Rozwój i zastosowanie modeli zwierzęcych cukrzycy z udarem niedokrwiennym: łączenie badań podstawowych i translacji klinicznej

Podsumowanie

Niniejszy przegląd podsumowuje najnowsze osiągnięcia w rozwoju i zastosowaniu modeli zwierzęcych cukrzycy z ostrym zawałem mózgu.

Streszczenie

Cukrzyca jest głównym niezależnym czynnikiem ryzyka udaru niedokrwiennego, pogarszając jego nasilenie i pogarszając wyniki pacjentów. Tradycyjne modele udaru, wykorzystujące zdrowe zwierzęta, nie potrafią odtworzyć złożonej patofizjologii cukrzycy, co przyczynia się do słabego sukcesu translacyjnego terapii neuroprotekcyjnych. Niniejszy przegląd podsumowuje metodologie ustalania modeli zwierzęcych cukrzycy z udarem niedokrwiennym, w tym okluzję środkowej tętnicy mózgowej i podejścia zakrzepowo-zatorowe, a także kluczowe kwestie związane z konstrukcją modeli połączonych. Niniejszy przegląd podkreśla oceny fenotypowe dostosowane do współistniejących chorób cukrzycowych. Analizuje również, jak te modele pogłębiają zrozumienie mechanizmów patogennych i skuteczności farmakologicznej. Przeglądamy także obecne ograniczenia metodologiczne i sugerujemy przyszłe kierunki badań. Ogólnie rzecz biorąc, celem było zapewnienie teoretycznych i metodologicznych wskazówek wzmacniających podstawowe i translacyjne badania nad udarem niedokrwiennym związanym z cukrzycą oraz wspieranie rozwoju skuteczniejszych strategii leczenia klinicznego.

Wprowadzenie

Cukrzyca mellitus to dobrze ugruntowany niezależny czynnik ryzyka udaru niedokrwiennego, co znacznie pogarsza wyniki kliniczne i deficyty neurologiczne u pacjentów z udarem. Wzajemne oddziaływanie cukrzycy i udaru niedokrwiennego jest napędzane przez złożone mechanizmy patofizjologiczne, w tym zaburzenia metaboliczne zaburzeń śródbłonka naczyniowego oraz zwiększoną aktywność zapalną, które łącznie pogarszają uszkodzenie mózgu niedokrwiennego i utrudniają powrót do zdrowia (Rysunek 1). Wiele badań epidemiologicznych konsekwentnie wykazało, że pacjenci z cukrzycą mają wyższą częstość udaru niedokrwiennego oraz poważniejsze zaburzenia neurologiczne i gorsze wyniki funkcjonalne w porównaniu z osobami bez cukrzycy ^1,2.

Dla jasności ważne jest, aby określić terminologię używaną w całym tym manuskrypcie. Udar niedokrwienny to nadrzędne schorzenie kliniczne charakteryzujące się ostrą dysfunkcją neurologiczną spowodowaną ogniskową niedokrwieniem mózgu. Stan ten obejmuje dwa główne podtypy patofizjologiczne: udar zakrzepowy, spowodowany miejscowym powstawaniem zakrzepów w tętnicy mózgowej (często w miejscach miażdżycy), oraz udar zatokowy, będący wynikiem zatorowości pochodzących z odległych źródeł, takich jak serce lub naczynia bliższe. Ostry zawał mózgu odnosi się konkretnie do powstałego obszaru martwiczego tkanki mózgu potwierdzonego patologią lub obrazowaniem. W kontekście tego przeglądu udar związany z cukrzycą jest uznawany za udar niedokrwienny występujący u pacjentów z cukrzycą istniejącą wcześniej, gdzie hiperglikemia, dysfunkcja naczyń oraz stan zapalny nasilają urazy i utrudniają powrót do zdrowia.

Mikroalbuminuria, wskaźnik ogólnoustrojowej dysfunkcji śródbłonka, została zidentyfikowana jako niezależny czynnik ryzyka istotnej śródczaszkowej i pozaczaszkowej stenozy tętnic u pacjentów z udarem niedokrwiennym. W ten sposób podkreśla to powikłania naczyniowe związane z cukrzycą, które zwiększają ryzyko niedokrwienności mózgu³. Ponadto powszechne choroby współwystępujące, takie jak nadciśnienie i hiperlipidemia, dodatkowo zwiększają ryzyko udaru niedokrwiennego i jego nasilenia oraz zwiększają prawdopodobieństwo zaburzeń poznawczych po udarze⁴. Obserwacje te podkreślają potrzebę wyjaśnienia odrębnych cech patofizjologicznych udaru niedokrwiennego u pacjentów z cukrzycą, aby ułatwić opracowanie skuteczniejszych strategii terapeutycznych.

Tradycyjne eksperymentalne modele udaru niedokrwiennego wykorzystują głównie zdrowe zwierzęta, co ogranicza ich translacyjną istotność dla udaru niedokrwiennego w cukrzycy. Modele te nie odtwarzają w wystarczającym stopniu zaburzeń metabolicznych, przebudowy naczyń oraz podwyższonego środowiska neurozapalnego charakterystycznego dla cukrzycy. Miażdżyca miażdżycowa mózgu, choroba małych naczyń mózgowych, charakteryzująca się pogrubieniem ściany tętniczkowej i często związana ze starzeniem, nadciśnieniem i cukrzycą, ilustruje patologię naczyniową, która utrudnia udar niedokrwienny u pacjentów z cukrzycą⁵. Miażdżyca mózgu przyczynia się do upośledzenia perfuzji mózgu oraz zwiększonej podatności na uszkodzenia niedokrwienne; Jednak złożona patogeneza i interakcje ze składnikami zespołu metabolicznego pozostają niejasne. Brak modeli zwierzęcych wiernie naśladujących te współistniejące nieprawidłowości naczyniowe ogranicza ocenę strategii neuroprotekcyjnych dostosowanych do udaru niedokrwiennego w cukrzycy. Ponadto neurozapalenie wywołane przez aktywowany mikroglej dodatkowo pogarsza uszkodzenie niedokrwienne i jest różnicowo regulowane w stanach cukrzycowych⁶. Najnowsze badania na modelach cukrzycy na szczurach pokazują, że czynniki obniżające poziom glukozy, takie jak agonisty receptorów peptyd-1 przypominające glukagon oraz inhibitory kotransportera sodowo-glukozowego-2, zapewniają neuroprotekcję nie tylko poprzez zmniejszenie objętości zawału, ale także poprzez modulację aktywacji mikrogleju i zwiększenie przeżycia neuronów⁷. Wyniki te podkreślają potrzebę posiadania modeli udaru niedokrwiennego, które uwzględniają metaboliczne i zapalne cechy cukrzycy, aby dokładniej ocenić skuteczność terapeutyczną i mechanizmy leżące u podstaw.

Biorąc pod uwagę kliniczne i biologiczne złożoności udaru niedokrwiennego związanego z cukrzycą, pilnym priorytetem jest opracowanie udoskonalonych modeli zwierzęcych integrujących zaburzenia metaboliczne, patologię śródbłonka naczyniowego oraz procesy neurozapalne cukrzycy. Modele te dostarczą niezbędnych platform translacyjnych, które połączą mechanistyczne wnioski z zastosowaniami klinicznymi. Ponadto postępy w identyfikacji molekularnych biomarkerów i celów terapeutycznych specyficznych dla udaru cukrzycowego podkreśliły niekodujące RNA, takie jak długie niekodujące RNA, SNHG4 (gen gospodarza małego jądrowego RNA 4), jako potencjalne regulatory postępu choroby i odpowiedzi terapeutycznej⁸. Systematyczna ocena cech fenotypowych, takich jak stenoza naczyniowa, objętość zawału, deficyty neurologiczne oraz wyniki poznawcze, jest niezbędna do ustalenia wiarygodności i użyteczności badawczej tych modeli. W tym przeglądzie modele są nie tylko podsumowane, ale przedstawiono także analizę porównawczą ich wykonalności technicznej, wskaźników sukcesu i ograniczeń. Celem jest zaoferowanie badaczom praktycznych ram do wyboru najbardziej odpowiedniego modelu złożonego na podstawie ich konkretnych celów eksperymentalnych i dostępnych zasobów.

Protokół

Ustanowienie i wybór modeli cukrzycy

Cukrzyca typu 1 (T1DM): model wywołany streptozotocyną
Streptozotocyna jest szeroko stosowanym środkiem chemicznym indukującym T1DM u zwierząt ze względu na selektywną cytotoksyczność wobec β-komórek trzustki⁹. Po wejściu do komórek β za pomocą transportera glukozy 2, Streptozotocyna indukuje alkilację i fragmentację DNA, prowadząc do śmierci β komórek i późniejszego niedoboru insuliny. Proces ten skutecznie odzwierciedla charakterystyczną patofizjologię T1DM, która charakteryzuje się absolutnym niedoborem insuliny. Niszczenie komórek β wywołane przez streptozotocynę powoduje hiperglikemię i związane z nią zaburzenia metaboliczne podobne do tych obserwowanych u ludzkiego T1DM¹⁰. Dzięki szybkiemu i niezawodnemu wywołaniu cukrzycy u gryzoni, model streptozotocyny jest szeroko stosowany w badaniach dotyczących mechanizmów chorób i interwencji terapeutycznych¹¹. Jednak cukrzyca wywołana paciorkowcem wywołana streptozotocyną odzwierciedla przede wszystkim niedobór insuliny i nie obejmuje autoimmunologicznych składników ludzkiego T1DM, co ogranicza jej zdolność do reprezentowania pełnego spektrum choroby.

Indukcja T1DM przy użyciu streptozotocyny wymaga starannej optymalizacji protokołów dawkowania i podawania, aby zrównoważyć stabilność modelu z przeżywalnością zwierząt. Powszechnie stosuje się dwa główne podejścia: pojedynczy zastrzyk wysokiej dawki oraz wiele zastrzyków niskich dawek. Pojedyncza wysoka dawka (zazwyczaj 50–65 mg/kg dootrzewnowkowo) powoduje szybkie i niemal całkowite zniszczenie β-komórek, powodując ciężką hiperglikemię w ciągu¹⁰ dni. Chociaż metoda ta jest skuteczna i wysoce powtarzalna, wiąże się ze zwiększoną śmiertelnością i większą toksycznością poza celem. Alternatywnie, wielokrotne zastrzyki w niskich dawkach (np. 40 mg/kg dziennie przez pięć kolejnych dni) powodują stopniowe uszkodzenie β komórek. Ważne jest, aby zauważyć, że to stopniowe niszczenie może być połączone z pewnym zapalnym przeniknięciem, ale nie oddaje autoimmunologicznej etiologii T1DM u ludzi¹². Takie podejście zmniejsza śmiertelność i lepiej modeluje cechy zapalne choroby; Jednak konieczne jest długotrwałe monitorowanie i może występować zmienność w początkowości i nasileniu cukrzycy. Wybór odpowiedniego protokołu zależy od celu eksperymentalnego, przy czym preferowany jest schemat modelu wysokich dawek dostosowany do szybkiego wywołania cukrzycy oraz schemat niskodawkowy preferowany w badaniach z mechanizmami immunologiologicznymi^13,14.

Model T1DM wywołany streptozotocyną oferuje kilka zalet, w tym szybkie i stosunkowo stabilne wywołanie cukrzycy z niedoborem insuliny, opłacalność oraz łatwość stosowania u gryzoni. Te cechy sprawiają, że jest szczególnie odpowiedni do badania utraty β komórek, hiperglikemii oraz powikłań cukrzycy związanych z niedoborem insuliny. Jednak model ten nie posiada kluczowych cech T1DM u ludzi, takich jak autoimmunologiczne niszczenie β komórek czy obecność insulinooporności. W konsekwencji model streptozotocyny nie oddaje w pełni złożonej immunopatogenezy T1DM. Brak insulinooporności dodatkowo ogranicza zastosowanie w badaniach wymagających tego składnika. Co więcej, toksyczność streptozotocyny może wpływać na inne narządy, potencjalnie zakłócając wyniki eksperymentów. Dlatego, chociaż model z paciorkowcem pozostaje fundamentem badań nad T1DM, ograniczenia podkreślają konieczność komplementarnego stosowania modeli genetycznych lub autoimmunologicznych, takich jak mysz cukrzycowa bez otyłości, do badania mechanizmów odpornościowych i postępu choroby ^9,15.

Cukrzyca typu 2 (T2DM)
Modele T2DM wywołane dietą są przede wszystkim budowane przez karmienie gryzoni dietą wysokotłuszczową i wysokocukrową, która sprzyja otyłości, insulinooporności i zaburzeniom metabolizmu, naśladując tym samym wczesne stadium T2DM u ludzi¹⁶. Modele te odtwarzają kaskadę patofizjologiczną, zaczynającą się od insulinooporności obwodowej, następnie kompensacyjnej hiperinsulinemii i ostatecznie dysfunkcji β-komórek. Interwencje dietetyczne prowadzą także do zwiększonej tłuszczowości, przewlekłego, niskiego stopnia zapalenia oraz zmienionego metabolizmu lipidów, co wszystko przyczynia się do zaburzeń homeostazy glukozy. Modele te są szczególnie cenne do badania czynników środowiskowych i stylu życia przyczyniających się do T2DM oraz do oceny interwencji ukierunkowanych na insulinooporność i zespół metaboliczny. Jednak początek i nasilenie cukrzycy mogą się różnić w zależności od składu diety, czasu trwania i szczepu zwierzęcia, co wymaga starannej optymalizacji protokołu. Modele żywieniowe ułatwiają również badanie wzajemnego oddziaływania między zapaleniem wywołanym otyłością a niewydolnością komórek β, dostarczając wglądu w postęp choroby¹⁷. Chociaż model wywołany dietą jest doskonały do badania insulinooporności i skutków interwencji stylu życia, słabo nadaje się do badania zaawansowanych powikłań cukrzycy, takich jak ciężka nefropatia czy zaawansowane zwapnienie naczyniowe, które lepiej modelować za pomocą modeli genetycznych lub połączonych.

Modele genetyczne T2DM, takie jak myszy db/db oraz ob/ob, zawierają mutacje wywołujące otyłość i insulinooporność, skutecznie modelując kluczowe aspekty patofizjologii T2DM u ludzi¹⁸. Myszy ob/ob mają mutację w genie leptyny, co skutkuje niedoborem leptyny, natomiast myszy db/db mają mutację w genie receptora leptynowego, powodującą oporność na leptynę. W obu modelach myszy mają hiperfagię, ciężką otyłość, nadglikemię, hiperinsulinemię oraz postępującą niewydolność β komórek. Te modyfikacje genetyczne powodują głęboką insulinooporność i zaburzenia metaboliczne, co czyni te modele cennymi do badania genetycznych i molekularnych mechanizmów leżących u podstaw T2DM i powiązanych powikłań. Jednak monogeniczny charakter tych mutacji ogranicza ich zdolność do reprezentowania poligenicznej i wieloczynnikowej etiologii T2DM u ludzi. Dodatkowo, szybkie pojawienie się cukrzycy i ciężka otyłość w tych modelach mogą nie odzwierciedlać heterogeniczności obserwowanej u ludzi. Pomimo tych ograniczeń, myszy db/db oraz ob/ob są szeroko stosowane w badaniach przedklinicznych i rozwoju leków¹⁹.

Połączenie indukcji diety i podawania streptozotocyny w niskiej dawce stanowi model hybrydowy, zaprojektowany tak, by odtworzyć postęp T2DM, od insulinooporności do dysfunkcji β-komórek i niewydolności²⁰. Zwierzęta początkowo karmione są dietą wysokotłuszczową, aby wywołać otyłość i insulinooporność, naśladując wczesne zaburzenia metaboliczne wywołane przez T2DM. Następnie podawane są niskie dawki streptozotocyny, aby wywołać łagodne uszkodzenie β komórek, symulując spadek funkcji β komórek występujący w późniejszych stadiach choroby. Takie podejście prowadzi do fenotypu charakteryzującego się hiperglikemią, zaburzoną sekrecją insuliny oraz utrzymującą się insulinoopornością, która bardzo przypomina postęp T2DM u ludzi. Model ten został z powodzeniem zastosowany u myszy i szczurów, zapewniając solidną podstawę do badania powikłań cukrzycy, takich jak kardiomiopatia i nefropatia. Ułatwia również ocenę interwencji terapeutycznych ukierunkowanych na insulinooporność oraz zachowanie β komórek. Jednak osiągnięcie spójnych wyników wymaga precyzyjnego dawkowania i wyczucia czasu, a reakcje mogą się różnić w zależności od szczepu zwierzęcego i protokołu eksperymentalnego²¹.

Wybór odpowiedniego zwierzęcego modelu T2DM wymaga dokładnej oceny cech metabolicznych, patologii trzustki oraz powikłań naczyniowych, aby zapewnić zgodność z konkretnymi celami badania. Modele wywołane dietą skutecznie odwzorowują insulinooporność i zespół metaboliczny związany z otyłością, ale mogą powodować nieregularną niewydolność β komórek i mieć ograniczone zaawansowane komplikacje. Modele genetyczne, takie jak myszy db/db oraz ob/ob, dostarczają dobrze scharakteryzowanych fenotypów otyłości i insulinooporności z postępującą dysfunkcją β-komórek, choć monogeniczność ogranicza uogólnienie. Model diety połączonej z niskimi dawkami streptozotocyny oferuje pełniejszą reprezentację progresji T2DM, w tym utratę β komórek i powikłań naczyniowych, co czyni go odpowiednim do badań zaawansowanych chorób oraz interwencji terapeutycznych. Badacze muszą uwzględnić takie czynniki jak początek, nasilenie, powtarzalność oraz znaczenie dla patofizjologii choroby u ludzi, a także różnice w szczepach i odpowiedziach specyficznych dla płci, które mogą wpływać na wyniki modeli. Dla znaczenia translacyjnego preferowane są modele integrujące aspekty metaboliczne i naczyniowe T2DM, w tym nefropatię i kardiomiopatię. Ostatecznie wybór modelu powinien być kierowany konkretnymi pytaniami mechanistycznymi lub terapeutycznymi, które są zadawane, równoważąc złożoność eksperymentu z praktyczną wykonalnością 17,20,22 (Rysunek 2, Tabela 1).

Ustanowienie i adaptacja modeli udaru niedokrwiennego

Trwałe i przejściowe modele okluzji środkowej arterii mózgowej (MCAO)
Metoda okluzji filamentu, powszechnie nazywana techniką szwu śródświatłowego, jest szeroko stosowanym eksperymentalnym podejściem indukującym ogniskową niedokrwienie mózgu poprzez zatkanie środkowej tętnicy mózgowej (MCA) w modelach zwierzęcych, szczególnie u gryzoni²³. Technika ta polega na wprowadzeniu nylonowego szwu monofilamentowego przez tętnicę szyjną zewnętrzną do tętnicy szyjnej wewnętrznej i przesunięciu go, aby zablokować źródło MCA, co symuluje miejscową niedokrwienie mózgu, jak u ludzi z udarem niedokrwiennym. Zabieg może skutkować trwałym lub przejściowym zatkaniem, w zależności od tego, czy filament pozostaje na miejscu, czy jest wyciągany po określonym okresie niedokrwienia, aby umożliwić reperfuzję²⁴. Model jest ceniony ze względu na minimalnie inwazyjny charakter, powtarzalność i znaczenie kliniczne, ponieważ zatkanie MCA jest najczęstszą przyczyną udaru niedokrwiennego u ludzi. Skuteczność modelu można potwierdzić poprzez monitorowanie zmniejszenia przepływu krwi w mózgu za pomocą obrazowania Dopplera oraz ocenę po zabiegu deficytów neurologicznych i rozmiaru zawału. Zmiany średnicy włókna, głębokości włożenia oraz czasu trwania zgryzania umożliwiają dostosowanie nasilenia niedokrwiennego uszkodzenia oraz badanie różnych mechanizmów patofizjologicznych i interwencji terapeutycznych. Model ten odegrał kluczową rolę w wyjaśnieniu patofizjologii udaru oraz w ocenie środków neuroprotekcyjnych²⁵.

Zastosowanie modelu MCAO u zwierząt z cukrzycą wiąże się z wieloma wyzwaniami chirurgicznymi ze względu na ogólnoustrojowe zmiany naczyniowe związane z cukrzycą. Cukrzyca powoduje kruchość naczyń, dysfunkcję śródbłonka oraz mikroangiopatię, co obniża integralność naczyń i zdolność gojenia²⁶. Te zmiany patologiczne komplikują delikatne manipulacje naczyniowe wymagane do wprowadzenia i usunięcia filamentu, zwiększając tym samym ryzyko powikłań krwotocznych i śmiertelności śródoperacyjnej. Ponadto zwierzęta z cukrzycą często wykazują zaburzone reakcje fizjologiczne, takie jak zmieniona regulacja ciśnienia krwi i opóźnione gojenie się ran, co może nasilać chorobliwość okołooperacyjną. Ich zwiększona podatność na uszkodzenia spowodowane reperfuzją niedokrwieniem oraz stres oksydacyjny dodatkowo komplikuje interpretację wyników eksperymentalnych. W konsekwencji wskaźniki śmiertelności w modelach MCAO u zwierząt z cukrzycą są wyższe niż u ich odpowiedników bez cukrzycy, co ogranicza moc statystyczną i znaczenie translacyjne²⁷. Rozwiązanie tych wyzwań wymaga skrupulatnego dopracowywania technik chirurgicznych, w tym delikatnego obsłużenia naczynia, precyzyjnego wyboru filamentów oraz starannego monitorowania parametrów fizjologicznych. Strategie okołooperacyjne, w tym przedoperacyjna kontrola glikemii, zoptymalizowane protokoły znieczulenia oraz pooperacyjna opieka wspomagająca, są również kluczowe dla poprawy przeżycia i zapewnienia spójności modelu u zwierząt z cukrzycą²⁸.

Wprowadzono kilka postępów metodologicznych, aby sprostać tym wyzwaniom. Ulepszenia w materiałach filamentowych, takich jak monofilamenty pokryte silikonem o zoptymalizowanych średnicach i kształtach końcówek, ułatwiły płynniejsze wprowadzanie i zmniejszały liczbę uszkodzeń naczyń²⁹. Te modyfikacje umożliwiają bardziej spójne zatyranie przy minimalnym uszkodzeniu śródbłonka, co jest szczególnie istotne ze względu na delikatne naczynia u zwierząt z cukrzycą. Techniki chirurgiczne zostały udoskonalone, aby zachować gałęzie tętnic i zminimalizować urazy. Na przykład metody zapobiegające podwiązaniu tętnicy szyjnej zewnętrznej oraz naprawa nacięcia wspólnej tętnicy szyjnej pomagają utrzymać przepływ krwi bocznej i zmniejszyć zmienność niedokrwienia³⁰. Przedoperacyjne leczenie, kładące nacisk na ścisłą kontrolę glikemii, łagodzi dysfunkcje naczyń wywołane przez hiperglikemię oraz stres oksydacyjny, poprawiając tym samym wyniki operacji i zmniejszając śmiertelność. Protokoły opieki pooperacyjnej, w tym utrzymanie normotermii, odpowiednie nawodnienie, analgezja oraz monitorowanie deficytów neurologicznych, dodatkowo zwiększają stabilność modelu. W niektórych badaniach stosowane są środki neuroproteczne, takie jak przeciwutleniacze (np. edaravon), aby łagodzić uszkodzenie niedokrwienne w modelach cukrzycy³¹. Łącznie te ulepszenia przyczyniają się do ustanowienia stabilnych i powtarzalnych modeli MCAO u zwierząt z cukrzycą, ułatwiając badania translacyjne, które dokładniej odzwierciedlają złożoność kliniczną pacjentów z udarem niedokrwiennym^30,31.

Modele zakrzepowe
Fotochemiczna indukcja to eksperymentalne podejście do wywołania ogniskowego niedokrwienia mózgu poprzez wywołanie miejscowej zakrzepicy poprzez aktywację barwników światłoczułych, takich jak Rose Bengal, przy użyciu ukierunkowanego oświetlenia laserowego³². Po systemowym podaniu leku fotoczułego, oświetlenie określonych naczyń mózgowych skoncentrowaną wiązką laserową wytwarza reaktywne odmiany tlenu, które uszkadzają śródbłonek, wywołując agregację płytek krwi i powstawanie zakrzepów w miejscu napromieniowania. Metoda ta umożliwia precyzyjną kontrolę przestrzenną i czasową powstawania zakrzepu, ułatwiając badanie mechanizmów udaru zakrzepowego oraz ocenę interwencji terapeutycznych. Model fotochemiczny odtwarza kluczowe cechy udaru zakrzepowego u ludzi, w szczególności uszkodzenie śródbłonka i powstawanie skrzepów in situ, które są istotne dla ludzi z udarem niedokrwiennym wywołanym zakrzepicą³³. Co więcej, technika ta jest minimalnie inwazyjna i stosowalna u różnych gatunków zwierząt. W kontekście cukrzycy, gdzie powszechna jest nadmierna krzepliwość i dysfunkcja śródbłonka, modele fotochemiczne stanowią cenną platformę do badania wzajemnych zaburzeń metabolicznych i zakrzepicy. Jednak poleganie tego modelu na egzogennych fotosensytyzatoryzach i sprzęcie laserowym wymagającym wiedzy technicznej ogranicza szerokie zastosowanie³⁴.

Embolizacja mikrosfery polega na wstrzykiwaniu mikrosfer o określonym rozmiarze dożylnym lub tętniczym, aby mechanicznie zatkać naczynia mózgowe, co wywołuje wieloogniskową emboliczną niedokrwienie mózgu³⁵. Model ten jest cennym narzędziem do badania mechanizmów udaru zatorowego, szczególnie skutków wielu mikrozawałów dystalnych. Rozmiar i liczbę mikrosfer można precyzyjnie kontrolować, aby generować różne stopnie uszkodzenia niedokrwiennego i rozmieszczenie zawału. To podejście jest korzystne do badania powstawania zbolu, okluzji naczyniowej oraz kaskad niedokrwiennych w dalszej części rzeki³⁶. U zwierząt z cukrzycą, które często mają nadkrzepliwość i zwiększone ryzyko zatoru, model embolizacji mikrosfery jest szczególnie istotny do badania współzależności między zaburzeniami metabolicznymi a ryzykiem udaru zatorowościowego. Ponadto model ten ułatwia ocenę terapii przeciwzakrzepowych i trombotycznych w kontrolowanych warunkach zatorowych. Jednak model mikrosfery nie posiada biologicznej złożoności tworzenia i rozpuszczania zakrzepów, jaką obserwuje się u ludzi z udarem, ponieważ zatory są zakrzepami obojętnymi, a nie biologicznie aktywnymi³⁷.

Zastosowanie modeli zakrzepowo-zatorowych u zwierząt z cukrzycą stanowi szczególne wyzwania. Istniejący stan nadkrzepliwości i dysfunkcja śródbłonka mogą prowadzić do przesadnego i nieprzewidywalnego powstawania zakrzepców, co może powodować większe niż oczekiwano zawały lub zwiększać ryzyko przemiany krwotocznej. W przypadku zakrzepicy wywołanej fotochemią może być konieczne stopniowe dawkowanie Rose Bengal u zwierząt cukrzycowych z powodu zmienionego wiązania albuminy lub klirencji nerek. Ponadto wymagania techniczne precyzyjnego celowania laserowego są powiększone przez zwiększoną kruchość naczyń oponowych u zwierząt z cukrzycą³⁸. Czynniki te muszą być starannie brane pod uwagę przy projektowaniu eksperymentów.

Modele zakrzepowe zatorowe, w tym indukcja fotochemiczna i embolizacja mikrosfery, oferują wyraźne zalety w odwzorowaniu złożonej patofizjologii udaru zakrzepowego u ludzi, szczególnie w kontekście hiperkrzepliwości związanej z cukrzycą. W przeciwieństwie do modeli mechanicznego zatkania, które głównie symulują blokadę naczyń, modele zakrzepowe uwzględniają procesy dynamiczne, takie jak zakrzepica, zatorowość czy uszkodzenia naczyń, które dokładniej odzwierciedlają mechanizmy udaru niedokrwiennego u pacjentów z cukrzycą³⁹. Modele te umożliwiają badanie dysfunkcji śródbłonka, aktywacji płytek krwi, nieprawidłowości kaskadowych krzepów oraz reakcji zapalnych nasilających się przez cukrzycę. Ponadto stanowią platformy do oceny skuteczności i bezpieczeństwa terapii przeciwzakrzepkowych oraz do badania mechanizmów powstawania i ustępowania zakrzepów w środowisku hiperkoagulowalnym. Biorąc pod uwagę, że cukrzyca charakteryzuje się zwiększonym ryzykiem zakrzepowym, wywołanym przez zwiększoną reaktywność płytek, podwyższone współczynniki krzepnięcia oraz zaburzenia fibrynolizy, modele zakrzepowe są szczególnie odpowiednie do badania mechanizmów udaru oraz interwencji terapeutycznych dostosowanych do schorzeń cukrzycowych. Ponadto ich zdolność do reprodukcji zawałów wieloogniskowych i heterogenicznych jest zgodna z objawami klinicznymi u pacjentów z cukrzycą i udarem, co zwiększa znaczenie translacyjne⁴⁰ (Rysunek 3).

Kluczowe kwestie przy tworzeniu modeli kompozytowych

Sekwencja modelowania
Sekwencja czasowa użyta do ustanowienia złożonych modeli zwierzęcych cukrzycy połączonej z udarem niedokrwiennym jest kluczowa, ponieważ odzwierciedla odrębne scenariusze kliniczne i cele badawcze⁴¹. Jednym z powszechnie stosowanych podejść jest wywołanie cukrzycy przed udarem niedokrwiennym, co odzwierciedla stan kliniczny, w którym cukrzyca jest długotrwałym czynnikiem ryzyka predysponującym pacjentów do udaru niedokrwiennego. Ta sekwencja umożliwia badanie, jak przewlekła hiperglikemia i zaburzenia metaboliczne wpływają na patofizjologię udaru niedokrwiennego, w tym zmiany w integralności naczyń, aktywacji zapalnej oraz podatności neuronów⁴². Dowody wskazują, że przewlekła cukrzyca pogarsza niedokrwienne uszkodzenie mózgu i pogarsza wyniki neurologiczne, podkreślając znaczenie modelowania cukrzycy przed udarem, aby uchwycić te patologiczne interakcje⁴³. Z kolei wywołanie udaru niedokrwiennego przed cukrzycą służy jako model do badania nieprawidłowości metabolicznych pojawiających się w wyniku niedokrwienia mózgu. To podejście jest cenne w wyjaśnianiu mechanizmów leżących u podstaw hiperglikemii i insulinooporności po udarze niedokrwiennym, które są znane z wpływu na trajektorie powrotu do zdrowia i ryzyko nawrotu⁴⁴. Naukowe uzasadnienie wyboru jednej sekwencji zależy od konkretnego obszaru badań; Istniejące modele cukrzycy nadają się do badania cukrzycy jako czynnika ryzyka i modyfikatora patologii udaru, natomiast modele indukcji cukrzycy po udarze niedokrwiennym są odpowiednie do badania wtórnych zaburzeń metabolicznych. Ponadto niektóre badania stosowały jednoczesne lub nakładające się strategie indukcji, aby uchwycić bardziej złożone interakcje patofizjologiczne⁴⁵. Ogólnie rzecz biorąc, zastosowanie każdej sekwencji zależy od mechanizmów patologicznych i celów translacyjnych, co podkreśla konieczność dopasowania projektu modelu do klinicznie istotnych scenariuszy i hipotez mechanistycznych⁴⁶.

Nasilenie i czas trwania cukrzycy
Nasilenie cukrzycy, charakteryzujące się stopniem hiperglikemii i insulinooporności, oraz czas trwania cukrzycy przed indukcją udaru niedokrwiennego głęboko wpływają na wyniki niedokrwienności mózgu w modelach złożonych ⁴⁷. Podwyższony poziom glukozy we krwi i insulinooporność wiązały się z większą objętością zawału, podwyższonym stresem oksydacyjnym oraz osłabioną integralnością jednostek nerwowo-naczyniowych po uszkodzeniu niedokrwiennym⁴⁸. Długoterminowe modele cukrzycy, zazwyczaj ustalone przez przewlekłą ekspozycję na streptozotocynę lub genetyczną predyspozycję, charakteryzują się bardziej wyraźnymi cechami patologicznymi, takimi jak dysfunkcja śródbłonka, zwiększone odpowiedzi zapalne i słabsze powrót do zdrowia funkcjonalnego niż krótkotrwałe lub ostre modele hiperglikemii⁴⁹. Klinicznie wydłużony czas trwania cukrzycy koreluje z wyższymi wskaźnikami nawrotów udaru i śmiertelności, co podkreśla znaczenie włączenia przewlekłości cukrzycy do modeli zwierzęcych w celu zwiększenia znaczenia translacyjnego⁵⁰. Ponadto wykazano, że markery kontroli metabolicznej, takie jak poziom hemoglobiny A1c, wpływają na rokowanie udaru niedokrwiennego, sugerując, że modele reprezentujące różne stany kontrolne glikemii mogą dostarczać istotnych informacji o oknach terapeutycznych i strategiach interwencji⁵¹. Co istotne, czas trwania hiperglikemii bezpośrednio wpływa na wyniki operacji. Przewlekła hiperglikemia (>4 tygodnie u gryzoni) powoduje znaczne pogrubienie błony podstawnej naczynia oraz dysfunkcję śródbłonka, przez co delikatne naczynia są bardziej podatne na pęknięcia podczas wszczepienia filamentu w operacjach wykonywanych na modelu MCAO, co zwiększa śmiertelność^52,53. Dlatego zaleca się, aby badacze wyraźnie raportowali czas trwania i stabilność stanu cukrzycy (np. za pomocą seryjnego monitorowania poziomu glukozy we krwi) jako kluczowe zmienne dla powtarzalności oraz uwzględniania zmienności objętości zawału. Na podstawie syntezy literatury, zaleca się ustanowienie stabilnego tła T2DM przed wywołaniem udaru niedokrwiennego w badaniach nad cukrzycą jako czynnikiem ryzyka. Typowy protokół obejmuje osiem tygodni diety wysokotłuszczowej, po których następuje niska dawka streptozotocyny (35 mg/kg)^54,55. Wywołanie udaru (np. przejściowe MCAO) powinno być przeprowadzone cztery tygodnie po zastosowaniu streptozotocyny, gdy nadglikemia (glukoza na czo >16,7 mmol/L) jest stabilna. Z naszego doświadczenia wynika, że ta sekwencja daje spójny model złożony z przeżywalnością chirurgiczną na poziomie około 65%–70% u szczurów z cukrzycą, w porównaniu do >85% u grupy^{kontrolnej 56}. Dlatego wybór parametrów określających nasilenie i czas trwania cukrzycy musi uwzględniać ich istotne efekty modulacyjne na niedokrwienne uszkodzenia mózgu i ich powrót do zdrowia, umożliwiając badanie mechanizmów patofizjologicznych oraz ocenę skuteczności terapeutycznej w kontekstach naśladujących heterogeniczność kliniczną.

Czynniki płciowe i wiekowe
Uwzględnienie zmiennych płci i wieku w złożonych modelach zwierzęcych cukrzycy i udaru jest niezbędne dla zwiększenia ich klinicznej istotności, ponieważ te czynniki istotnie wpływają na patofizjologię chorób i wyniki^57,58. Starzenie się jest głównym czynnikiem ryzyka cukrzycy i udaru, a starsze modele zwierzęce dokładniej oddają schorzenia nerwowo-naczyniowe i metaboliczne obserwowane u starszych pacjentów, którzy stanowią większość osób z udarem niedokrwiennym⁵⁹. Zmiany związane z wiekiem, takie jak zaburzony metabolizm glukozy, zwiększony stres oksydacyjny oraz zmienione odpowiedzi immunologiczne, mogą wpływać na nasilenie udaru niedokrwiennego i rekonwalescencję, co wymaga użycia starszych zwierząt do wychwycenia tych efektów⁶⁰. Różnice płciowe również odgrywają kluczową rolę, ponieważ hormony płciowe modulują wrażliwość na insulinę, szlaki zapalne oraz neuroprotekcję. Na przykład estrogen moduluje metabolizm glukozy i zapewnia częściową ochronę przed uszkodzeniem niedokrwiennym, podkreślając znaczenie uwzględniania samców i samic w celu wyjaśnienia mechanizmów specyficznych dla płci⁶¹. Eksperymentalne projekty uwzględniające płeć i wiek ułatwiają identyfikację różnicowych odpowiedzi na niedokrwienie i cukrzycę, poprawiając tym samym interpretowalność i translacyjną istotność wyników. Zaleca się strategie, takie jak analizy stratyfikacyjne oraz zrównoważone uwzględnienie obu płci w różnych grupach wiekowych, aby zminimalizować zakłócenia i lepiej poinformować spersonalizowane podejścia terapeutyczne. Ogólnie rzecz biorąc, uwzględnienie płci i wieku przy budowie modeli jest kluczowe, aby zniwelować lukę między badaniami przedklinicznymi a tłumaczeniem klinicznym (Rysunek 4).

Wyniki

Podsumowując, opracowanie modeli zwierzęcych wiernie odzwierciedlających cukrzycę, równoległą udarowi niedokrwiennemu, jest kluczowe dla lepszego zrozumienia złożonej interakcji między zaburzeniami metabolicznymi, dysfunkcją β-komórek, powikłaniami naczyniowymi a uszkodzeniem niedokrwiennym mózgu. Z perspektywy eksperta, konstrukcja tych modeli złożonych wymaga starannego, naukowo ugruntowanego podejścia, które uwzględnia czasową sekwencję indukcji choroby, precyzyjną modulację nasilenia cukrzycy oraz uwzględnienie kluczowych zmiennych biologicznych, takich jak płeć i wiek. Ta kompleksowa strategia modelowania zwiększa znaczenie kliniczne i potencjał translacyjny wyników przedklinicznych, odpowiadając tym samym na utrzymujące się wyzwania w badaniach nad udarem niedokrwiennym i cukrzycą.

Biorąc pod uwagę heterogeniczność opublikowanych podejść, żaden pojedynczy model nie oddał w pełni wieloaspektowej patofizjologii u pacjentów z cukrzycą i ostrym udarem niedokrwiennym. Dlatego niezbędne jest połączenie modeli dostosowanych do konkretnych celów badawczych, od mechanistycznych badań nad uszkodzeniami naczyń cukrzycowych po oceny skuteczności terapeutycznej. Przeanalizowane dowody podkreślają wyjątkową wartość tych modeli złożonych w wyjaśnianiu mechanizmów, dzięki którym cukrzyca pogarsza patologię udaru niedokrwiennego, w tym dysfunkcję śródbłonka, stan zapalny oraz zaburzenia naprawy układu nerwowo-naczyniowego. Ponadto modele te są niezbędnymi platformami do oceny nowych środków neuroprotekcyjnych, co przyspiesza identyfikację i walidację skutecznych terapii.

Badacze muszą priorytetowo traktować standaryzację protokołów budowy modeli, aby zapewnić powtarzalność i porównywalność w różnych laboratoriach. Szczególnie istotne jest opracowanie modeli zwierzęcych odwzorujących kliniczne realia starzejącej się populacji z T2DM, biorąc pod uwagę trendy demograficzne oraz podwyższone ryzyko udaru niedokrwiennego u starszych pacjentów. Integracja podejść multiomicznych, takich jak genomika, proteomika i metabolomika, w tych modelach stwarza znaczący potencjał do identyfikacji biomarkerów specyficznych dla chorób współistniejących oraz celów terapeutycznych. Te integracyjne strategie pomogą zbliżyć badania podstawowe do zastosowań klinicznych, ułatwiając przekładanie eksperymentalnych wniosków na strategie medycyny spersonalizowanej.

Podsumowując, dalsze udoskonalanie i stosowanie złożonych modeli zwierzęcych z cukrzycy i udaru stanowi fundament rozwoju mechanistycznych odkryć i innowacji terapeutycznych. Poprzez harmonizację różnorodnych metodologii badawczych i wykorzystanie postępu technologicznego, badacze mogą skuteczniej odpowiadać na palące wyzwania kliniczne wynikające z połączenia cukrzycy i udaru niedokrwiennego, co ostatecznie poprawia wyniki leczenia pacjentów (Rysunek 5).

Zaleca się, aby dla badaczy nowych w tej dziedzinie rozpoczęcie od modelu diety wysokotłuszczowej i niskiej dawki strepttototocyny, połączonego z przejściowym MCAO, zapewniło najlepszy balans między istotnością patofizjologiczną a techniczną wykonalnością. Z kolei stosowanie zakrzepicy wywołanej fotochemią u zwierząt z cukrzycą nie jest zalecane bez wcześniejszego doświadczenia, ze względu na zwiększone ryzyko zmiennej wielkości zawału i powikłań chirurgicznych.

Rysunek 1. Mechanizmy patofizjologiczne udaru niedokrwiennego nasilonego przez cukrzycę. Schemat ilustruje kluczowe ścieżki, przez które cukrzyca wzmacnia uszkodzenie niedokrwienne mózgu. Panel A przedstawia zaburzenia metaboliczne (hiperglikemię i insulinooporność), prowadzące do stresu oksydacyjnego i dysfunkcji mitochondriów. Panel B pokazuje dysfunkcję śródbłonka naczyniowego, zaburzoną integralność BBB oraz pogrubienie błony podstawnej. Panel C podkreśla zwiększoną odpowiedź neurozapalną, przy czym aktywowany mikroglej (Iba-1+) uwalnia prozapalne cytokiny (IL-1β, TNF-α). Skróty: BBB, bariera krew–mózg; ROS, reaktywne składniki tlenu. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.

Rysunek 2. Ustanowienie modeli zwierzęcych cukrzycy: T1DM i T2DM. Popularne metody indukowania T1DM i T2DM u gryzoni. Lewy panel: protokoły podawania streptozotocyny w leczeniu T1DM. Prawy panel: modele dietetyczne, genetyczne (db/db, ob/ob) oraz połączone (dieta wysokotłuszczowa + niskie dawki streptozotocyny) dla T2DM. Wymienione są kluczowe cechy i ograniczenia każdego modelu. Skróty: T1DM, cukrzyca typu 1; Cukrzyca typu 2, cukrzyca typu 2. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.

Rysunek 3. Modele chirurgiczne i zakrzepowe udaru niedokrwiennego. Główne modele udaru niedokrwiennego dostosowane do zwierząt z cukrzycą. O: Okluzja środkowej tętnicy mózgowej oparta na włóknach (MCAO) dla niedokrwienia trwałego lub przejściowego. B: Model zakrzepowo-zatorowy z użyciem Rose Bengal i oświetlenia laserowego do wywołania miejscowej zakrzepicy. C: Model embolizacji mikrosfery powodujący wieloogniskowe zawały. Uwzględniono kwestie techniczne dotyczące naczyń cukrzycowych. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.

Rysunek 4. Konstrukcja kompozytowych modeli zwierzęcych cukrzycy i udaru niedokrwiennego. Kluczowe zmienne, które należy wziąć pod uwagę przy łączeniu modeli cukrzycy i udaru: sekwencja czasowa (najpierw cukrzyca vs. udar niedokrwienny), nasilenie i czas trwania cukrzycy oraz zmienne biologiczne (wiek i płeć). Współdziałanie tych czynników decyduje o klinicznej istotności i translacyjnej użyteczności modelu złożonego. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.

Rysunek 5. Ocena fenotypowa i translacyjne zastosowania modeli cukrzycy i udaru niedokrwiennego. Kluczowe miary wyników dla oceny modeli cukrzycy i udaru, w tym objętość zawału, deficyty neurologiczne, funkcje poznawcze, patologia naczyniowa oraz markery zapalne. Wyróżnione są również zastosowania translacyjne, takie jak badania leków, odkrywanie biomarkerów i badania mechanizmów, które umożliwiają te modele. Skróty: MRI, obrazowanie rezonansem magnetycznym; mNSS, zmodyfikowany wskaźnik nasilenia nerwowego; SNHG4, gen gospodarza małego jądrowego RNA 4; HbA1c, hemoglobina A1c. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.

Cel badawczy	Zalecany model cukrzycy	Zalecany model pociągnięcia	Kluczowe zalety tego celu	Krytyczne ograniczenia / Uwagi
Badania przesiewowe neuroprotekcyjne	Dieta+STZ (T2DM)	Tymczasowe MCAO (tMCAO)	Naśladuje typowe profile pacjentów z T2DM; Reperfuzja umożliwia ukierunkowane badania środków neuroprotekcyjnych	Wysoka śmiertelność u szczurów z cukrzycą; wymaga precyzyjnego, doświadczonego wykonania chirurgicznego
Zakrzepica / Antypłytkowa	Genetyczne (db/db)	Fotozakrzepica	Powtarza stan cukrzycowy nadkrzeźbiony; Miejscowa zakrzepica modeluje zdarzenia pęknięć blaszek	Ustawianie laserów wymaga zaawansowanych umiejętności technicznych; Skład skrzepów różni się od patologii człowieka
Stan zapalny / mikroglej	STZ (T1DM)	Stały MCAO (pMCAO)	Ciężka hiperglikemia wywołuje przesadną reakcję zapalną; brak reperfuzji eliminuje zmienne zakłócające	Nie replikuje insulinooporności, co jest kluczową cechą u większości pacjentów po udarze
Naprawa naczyń / angiogeneza	Starszy + Dieta + STZ	Zakrzep zakrzepowy	Łączy starzejący się fenotyp naczyniowy z naczyniami cukrzycowymi, aby naśladować zaburzenia po naprawie po udarze	Duża zmienność lokalizacji skrzepów i wynikającej z tego objętości zawału

Tabela 1. Wytyczne dotyczące wyboru modeli złożonych cukrzycy i udaru niedokrwiennego na podstawie celów badawczych.