sterylnych, gładkich kleszczy i nożyczek, ostrożnie oddziel LG od otaczającej tkanki (gruczoły przyuszne i tkanka łączna) pod mikroskopem rozwarstwienia, aby uzyskać LG.
    3. Umieść LG w wcześniej schłodzonym nośniku do zbierania tkanek (DMEM z 10% penicyliną-streptomycyną-amfeteryczyną) w probówce mikrowirówki o pojemności 1,5 mL, utrzymując tkankę na lodzie i minimalizując degradację.
  2. Przygotowanie tkanek
    1. Przełóż LG do nowego nośnika do zbierania zimnej tkanki w naczyniu o średnicy 3,5 cm.
    2. Usuń resztki sierści myszy, a następnie odklej torebkę tkanki łącznej otaczającą LG. Odizoluj tkankę gruczołową, używając gładkich kleszczy, aby usunąć tkankę łączną między płatkami.
      UWAGA: Upewnij się, że torebka na powierzchni LG oraz tkanka łączna między płatkami są dokładnie usunięte, aby odsłonić przewody między płatami, co ułatwi przenikanie roztworu trawiennego podczas dalszego procesu trawienia.
    3. Przełóż tkankę do nowego nośnika i myj przez 5-10 minut, aby zapobiec zanieczyszczeniu.
  3. Trawienie enzymatyczne
    1. Umieść LG w rurce mikrowirówki o pojemności 1,5 mL zawierającej roztwór trawienia (medium bezsurowicowe, uzupełnione 2 mg/mL Dispaze II i 2 mg/mL kolagenazą A). (Tabela uzupełniająca 1).
      UWAGA: Potrzebny jest 1 ml roztworu trawiennego dla 4 LG.
    2. Drobno rozciąć tkankę LG mikronożyczkami na małe kawałki (około 0,5-1 mm³) wewnątrz rurki.
    3. Inkubuj rurkę mikrowirówki w temperaturze 37 °C z 5%CO2 przez 2,5-3 godziny. Co 30-60 minut delikatnie mieszaj tkankę w roztworze trawiennym, aby zapewnić dokładne trawienie enzymatyczne.
  4. Izolacja LGEC i eksploatacja
    1. Po zakończeniu procesu trawienia potrząśnij rurką mikrowirówki kilka razy. Pipetować roztwór trawienny kilka razy, aby rozbić tkankę na pojedyncze komórki lub małe skupiska komórek. Obserwuj pod mikroskopem, aby potwierdzić postęp trawienia.
      UWAGA: Gdy w roztworze trawienia nie pozostają żadne widoczne cząstki, a pod mikroskopem zaobserwowane są duże liczby pojedynczych komórek oraz agregatów komórkowych przypominających przewody, należy zatrzymać proces trawienia.
    2. Wiruj probówkę w 300 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej, a następnie wyrzuć podłoże trawienne.
    3. Ponownie zawiesić pellet komórkowy w 1 mL sterylnego DPBS i ponownie wirować w 1000 x g przez 3 minuty w temperaturze pokojowej, aby usunąć pozostałe enzymy trawienne.
    4. Powtórz krok 1.4.3, usuń supernatant i ponownie zawiesij osad komórkowy w 500 μL medium wolnego od surowic.
  5. Rozstawienie LGEC i kultura podstawowa
    1. Przygotuj pożywkę hodowlową LGEC, uzupełniając pożywkę bezsurowicową o 1% penicylin-streptomycyny oraz 2C (10 μM Y27632 i 10 μM SB431542). (Tabela uzupełniająca 1)
    2. Rozsiewaj komórki na standardowe, nieprzetworzone płytki hodowlane z 24 dołkami o gęstości 7,5 x 10³/cm², używając bezsurowicowego medium 2C.
    3. Po wysiewie delikatnie stukaj w krawędzie płytki hodowlowej, aby zapewnić równomierne rozmieszczenie komórek. Włóż talerz do inkubatora o temperaturze 37 °C z 5%CO2.
    4. Po raz pierwszy zmień podłoże po 72 godzinach od siewu. Następnie zmieniaj medium co 2-3 dni.
      UWAGA: Unikaj zakłócania kultury w pierwszych 72 godzinach. Przy pierwszej zmianie podłoża nie myj komórek DPBS. Po prostu usuń stary podłoże i dodaj świeże podłoże.

2. Subkulturowanie LGEC

UWAGA: Podhodowla, gdy konfluencja komórek osiąga 80-90%, co zazwyczaj następuje około 14 dni po hodowli pierwotnej.

  1. Usuń podłoże i delikatnie umyj komórki dwukrotnie sterylnym DPBS.
  2. Dodaj 250 μL 0,25% trypsyny-EDTA i inkubuj w temperaturze 37 °C z 5%CO2 przez 10-15 minut. Gdy styki się rozdzielą, a komórki zaokrąglią się w górę, dodaj równą objętość zdefiniowanego roztworu inhibitora trypsyny, aby zakończyć trawienie.
    UWAGA: Jeśli podczas hodowli pierwotnej zaobserwowane są płaskie i duże przylegające komórki, należy poddać hodowli 0,25% trypsyny-EDTA przez 5 minut, aby usunąć te heterogeniczne komórki. Następnie ponownie podaj hodowlę 0,25% trypsyny-EDTA przez dodatkowe 5 minut, aby dalej je strawić i uzyskać czystszą populację LGEC do dalszego przejścia.
  3. Wymieszaj zawiesinę ogniwową przez pipetowanie z pipetą o pojemności 1 mL, następnie przelej do rurki wirówki o pojemności 1,5 mL i wiruj w 1000 x g przez 3 minuty w temperaturze pokojowej. Usuń nadmiar.
  4. Przemyj komórki sterylnym DPBS i ponownie wiruję w wirówce, aby zebrać LGEC.
  5. Ponownie zawiesić LGEC w podłożu 2C i nasiona w stosunku 1:2 do subkultury. Delikatnie wymieszaj komórki, potrząsając płytką hodowlową i inkubuj w temperaturze 37 °C z 5%CO2.
    UWAGA: Subkultywacja w stosunku 1:2 oznacza, że gdy konfluencja komórek osiągnie 80-90%, LGEC są trawione z jednej płytki studni i równomiernie rozdzielane na dwie nowe płytki studni.
  6. Zmień podłoże 3 dnia po zasiewaniu, a potem co 2-3 dni, w zależności od stanu komórek.
  7. Codziennie obserwuj morfologię komórek pod mikroskopem kontrastu fazowego i dokumentuj za pomocą zdjęć.

3. Trójwymiarowa (3D) kultura LGEC

UWAGA: Eksperyment hodowli 3D wykorzystuje P1 LGEC. Gdy LGEC P1 osiągają 80-90% konfluencji po 7 dniach hodowli z 2C, stosuje się je do hodowli 3D.

  1. Kroki przygotowawcze
    1. Przenieś żel matrycowy (Tabela Uzupełniająca 1) z zamrażarki o temperaturze -20 °C do lodówki o temperaturze 4 °C, aby rozmrażać przez noc.
    2. Umieść wymagane końcówki pipet do zamrażarki o temperaturze -20 °C, aby zapewnić odpowiednie wstępne schładzenie.
    3. Podgrzej 24-dołkowy płytę hodowlę, umieszczając ją w inkubatorze 37 °C z 5%CO2 na 2 godziny przed rozpoczęciem hodowli 3D.
    4. Przygotuj lodówkę i umieść w niej kilka rurek mikrowirówek o pojemności 1,5 mL do wstępnego schładzania. Przed użyciem wysterylizuj lodówkę w szafce bioasekuracji.
  2. Kultura 3D LGEC
    1. Uzyskaj LGEC P1, zgodnie z krokami 2.1 do 2.4.
    2. Ponownie zawiesij pellet komórkowy w pożywce hodowlowej 2C i dostosuj gęstość komórek do 1 × 10⁴ komórek na 10 μL.
    3. Weź rozmrożony żel matrycowy z lodówki o temperaturze 4 °C oraz wstępnie schłodzone końcówki pipety z zamrażarki o temperaturze -20 °C i umieść je w lodówce wewnątrz szafki na zabezpieczenia biologicznego.
    4. Wyjmij podgrzaną 24-dołkową płytkę hodowlową z inkubatora i umieść ją w szafce zabezpieczeń biologicznych.
    5. Dodaj odpowiednią objętość zawiesiny komórkowej, wymieszanej z żelem matrycowym w proporcji 1:1, używając wstępnie schłodzonych końcówek pipet. Mieszaj delikatnie, aby zapewnić równomierne rozmieszczenie materiału.
    6. Pipeta 20 μL mieszaniny od kroku 3.2.5 ostrożnie do środka każdego dołka na podgrzanej 24-dołkowej płytce.
    7. Odwróć płytkę i inkubuj ją w inkubatorze o temperaturze 37 °C i 5%CO2 przez 30 minut, aby żel matrycowy mógł się zastygnąć.
    8. Gdy żel matrycowy zastygnie, dodaj 600 μL pożywki 2C do każdego dołku.
    9. Inkubuj płytkę hodowlę w inkubatorze o temperaturze 37 °C i 5%CO2 przez 14 dni. Zmień podłoże 3. dnia po siewie i co 2-3 dni po tym, w zależności od stanu komórki.
    10. Codziennie obserwuj formowanie się 3D sferoidów pod mikroskopem kontrastu fazowego i rejestruj obrazy do dokumentacji.
  3. Różnicowanie 3D sferoidów LGEC
    1. Hoduj 3D sferoidy LGEC zgodnie z krokiem 3.2.
    2. Po 7 dniach hodowli usuń podłoże 2C i delikatnie przemyj komórki dwukrotnie DPBS, aby usunąć pozostałe 2C. Uważaj, żeby nie ruszyć żelu matrycowego.
    3. Dodaj pożywkę bezsurowicową bez 2C (Null) i kontynuuj hodowlę przez kolejne 7 dni, aby wywołać różnicowanie.
    4. Zmieniaj podłoże co 2-3 dni podczas okresu hodowli.
    5. Codziennie obserwuj zmiany morfologiczne indukowanych 3D sferoidów pod mikroskopem kontrastu fazowego i rejestruj obrazy do dokumentacji.

4. Osadzanie i mrożone przekroje zróżnicowanych 3D sferoidów LGEC

UWAGA: Różniczkowanie 3D sferoidów jest indukowane zgodnie z opisem w sekcji 3.3. Po 7 dniach różnicowania postępuj zgodnie z poniższymi krokami dotyczącymi optymalnego osadzenia w temperaturze cięcia (OCT) oraz zamrożenia przekroju zróżnicowanych 3D sferoidów.

  1. Aspiruj pożywkę hodowlę wzdłuż krawędzi studni. Delikatnie umyj rozróżnione sferoidy trzy razy sterylnym DPBS.
  2. Dodaj 1 mL 4% paraformaldehydu (PFA) do studni w szafce biosafety lub okapu i utrwal sferoidy w temperaturze pokojowej przez 10 minut.
  3. Delikatnie umyj sferoidy trzy razy sterylnym DPBS, każde mycie trwa 10 minut, aby usunąć utrwalający środek.
  4. Użyj łopatki, aby ostrożnie zeskrobać żelową strukturę 3D z matrycą sferoidalną i przenieść ją do rurki mikrowirówki 5 mL zawierającej 20% roztwór sacharozy.
  5. Inkubuj rurkę przez noc w temperaturze 4 °C, aż struktura kopuły osiądzie na dnie rurki.
  6. Usuń strukturę kopuły z roztworu sacharozy, ostrożnie usuń resztki sacharozy i zanurz ją w związku OCT. Zamroz w ciekłym azocie i przechowuj w temperaturze -80 °C.
  7. Przed barwieniem przygotuj przekroje o grubości 10 μm za pomocą mikrotomu mrażącego.

5. Detekcja funkcji wydzielania zróżnicowanych 3D sferoidów LGEC

  1. Zbieranie próbek
    1. Indukuj różnicowanie 3D sferoidów opisanych w sekcji 3.3.
    2. Po 7 dniach różnicowania usuń podłoże hodowlane i przemyj 3D sferoidy trzy razy DPBS.
    3. Dodaj 500 μL bezsurowiczego medium bez 2C i inkubuj w temperaturze 37 °C z 5%CO2 przez 2 godziny.
    4. Pobierz podłoże hodowlane i przelej je do rurki mikrowirówki o pojemności 1,5 mL jako próbki wyjściowej, aby zmierzyć stężenie laktoferyny (LTF) przed stymulacją pilokarpiną.
    5. Delikatnie umyj 3D sferoidy trzy razy sterylnym DPBS.
    6. Dodaj 500 μL bezsurowicowego medium zawierającego 1 μg/mL pilokarpiny i inkubuj 3D sferoidy w temperaturze 37 °C z 5%CO2 przez 24 godziny.
    7. Po inkubacji należy zebrać pożywkę do mikrowirówki o pojemności 1,5 mL (do pomiaru stężenia LTF po stymulacji pilokarpiny).
    8. Wirówka zebrane próbki pośrodku hodowlanego w temperaturze 4 °C i 1000 × g przez 20 minut. Zbierz supernatant i przechowuj go w temperaturze -80 °C do późniejszego użycia.
  2. Rozcieńczenie próbki
    1. Pobierz próbki z zamrażarki o temperaturze -80 °C i pozwól im całkowicie rozmrozić w temperaturze pokojowej.
    2. Pobierz 5 μL próbki i rozcieńcz ją 495 μL buforu rozcieńczania próbki z zestawu enzymatycznie immunosorbentnego testu (ELISA), aby przygotować 100-krotne rozcieńczenie.
  3. Przygotowanie odczynników
    1. Wszystkie odczynniki zestawu ELISA podnieś do temperatury pokojowej na 20 minut przed użyciem.
    2. Przygotuj bufor płukania: Oblicz wymaganą ilość na podstawie liczby próbek i rozcieńcz skoncentrowany bufor płukania wodą destylowaną (1:24).
    3. Przygotuj standardowe rozwiązanie operacyjne:
      1. Rozwinuj liofilizowany standard w dawce 10 000 × g przez 1 minutę. Dodaj 1 mL Standard referencyjnego i Sample Diluent, pozostawij na 10 minut i delikatnie odwróć kilka razy.
      2. Po całkowitym rozpuszczeniu dokładnie wymieszaj pipetą. Ta rekonstrukcja daje działający roztwór o wartości 2000 pg/mL.
    4. Wykonuj seryjne rozcieńczenia zgodnie z instrukcjami zestawu, aby przygotować następujący standardowy gradient stężenia: 2000, 1000, 500, 250, 125, 62,5, 31,25, 0 pg/mL.
    5. Przygotuj biotynowo opracowany roztwór przeciwciał wykrywający:
      1. Oblicz wymaganą objętość do testu (50 μL/dołek). Rozwiń skoncentrowane biotinylowane przeciwciało wykrywające w stężeniu 800 × g przez 1 minutę, a następnie rozcieńcz 50× skoncentrowane biotinylowane ciało wykrywające do roztworu roboczego o pojemności 1× za pomocą rozcieńczalnika przeciwciał wykrywających biotynylowo.
      2. Przygotowuj roztwór tuż przed użyciem, wykorzystując nieco więcej niż obliczona, zazwyczaj dodając o 100-200 μL więcej niż jest potrzebne.
    6. Przygotuj sprzężony roztwór roboczy peroksydazy chrzanu (HRP):
      1. Oblicz wymaganą objętość do eksperymentu (50 μL/studnia). Wiruj skoncentrowany sprzężony HRP w stężeniu 800 × g przez 1 minutę, a następnie rozcieńczaj go do stężenia roboczego 1x za pomocą sprzężonego rozcieńczalnika HRP.
      2. Przygotowuj roztwór tuż przed użyciem, wykorzystując nieco więcej niż obliczona, zazwyczaj dodając o 100-200 μL więcej niż jest potrzebne.
  4. Procedura testu ELISA
    1. Określ studnie dla rozcieńczonego standardu, pustej i próbki, z 3 replikami dla każdej. Dodaj 25 μL standardowego roztworu roboczego, pustego lub rozcieńczonego roztworu próbki do odpowiednich dołków. Przykryj płytkę środkiem uszczelniającym w zestawie i inkubuj w temperaturze 37 °C przez 90 minut.
      UWAGA: Roztwory należy dodać na dno mikropłytki ELISA. Unikaj dotykania wewnętrznej ściany i powstawania piany tak bardzo, jak to możliwe.
    2. Przelać płyn z dół bez mycia. Natychmiast dodaj 50 μL biotinylowanego roztworu przeciwciał wykrywających do każdego dołku. Przykryj płytkę nowym impregnatem i inkubuj w temperaturze 37 °C przez 60 minut.
    3. Przelej płyn z odwiertów i dodaj 350 μL przygotowanego bufora do odwiertu. Namocz przez minutę, następnie zasysaj lub przelej płyn z każdego dołka i osusz czystym chłonnym papierem. Powtórz ten krok mycia trzy razy.
      UWAGA: Nie pozwól, by studnie wyschły podczas procesu mycia.
    4. Do każdego odwiertu dodaj 50 μL przygotowanego sprzężonego roztworu roboczego HRP. Przykryj płytkę nowym impregnatem i inkubuj w temperaturze 37 °C przez 30 minut.
    5. Przelej płyn z odwiertów i powtórz proces płukania pięć razy z buforem płukania, jak opisano w kroku 5.4.3.
    6. Do każdego dołka dodaj 50 μL odczynnika substratowego. Przykryj płytkę nowym impregnatem i inkubuj w temperaturze 37 °C w ciemności przez 15 minut.
    7. Do każdego dołka dodaj 25 μL roztworu stopowego, aby zakończyć reakcję. Upewnij się, że roztwór stop jest dodawany w tej samej kolejności co roztwór podłoża.
    8. Natychmiast określ gęstość optyczną (wartość OD) każdego otworu na 450 nm za pomocą czytnika mikropłyt.

6. Izolacja RNA

  1. Zbieranie próbek
    1. Dla tkanek LG
      1. Wyizoluj pozaoczodołową tkankę LG od dorosłych myszy, zgodnie z opisem w sekcji 1.1.2-1.1.2.
      2. Zanurz świeżo wyizolowaną tkankę LG w PBS, aby zmyć krew.
      3. Nasącz wilgotność powierzchniową LG papierem filtracyjnym i umieść tkankę w rurce mikrowirówki o pojemności 1,5 mL zawierającej 1 mL odczynnika do ekstrakcji RNA (Tabela Uzupełniająca 1), utrzymując rurkę na lodzie.
        UWAGA: Przed ekstrakcją RNA wykonuj kroki szlifowania, aby zapewnić pełną lizę tkanki.
      4. Dodaj dwie czyste stalowe kulki do rurki mikrowirówki, a następnie umieść rurkę w wstępnie schłodzonej, szybkiej maszynce niskotemperaturowej.
      5. Ustaw parametry młynka: częstotliwość 70 Hz, czas mielenia 45 s, czas pauzy 15 s i powtarzaj przez 10 cykli. Dokręć uchwyt kapsla i zacznij mielić.
      6. Umieść rurkę na lodzie lub przechowuj ją w temperaturze -80 °C do dalszej ekstrakcji RNA po zakończeniu procesu mielenia.
    2. Dla LGEC
      1. Usuń pożywkę hodowlową i przepłucz komórki trzy razy sterylnym DPBS, gdy LGEC osiągną 80-90% zbiegu.
      2. Dodaj 600 μL odczynnika do ekstrakcji RNA do każdego dołku (dla płytki z 24 dołkami) i inkubuj w temperaturze pokojowej przez 5-10 minut.
      3. Użyj pipety o pojemności 1 mL, aby wielokrotnie pipetować roztwór odczynnika ekstrakcyjnego RNA w każdym dołku, aby zapewnić pełną lizę komórek.
      4. Przelej roztwór do rurki mikrowirówki o pojemności 1,5 mL.
      5. Umieść probówkę na lodzie lub przechowuj ją w temperaturze -80 °C do dalszej ekstrakcji RNA.
    3. Dla 3D sferoidów LGEC
      1. Pobierz niezróżnicowane i zróżnicowane 3D sferoidy LGEC hodowane przez 14 dni, zgodnie z krokami 3.2-3.3. Do każdego dołku dodaj 1 ml roztworu trawiennego (medium bezsurowicowego zawierającego 1 mg/mL Dispase II), zapewniając pełne pokrytie żelowej struktury 3D z macierzą sferoidalną, kopułową. Inkubuj w 37 °C z 5% CO2 przez 30 minut.
      2. Przelej roztwór trawienny zawierający 3D sferoidy do rurki mikrowirówki o pojemności 1,5 mL za pomocą pipety o pojemności 1 mL. Wiruj w 1000 × g przez 3 minuty, aby zebrać granulki sferoidalne.
      3. Przemyj granulat 1 mL DPBS i wiruj w 1000 × g przez 3 minuty, aby ponownie zebrać granulat.
      4. Dodaj 600 μL odczynnika do ekstrakcji RNA (na 20 μL żelu matrycowego) i inkubuj w temperaturze pokojowej przez 5-10 minut.
      5. Dokładnie wymieszaj pipetą o pojemności 1 mL, aby zapewnić pełną lizę 3D sferoidów.
      6. Umieść probówkę na lodzie lub przechowuj ją w temperaturze -80 °C do dalszej ekstrakcji RNA.
  2. Ekstrakcja RNA
    UWAGA: Należy nosić odpowiedni osobisty sprzęt ochronny (fartuch laboratoryjny, rękawiczki, maseczka) i wykonywać wszystkie procedury związane z chloroformem i izopropanolem w okapie oparowym. Utylizacja strumieni odpadów chemicznych w wyznaczonych pojemnikach na odpady niebezpieczne oznaczonych do generowania odpadów niebezpiecznych, zgodnie z procedurami instytucjonalnej utylizacji.
    1. Dodaj chloroform (1/5 objętości odczynnika ekstrakcyjnego RNA) do rurki wirówki zawierającej próbkę RNA w odczynniku ekstrakcyjnym RNA (od kroku 6.1).
      UWAGA: Wykonaj zabieg w okapie wyparowym.
    2. Dokładnie wymieszaj za pomocą wiru i inkubuj w temperaturze pokojowej przez 10 minut, aż do separacji fazowej.
    3. Wirówka w 14 000 x g przez 10 minut w 4 °C.
      UWAGA: Po wirowaniu ciecz rozdziela się na trzy warstwy, z RNA w najwyższej przezroczystej fazie wodnej.
    4. Przygotuj nową rurkę wirówki wolnej od RNazy o pojemności 1,5 mL i dodaj izopropanol (połowę objętości odczynnika ekstrakcyjnego RNA) do okapu spalinowego.
    5. Delikatnie pipetuj najwyższą przezroczystą fazę wodną (połowa objętości odczynnika ekstrakcyjnego RNA) do nowej rurki wolnej od RNazy.
      UWAGA: Uważaj, aby nie zanieczyścić środkowej warstwy podczas pipetowania.
    6. Odwróć rurkę kilka razy, aby wymieszać i inkubować w temperaturze pokojowej przez 10 minut. Następnie ponownie wiruj w 14 000 x g przez 10 minut w 4 °C.
    7. Usuń supernatant i dodaj 500 μL 75% etanolu, aby przemyć pellet przez odwrócenie rurki. Ponownie wiruj w 14 000 x g przez 5 minut w 4 °C.
    8. Powtórz krok 6.2.7. Usuń supernatant i szybko przewiń wirowanie, aby usunąć wszelkie pozostałości cieczy.
    9. Umieść tubkę na lodzie w okapu, otwórz pokrywę i pozwól wyschnąć na powietrzu przez 10-20 minut, aż biały granulat stanie się półprzezroczysty.
    10. Dodaj 20 μL wody wolnej od RNazy, aby rozpuścić pellet. Zmierz stężenie i czystość RNA za pomocą spektrofotometru.
      UWAGA: Jeśli stężenie RNA jest zbyt wysokie, rozcieńcz go odpowiednią ilością wody wolnej od RNazy.
    11. Umieść roztwór RNA na lodzie lub przechowuj go w temperaturze -80 °C na potrzeby procesu transkrypcji odwrotnej.

7. Ilościowy RT-PCR (qRT-PCR)

  1. Transkrypcja odwrotna
    1. Do probówki PCR według instrukcji producenta należy dodać następujące składniki w kolejności: 800 ng całkowitego RNA (oblicz objętość na podstawie stężenia), 4 μL 5x All-in-One SuperMix dla q-PCR, 1 μL usuwacza gDNA oraz wodę wolną od RNazy, aby zwiększyć całkowitą objętość do 20 μL.
    2. Delikatnie wymieszaj składniki. Ustaw urządzenie PCR na następujące warunki: 55 °C przez 6 minut, 80 °C przez 1 minutę, a następnie 12 °C w nieskończoność.
    3. Przechowuj cDNA w temperaturze -20 °C lub trzymaj je w lodzie podczas procesu qRT-PCR po zakończeniu reakcji transkrypcji odwrotnej.
  2. qRT-PCR
    1. Przygotuj roztwór mieszanki qRT-PCR do celowania w różne geny w następujący sposób: 5 μL 2x Green qPCR SuperMix, 0,2 μL Forward Primer (10 μM), 0,2 μL Reverse Primer (10 μM) oraz 3,6 μL wody wolnej od nukleazy. Wymieszaj delikatnie i połóż na lodzie.
    2. Dodaj 9 μL mieszanki qRT-PCR (przygotowanej w kroku 7.2.1) oraz 1 μL cDNA (przygotowanej w kroku 7.1) do lamp qRT-PCR zgodnie z projektem eksperymentalnym.
    3. Wiruj probówki w temperaturze 1000 × g w temperaturze pokojowej przez 2 minuty.
    4. Umieść rurki w maszynie PCR do fluorescencji ilościowej do wykrywania.
      UWAGA: Stosuj metodę trzyetapową z następującym programem zgodnie z zaleceniami producenta odczynników: 94 °C przez 30 s, 94 °C przez 5 s, 60 °C przez 15 s oraz 72 °C przez 10 s. Zacznij cyklowanie od kroku 2 przez 40-45 cykli.
    5. Przeprowadz analizę ilościową metodą porównawczą CT (2-ΔΔCt).
      UWAGA: Każdy zbiór danych powinien być powtarzany co najmniej trzy niezależne razy, aby zapewnić wiarygodność wyników.

8. Barwienie immunofluorescencyjne

UWAGA: Barwienie immunofluorescencyjne przeprowadza się na LGEC hodowanych na płytkach 24-dołkowych o współczynniku konfluencji 70-80% lub na zamrożonych przekrojach zróżnicowanych struktur 3D LGEC.

  1. Dla LGEC
    1. Usuń pożywkę z dołków i przemyj komórki trzykrotnie PBS.
    2. Dodaj 500 μL 4% PFA do każdej studni w szafce biosafety lub okapie i inkubuj w temperaturze pokojowej przez 15 minut, aby utrwalić komórki.
    3. Umyj komórki trzy razy PBS, każde mycie trwa 5 minut.
    4. Dodaj 500 μL 0,2% Triton X-100, aby pokryć komórki i inkubuj w temperaturze pokojowej przez 20 minut, aby przepuścić błonę komórkową.
    5. Umyj komórki trzy razy PBS, każde mycie trwa 10 minut.
    6. Usuń PBS i użyj markera immunohistochemicznego, aby narysować okrąg wokół każdej jamki na 24-dołowej płytce. Dodaj 50 μL 2% BSA do każdego dołka, aby pokryć komórki. Inkubuj w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę, aby blokować.
    7. Usuń BSA i dodaj 50 μL rozcieńczonego przeciwciała pierwotnego (Tabela Uzupełniająca 1), aby pokryć LGEC. Inkubuj w temperaturze 4 °C przez 16-18 godzin.
    8. Usuń pierwotne przeciwciało i powtórz krok 8.1.5.
    9. Dodaj 50 μL fluorescencyjnego przeciwciała wtórnego do każdej jamki, aby pokryć LGEC. Inkubuj w temperaturze pokojowej w ciemności przez 1 godzinę.
    10. Powtórz krok 8.1.5, unikając ekspozycji na światło.
    11. Dodaj 50 μL roztworu 4',6-diamidino-2-fenylindolu (DAPI), aby pokryć LGEC i obserwować barwienie pod mikroskopem fluorescencyjnym.
  2. Dla 3D sferoidów LGEC
    1. Przygotuj 3D przekroje sferoidalne LGEC z zamrożeniem zgodnie z krokiem 4. Wykonaj barwienie immunofluorescencyjne zgodnie z krokami 8.1.2-8.1.11.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Ustanowienie systemu hodowli LGEC bez surowicy z wykorzystaniem 2C
W tym protokole celem było stworzenie prostszego, bardziej efektywnego systemu hodowli do rozszerzania pierwotnych LGEC myszy. Po szeroko zakrojonych badaniach opracowano bezsurowicową kombinację 2C, składającą się wyłącznie z Y27632 i SB431542, umożliwiającą długoterminową ekspansję LGEC in vitro. Po trawieniu enzymów mieszanych, pierwotne LGEC zaczęły się przylegać i tworzyć wiele klonów komórek po 3 dniach hodowli z 2C (d...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Jak opisano we wstępie, w ostatnich latach opracowano kilka systemów hodowli bez surowicy dla komórek LG 10,11,12,13. Jednak wiele z tych metod ma ograniczenia, w tym słabą proliferację komórek oraz niemożność osiągnięcia masowej ekspansji in vitro 10,11. Ponadto najnowsze systemy hodowli komórek macierzystych LG i organoidów b...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy deklarują brak konkurencyjnych interesów.

Podziękowania

Prace te były wspierane przez Narodową Fundację Nauk Przyrodniczych Chin (82471048, 82271045); Program Nauki i Technologii w Shenzhen (JCYJ20240813145510014); Specjalny Projekt Talentów Badawczych w Zdrowiu prowincji Jilin (2023SCZ63, 2024SCZ53, 2025SCZ65); oraz Projekt Rozwoju Nauki i Technologii Prowincji Jilin (YDZJ202601ZYTS389).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
 -20 stopni; C Lodówka ultra-niskiej temperaturyHaier
 -80 stopni; C Lodówka ultra-niskiej temperaturyHaier
0,25% trypsyna-EDTAGibco25200056
1,5 mL mikrowirówki i nbsp;KirgenKG2211Wolne od RNAZ
Naczynie hodowli komórek 35 mmLABSELECT12111
4 stopnie; C LodówkaHaier
4% paraformaldehydu (PFA)ServicebioG1101
4',6-diamidino-2-fenylindol (DAPI)Yeasen708939ES03Przechowywać w temperaturze -20 i stopień; C, zapas 1 mg/mL, 500x, rozcieńczony do 1x z 1x PBS
5 mL rurki wirówkowej  ACMECAC17457
50mL rurki wirówkowej i nie bsp;LABSELECTCT-002-50-SS
Przeciwciało antyalfa na aktynę mięśni gładkich dla królikaAbcamab5694Rozcieńczaj buforem rozcieńczającym przeciwciała w proporcji 1:100 
Przeciwciało królika anty-AQP5  ABklonalnyA9927Rozcieńczaj buforem rozcieńczającym przeciwciała w proporcji 1:100 
Przeciwciało królicze anty-cytokeratyna 14Abcamab181595Rozcieńczyć buforem rozcieńczającym przeciwciała w stężeniu 1:200 
Anty-cytokeratyna 19  przeciwciało króliczegoAbcamab52625Rozcieńczyć buforem rozcieńczającym przeciwciała w proporcji 1:400 
Przeciwciało królika przeciw Ki67AbcamAB16667Rozcieńczyć buforem rozcieńczającym przeciwciała w stężeniu 1:200 
Szafka bezpieczeństwa biologicznegoSterilGARD
Albumina surowicy bydłej (BSA)  Yeasen36101ES60Sklep na 4&f; C
Myszy C57BL/6JCentrum Zwierząt Laboratoryjnych Uniwersytetu Xiamen
Płytka hodowla komórkowaLABSELECT1131224-studnia
Inkubator komórkowyEppendorf
WirówkaEppendorf
ChloroformHUSHI10006818UWAGA: Wykonywanie operacji w okapie spalinowym
CO2  Inkubator o stałej temperaturzeEppendorf
Kolagenaza ARoche10103586001Przechowywać w temperaturze -20 i stopień; C, zapas 200 mg/mL, 100x
Zdefiniowany roztwór inhibitora trypsyny (DTI)GibcoR007100
DermaLife K Keratinocyte Medium Complete Kit (medium bez surowicy) Lina życiowaLL-0007Przechowywać w temperaturze 4 i stopnie; C
D-HanksBiosharpBL559A Używany do rozcieńczania Dispase II
Dimetylosulfoksyd (DMSO)SigmaD4540Używany do rozcieńczania Y27632 i SB431542
Dispase IISigmaD4693Przechowywać w temperaturze -20 i stopień; C, zapas 200 mg/mL, 100x
DMEM basic (1X)GibcoC11995500BT
Przeciwciało przeciwwtórne przeciwciało przeciw królikom osiołku (H+L) o silnej krzyżowej adsorbcji, Alexa Fluor 488InvitrogenA-21206Rozcieńczaj buforem rozcieńczającym przeciwciała w 1:300
Fosforanowa sól fizjologiczna Dulbecco (DPBS)ServicebioG4200
Absolut etanoluHUSHI10009218UWAGA: Używaj do przygotowania innych rozcieńczeń etanolu.
Mikrotom zamrażającyLeica
Młynek o wysokiej prędkości i niskiej temperaturzeServicebio
Odwrócony mikroskop fluorescencyjnyLeica
Mikroskop odwróconyOlympus
Izopropanol HUSHI80109270
Laserowy skanujący mikroskop konfokalny FV3000OLIMP
Niskotemperaturowa wirówka o wysokich prędkościachEppendorf
LTF zestaw enzymatycznie powiązany z testem immunosorbentnym (ELISA)  ElabscienceE-MSEL-M0047Przechowywać w temperaturze -20 i stopień; C
Żel matrycowy (Matrigel)82703MogengelAliquot i przechowywanie w temperaturze -20 i stopień; C
MikropipettorEppendorf
Czytnik mikropłytThermo Fisher Scientific
Woda wolna od nukleazyBiosharpBL510B
Złożenie OCTScigen4586
PBS, 1&razy; (pH7.4)ServicebioG4202
Wzmacniacz PCRBIO-RAD
Penicylina-StreptomycynaBiosharpBL505A
Penicylina-Streptomycyna-AmfocerycynaBiosharpBL142A
Zestaw PerfectStart Green qPCR SuperMixTransGen BiotechAQ601-01-V2Przechowywać w temperaturze -20 i stopień; C
PerfectStart Uni RT& Zestaw qPCRTransGen BiotechAUQ-01Przechowywać w temperaturze -20 i stopień; C
Pilokarpina AladynP424663Przechowywać w temperaturze -20 i stopień; C, 2500x
Zapalnik AQP5  sekwencja:
Forward:CATGAACCCAGCCCGATC
TT
Reverse:CTTCTGCTCCCATCCCAT
CC		Sangon Biotech
Spłonka K14  sequence:
Forward:CCCACCTTTCATCTTCC
CAATT
Reverse: AAGCCTGAGCAGCATGTAGCAG		Sangon Biotech
Spłonka K15  sequence:
Forward:GAGGTGGCGTCTAACACA
GA
Reverse:TCTGAGCCTCCATCTCAC
AG		Sangon Biotech
Spłonka K19  sequence:
Forward:ATTACTGCCCTGAGGAGC
CA
Reverse:TTCAGCTCCTCAATCCGA
GC		Sangon Biotech
Spłonka K5  sequence:
Forward:CTCAGAGCTGAGGAACAT
GC
Reverse:AGCTCCGCATCAAAGAAC
AT		Sangon Biotech
Primer Ki67  sequence:
Forward:ACCATCATTGACCGCTCC
TT
Reverse:TTGACCTTCCCCATCAGG
GT		Sangon Biotech
Primer LTF  sequence:
Forward:CAGGAGCCAACAAATGTG
CC
Reverse:TTGTACTGGTCCCTTTCG
GC		Sangon Biotech
Zapalnik P63  sequence:
Forward:ATGTCACCGAGGTTGTG
AAA
Reverse: GAATTCAGTGCCAACCTGTG		Sangon Biotech
Podkład SOX10  sequence:
Forward:ATCAGCCACGAGGTAATG
TCCAAC
Reverse:ACTGCCCAGCCCGTAGCCCCCCCC		Sangon Biotech
Primer & alfa;-SMA  sekwencja:
Naprzód:CTCCCTGGAGAAGAGCTA
CG
Wstecz:CGCTGACTCCATCCCAAT
GA		Sangon Biotech
Ilościowy instrument PCR fluorescencji w czasie rzeczywistymRoche
Izolator RNA do całkowitej ekstrakcji RNAVazymeR401-01UWAGA: Wykonywanie operacji w okapie spalinowym
SB431542 ApexbioA8249Przechowywać w temperaturze -20 i stopień; C, fabrycznie 20 mM, 2000x
Spektrofotometr NanoDrop 1000Thermo Fisher ScientificZmierz stężenie RNA
SacharozaMacklinS818046Rozpuszczać w wodzie destylowanej
Triton X-100SolarbioT8200
System ultraczystej wodyMillipore
Uniwersalny bufor rozcieńczający przeciwciałaEpizymePS119Przechowywać w temperaturze 4 i stopnie; C
Y27632 ApexbioB1293Przechowywać w temperaturze -20 i stopień; C, fabrycznie 20 mM, 2000x

Bibliografia

  1. Veernala, I., et al. Lacrimal gland regeneration: the unmet challenges and promise for dry eye therapy. Ocul Surf. 25, 129-141 (2022).
  2. Chen, X., Li, S., Zhang, Y., Ye, L. Progress and prospects in the treatment of lacrimal gland dysfunction diseases: from traditional treatment methods to stem cell and organoid therapies. Stem Cells Int. 2025, 6334284(2025).
  3. Hirayama, M., Kawakita, T., Tsubota, K., Shimmura, S. Challenges and strategies for regenerating the lacrimal gland. Ocul Surf. 14 (2), 135-143 (2016).
  4. Ackermann, P., et al. Isolation and investigation of presumptive murine lacrimal gland stem cells. Invest Ophthalmol Vis Sci. 56 (8), 4350-4363 (2015).
  5. Gromova, A., et al. Lacrimal gland repair using progenitor cells. Stem Cells Transl Med. 6 (1), 88-98 (2017).
  6. Millar, T. J., Herok, G., Koutavas, H., Martin, D. K., Anderton, P. J. Immunohistochemical and histochemical characterisation of epithelial cells of rabbit lacrimal glands in tissue sections and cell cultures. Tissue Cell. 28 (3), 301-312 (1996).
  7. Oliver, C. Isolation and maintenance of differentiated exocrine gland acinar cells in vitro. In Vitro. 16 (4), 297-305 (1980).
  8. Hann, L. E., Tatro, J. B., Sullivan, D. A. Morphology and function of lacrimal gland acinar cells in primary culture. Invest Ophthalmol Vis Sci. 30 (1), 145-158 (1989).
  9. Yoshida, K., et al. Serum-free medium enhances the immunosuppressive and antifibrotic abilities of mesenchymal stem cells utilized in experimental renal fibrosis. Stem Cells Transl Med. 7 (12), 893-905 (2018).
  10. Ueda, Y., et al. Purification and characterization of mouse lacrimal gland epithelial cells and reconstruction of an acinar-like structure in three-dimensional culture. Invest Ophthalmol Vis Sci. 50 (5), 1978-1987 (2009).
  11. Kobayashi, S., et al. Characterization of cultivated murine lacrimal gland epithelial cells. Mol Vis. 18, 1271-1277 (2012).
  12. Xiao, S., Zhang, Y. Establishment of long-term serum-free culture for lacrimal gland stem cells aiming at lacrimal gland repair. Stem Cell Res Ther. 11 (1), 20(2020).
  13. Bannier-Hélaouët, M., et al. Exploring the human lacrimal gland using organoids and single-cell sequencing. Cell Stem Cell. 28 (7), 1221-1232.e7 (2021).
  14. Bannier-Hélaouët, M., et al. Establishment, maintenance, differentiation, genetic manipulation, and transplantation of mouse and human lacrimal gland organoids. J Vis Exp. (192), e65040(2023).
  15. Chen, H., Huang, P., Zhang, Y. Three-dimensional, serum-free culture system for lacrimal gland stem cells. J Vis Exp. (184), e63585(2022).
  16. Wang, J., Sun, S., Deng, H. Chemical reprogramming for cell fate manipulation: methods, applications, and perspectives. Cell Stem Cell. 30 (9), 1130-1147 (2023).
  17. Rehman, A., et al. Role of small molecules as drug candidates for reprogramming somatic cells into induced pluripotent stem cells: a comprehensive review. Comput Biol Med. 177, 108661(2024).
  18. Zhang, C., et al. Long-term in vitro expansion of epithelial stem cells enabled by pharmacological inhibition of pak1-rock-myosin II and TGF-β signaling. Cell Rep. 25 (3), 598-610.e5 (2018).
  19. An, X., et al. Novel cell culture paradigm prolongs mouse corneal epithelial cell proliferative activity in vitro and in vivo. Front Cell Dev Biol. 9, 675998(2021).
  20. Xu, L., et al. A cocktail of small molecules maintains the stemness and differentiation potential of conjunctival epithelial cells. Ocul Surf. 30, 107-118 (2023).
  21. Zeng, B., et al. Distinctive small molecules blend: promotes lacrimal gland epithelial cell proliferation in vitro and accelerates lacrimal gland injury repair in vivo. Ocul Surf. 34, 283-295 (2024).
  22. Zhou, Q., et al. inhibitor Y-27632 increases the cloning efficiency of limbal stem/progenitor cells by improving their adherence and ROS-scavenging capacity. Tissue Eng Part C Methods. 19 (7), 531-537 (2013).
  23. Reynolds, S. D., et al. Airway progenitor clone formation is enhanced by Y-27632-dependent changes in the transcriptome. Am J Respir Cell Mol Biol. 55 (3), 323-336 (2016).
  24. Bai, H., Gao, Y., Hoyle, D. L., Cheng, T., Wang, Z. Z. Suppression of transforming growth factor-β signaling delays cellular senescence and preserves the function of endothelial cells derived from human pluripotent stem cells. Stem Cells Transl Med. 6 (2), 589-600 (2017).
  25. Natarajan, E., et al. A keratinocyte hypermotility/growth-arrest response involving laminin 5 and p16INK4a activated in wound healing and senescence. Am J Pathol. 168 (6), 1821-1837 (2006).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Kom rki gruczo u zowegohodowla bezsurowiczahodowla kom rkowa 2Dhodowla kom rkowa 3Dhodowla z u yciem ma ych cz steczekekspansja kom rek nab onkowychtworzenie sferoid wmarkery pluripotencjiin ynieria tkankowa
Film wkrótce dostępny
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.