Wizualizacja i analiza ilościowa aktywacji PARP1/PARP2 indukowanej przez genotoksynę w komórkach z wykorzystaniem raportera opartego na białkach fluorescencyjnych

Summary

Tutaj opisujemy metodę wizualizacji komórkowej, lokalizacji podkomórkowej oraz analizy ilościowej ognisk wzbogaconych o poli(ADP-rybozę) (PAR) w stałych komórkach ssaków. Test ten umożliwia ilościowe określenie miejsc aktywacji PARP wywołanej uszkodzeniem DNA, w tym tych związanych z naprawą wycięcia zasad lub naprawą pęknięć pojedynczych nici, w jądrach komórek narażonych na genotoksynę.

Abstract

Poli(ADP-ryboza) (PAR) to polimer ADP-rybozy syntetyzowany przez czterech członków rodziny enzymów ADP-rybozowych — PARP1, PARP2, PARP5a i PARP5b. Jednak tylko PARP1 i PARP2 syntetyzują PAR w odpowiedzi na przerwania DNA. PAR definiuje się jako modyfikację białka po translacji, ale wykazano również, że istnieje jako modyfikacja DNA lub RNA. Poziomy PAR są dodatkowo regulowane przez PARG, glikohydrolazę PAR, która wraz z PARP1 i PARP2 moduluje poziom komórek PAR wywołanego uszkodzeniem DNA. Dynamiczna synteza i degradacja PAR jest kluczowa dla jego roli regulacyjnej w naprawie DNA oraz odpowiedzi na uszkodzenia DNA, co z kolei wpływa na reorganizację, replikację, transkrypcję i śmierć komórek wywołanych przez chromatynę. Aktywacja PARP1/PARP2 oraz nagromadzenie PAR można uznać za miejsca ciągłej naprawy wycięcia zasad lub naprawy pojedynczych pęknięć DNA; jednak liczne aktywatory PARP1/PARP2 są również powiązane ze stresem replikacyjnym oraz innymi procesami metabolicznymi DNA. Po utworzeniu łańcuchy PAR ułatwiają rekrutację czynników naprawy DNA i odpowiedzi na uszkodzenia DNA (DDR) do miejsc uszkodzenia DNA lub uszkodzenia genomowego za pośrednictwem ich domen wiążących PAR (PBD). Dziesięć różnych PBD rozpoznaje różne obszary cząsteczki PAR, w tym motyw wiążący PAR, palec cynkowy wiążący PAR, domenę WWE oraz makrodomenę, a także inne PBD. Aby ułatwić analizę komórkową dynamiki PAR, zastosowaliśmy PBD połączone z wzmocnionym zielonym białkiem fluorescencyjnym (EGFP), aby zoptymalizować ilościową ilością ognisk PAR opartą na komórkach. Opisujemy test, który wykorzystuje fragment RNF146 kodujący domenę PBD/WWE, powiązany z EGFP, do wizualizacji i ilościowej oceny akumulacji PAR w miejscach genomowego uszkodzenia oraz trwającego BER lub SSBR. Opisujemy etapy eksperymentalne, w tym produkcję cząstek lentiwirusowych, transdukcję docelowej linii komórkowej, leczenie komórek ssaków w celu wywołania uszkodzenia DNA genomowego, pozyskanie mikrografii fluorescencyjnych konfokalnych oraz półautomatyczną ilościową analizę danych.

Introduction

Protokół ten opisuje test LivePAR, który umożliwia wizualizację i ilościową analizę poli(ADP-rybozy) (PAR) w miejscach uszkodzenia genomowego, głównie związanych z naprawą wycięcia zasad (BER) lub naprawą przerw pojedynczych nici (SSBR), w komórkach ssaków ^1,2,3. BER to kluczowa ścieżka naprawy DNA, która usuwa uszkodzone lub zmodyfikowane zasady z DNA (przeglądy dotyczące BER i PARylacji patrz 4,5,6,7). BER rozpoczyna się od glikozylaz DNA, które rozpoznają i wycinają zmodyfikowane zasady⁴, pozostawiając miejsce apurynowe/apirymidynowe (AP), na przykład metylowo-purynową glikozylazę (MPG), która usuwa metylowane zasady ^8,9, lub 8-oksoguaninową glikozylazę (OGG1), która usuwa 8-oksoG ^9,10. Miejsca AP są następnie rozszczepiane przez endonukleazę AP 1 (APE1)11,12,13, tworząc nacięcie w kręgosłupie DNA. Polimeraza, czyli polimeraza DNA β (Polβ)^14,15, dostosowuje i wypełnia lukę, używając nieuszkodzonej nici jako wzoru, a na końcu ligazy DNA uszczelniają naprawioną nić^16,17, na przykład ligazę DNA I lub ligazę DNA III.

Kluczowymi uczestnikami BER i SSBR są poli(ADP-ryboza) polimerazy 1 i 2 (PARP1/PARP2)18,19,20, enzymy szybko wykrywające przerwanie nici DNA podczas BER lub SSBR. Po wykryciu tych przerw PARP1/PARP2 katalizuje dodawanie polimerów ADP-rybozy do siebie i innych białek — proces ten nazywany PARylacją (do przeglądu, patrz⁶) — poprzez hydrolizę NAD⁺. Tworzy to dynamiczne rusztowanie białkowe (PAR), które rekrutuje inne czynniki naprawy DNA do miejsca uszkodzenia, zwiększając jego dokładność. Aby zarządzać tym dynamicznym rusztowaniem PAR, kilka białek przyczynia się do hydrolizy i usuwania łańcuchów PAR, w tym hydrolaza akceptorowa ADP-rybozy 3 (ARH3), końcowa hydrolaza glikozy ADP-rybozy 1 (TARG1), hydrolaza mono-ADP-rybosylowa 1/2 (MacroD1/2) oraz glikohydrolaza poli(ADP-ryboza) (PARG)6,21,22,23,24,25,26 . Jednak PARG jest głównym odpowiedzialnym za ten proces^21,27 i odgrywa kluczową rolę w odpowiedzi na uszkodzenia DNA (DDR)^28,29.

PARG jest zatem krytycznie powiązany z funkcją PARP1 i PARP2. Podczas gdy PARP1 i PARP2 tworzą polimery PAR, PARG działa jako enzym "oczyszczający", hydrolizując te polimery i skutecznie odwracając PARylację^30,31. Proces ten jest niezbędny do ukończenia zarówno BER, jak i SSBR oraz umożliwienia recyklingu PARP1/PARP2 w reakcji na nowe uszkodzenia DNA. W konsekwencji PARP1, PARP2, PARylacja i PARG działają w sposób skoordynowany, zapewniając efektywną i odwracalną naprawę DNA dzięki BER i SSBR ^4,6.

Zakres PARylacji może być zależny od różnych czynników i odgrywa kluczową rolę w ogólnej odpowiedzi na uszkodzenia DNA³². Do tych czynników należą narażenie na genotoksyny, które dodają addukty do zasad DNA, takie jak N-metylo-N'-nitro-N-nitrosoguanidyna (MNNG), metylometanesulfonian (MMS), nadtlenek wodoru (_H2-O2) czy tert-butylowy nadtlenek (tBuOOH). Ponadto zakres PARylacji może być kształtowany przez cząsteczki modulujące proces PARylacji, takie jak dihydronikotynamid rybozyd (NRH), prekursor NAD⁺, który zwiększa aktywację PARP poprzez zwiększenie poziomu ^NAD+, lub FK866, inhibitor NAMPT, który może obniżać poziom NAD⁺ i negatywnie regulować aktywację PARP³. Wreszcie, mutacje genetyczne lub hamowanie enzymów takich jak PARP1/PARP2, PARP2, PARG lub innych białek naprawczych DNA (np. defekty BER lub homologiczne czynniki rekombinacji, takie jak BRCA1/BRCA2) mogą zmieniać aktywację PARP 33,34,35,36.

Test LivePAR wykorzystuje fragment białka palca serdecznego 146 (RNF146), który koduje domenę WWE (aminokwasy 100–182), powiązaną z wzmocnionym białkiem zielonej fluorescencji (EGFP)³. Domena WWE to domena kulista nazwana na cześć zachowanych reszt tryptofanu (W) i glutaminianu (E) w miejscu wiązania³⁷. Domeny WWE wiążą się z izo-ADP-rybozą, najmniejszą wewnętrzną jednostką strukturalną w łańcuchach PAR^38,39. RNF146 to ligaza ubikwityny E3, która rozpoznaje izo-ADP-rybozę^38,40 i według doniesień celuje w białka zaangażowane w BER (XRCC1, ligazę DNA III i PARP1) w celu degradacji proteasomalnej⁴¹. Powiązanie tej domeny WWE z EGFP umożliwia wizualizację i wykrywanie miejsc parylacji indukowanych przez genotoksynę w komórkach ssaków. W tym protokole opisujemy generowanie stabilnych linii komórkowych wyrażających raport LivePAR (rysunek 1A), indukcję uszkodzenia DNA w celu aktywacji PARP1/PARP2, produkcję PAR oraz pozyskiwanie i analizę danych z mikroskopii fluorescencyjnej konfokalnej (Rysunek 1).

Plazmid pMD2.g(VSVG) dostarcza glikoprotein otoczkowy wirusa (VSVG), który rozszerza zakres komórek, które wirus może zainfekować w porównaniu do natywnego białka otoczkowego lentiwirusa. Plazmid pRSV-REV dostarcza białko elementu regulacyjnego (REV), które jest kluczowym transaktywatorem wiążącym się z RNA wirusa i aktywującym transkrypcję genów wirusowych; Jest niezbędny do efektywnej replikacji wirusa. Plazmid pMDLg/pRRE dostarcza kilka kluczowych komponentów wewnętrznych, mianowicie gag, który koduje białka matrycy (MA), kapsydu (CA) i nukleokapsydu (NC), pol, który koduje enzymy potrzebne do replikacji i integracji wirusa z genomem komórki gospodarza, oraz element regulujący RNA (RRE), który jest elementem RNA zwiększającym efektywność translacji RNA wirusa i pakowania genomowego RNA. Plazmid pLV-EF1A-LivePAR-Hygro (Rysunek 1A) zawiera cDNA kodujące wzmocnione zielone białko fluorescencyjne (EGFP), które jest połączone z C-terminusem domeny WWE RNF146 (aminokwasy 100–182), domeny białkowej wiążącej się z łańcuchami poli(ADP-ryboza), a wektor koduje także kasetę oporu na higromycynę. Wirus jest izolowany z supernatantu hodowli komórkowej i może być przechowywany w temperaturze -80 °C lub natychmiast wykorzystywany do transdukcji (Rysunek 1B).

Protocol

1. Produkcja lentiwirusa

UWAGA: Protokół ten wykorzystuje trzecią generację systemu pakowania lentiwirusów^42,43 do generowania komórek wyrażających genetycznie zakodowany reporter PAR. Cząstki lentiwirusowe są produkowane w komórkach 293FT przy użyciu systemu czterech plazmidów składającego się z komponentów otoczkowych, regulatorów i opakowań, wraz z konstrukcją pLV-EF1A-LivePAR-Hygro kodującą domenę WWE oznaczoną EGFP o RNF146, która wiąże łańcuchy poli(ADP-rybozy). Powstały wirus służy do generowania stabilnych linii komórkowych do wizualizacji i ilościowej akumulacji PAR.

1. Hodowanie komórek o niskim przepustku 293 stopy w DMEM zawierających 10% FBS i 1% Pen/Strep w atmosferze wilgotnej przy temperaturze 37 °C i 5%_CO2. Upewnij się, że komórki 293FT nie były w hodowli dłużej niż 3 tygodnie.
   UWAGA: Rutynowo używamy komórek 293FT o liczbie przejścia od 3 do 10. Komórki 293FT zostały przekształcone i uwiecznione przez duży antygen T SV40. Komórki te charakteryzują się wysoką efektywnością transfekcji, co jest niezbędne do badań nad produkcją i ekspresją genów rekombinowanych. Dobrze reagują zarówno na transfekcję lipidową, jak i metodę transdukcji wirusowej.
2. Płytka 1,7 × 10 5^{komórek o powierzchni} 293 FT na miskę do hodowli tkanek o średnicy 60 mm w końcowej objętości 5,5 mL pośrodku hodowlanego pierwszego dnia. Komórki odłóż do inkubatora na 24 godziny.
3. W dniu 2 (w dniu transfekcji) dodaj 375 μL bezpenetracyjnego medium DMEM bez FBS i Pen/Streptokoka do sterylnej rurki mikrowirującej o pojemności 1,5 mL. Następnie dodaj 10 μL lipidowego reagenta transfekcyjnego, 4 μg plazmidu pLV-EF1A-LivePAR-Hygro, 2 μg plazmidu pMD2.g(VSVG), 2 μg plazmidu pRSV-REV oraz 2 μg plazmidu pMDLg/pRRE. Delikatnie stuknij rurkę mikrowirubacyjną, aby wymieszać medium, odczynnik transfekcyjny i DNA plazmidu (unikaj wirowania). Inkubuj przez 15–30 minut w temperaturze pokojowej, aby umożliwić powstanie kompleksu odczynnikowego DNA/transfekcji.
4. Dodaj mieszankę odczynników plazmid/transfekcyjnych do 60 mm naczynia zawierającego komórki 293FT do transfekcji, nie usuwając ośrodka krople. Wróć komórki do inkubatora na 48 godzin.
   UWAGA: Ten okres pozwala na produkcję i uwalnianie cząstek lentiwirusowych do podłoża wzrostowego.
5. Czwartego dnia pobierz podłoże hodowlane z transfekowanych komórek o długości 293 stop, aby wyizolować cząstki lentiwirusa. Przefiltruj przez sterylny filtr o średnicy 0,45 μm, aby oddzielić zanieczyszczenia komórkowe od cząstek lentiwirusowych.
6. Określ miano lentiwirusa na podstawie dostępnych odczynników (opcjonalnie).
   UWAGA: Ta metoda zazwyczaj daje 10^{od 5} do 10 6^jednostek zakaźnych na mL (IFU/mL), co koreluje z przybliżoną wielokrotnością zakażeń (MOI) ~5 przy zastosowaniu zgodnie z poniższym krokiem transdukcji.
7. Umieść podłoże zawierające cząstki lentiwirusa w cztery sterylne krioviale (1,0 mL w probówce) i przechowywać w temperaturze -80 °C.

2. Transdukcja

UWAGA: Ta sekcja przedstawia protokół transdukcji lentiwirusowej stosowany do wprowadzenia transgenu do linii komórkowych (Rysunek 1B). W naszym laboratorium jest konsekwentnie skuteczny w naszym laboratorium 1,3,33,37,44,45.

1. Hodować linię komórkową wybranej (niski numer przepuszczalności) w odpowiednim podłożu w atmosferze nawilżonej w temperaturze 37 °C i 5%_CO2.
   UWAGA: Zacznij od wczesnego przejścia potrzebnego typu komórki. Nowa fiolka z komórkami musi zostać rozmroziona i przepuszczona przynajmniej raz przed zasiewem do transdukcji.
2. Pierwszego dnia nasiono 1 × 10 5–1,5 × 10 komórek⁵ komórek na dołek na każdy dołek płyty 6-dołowej w 2 mL podłoża wzrostowego. Wróć komórki do inkubatora na 24 godziny.
3. W dniu 2 (dniu transdukcji) upewnij się, że komórki są zbiegane między 20% a 40%. Dodaj 1 mL wirusa, 1 mL podłoża wzrostu i 2 μL polibrenu (2 mg/mL materiału) do stożkowej probówki o pojemności 15 mL i delikatnie mieszaj przez inwersję (unikaj wirowania).
   UWAGA: Polibren jest stosowany podczas transdukcji lentiwirusa, aby zapobiec elektrostatycznemu odpychaniu między cząstkami wirusa a błoną komórkową. Ponieważ polibren jest naładowany dodatnio, oddziałuje on z ujemnie naładowanymi glikoproteinami wirusowymi, neutralizując ich ładunek. Ponadto polibren wiąże się z glikozaminoglikanami w podłożu hodowlanym komórek, zapobiegając ich interakcji z wirusem. Polibren zatem znacznie zwiększa efektywność transdukcji.
4. Usuń podłoże wzrostowe z płyty 6-dołkowej i dodaj mieszankę wirusa/medium/polibrenu do każdego dołku. Umieść komórki z mieszanką transdukcyjną w inkubatorze zawierającym wilgotną atmosferę w temperaturze 32 ^°C i 5%_CO2 na 16–18 godzin.
   UWAGA: Inkubacja komórek w 32 °C przez noc podczas transdukcji lentiwirusowej to powszechna, choć niekonieczna, praktyka, która znacząco zwiększa skuteczność infekcji wirusowej. Obniżenie temperatury spowalnia metabolizm komórkowy, co zmniejsza obronę komórkową i zwiększa podatność na infekcje wirusowe.
5. Trzeciego dnia zamień podłoże komórek przenikniętych wirusem na świeże i przenieś je do inkubatora o temperaturze 37 °C. Inkubuj przez 48 godzin.
   UWAGA: Te 2 dni wystarczają, aby komórki mogły wytworzyć transgen RNF146(100–182)-EGFP i stać się oporne na higromycynę.
6. Aby wypracować powstałe poliklonalne stabilne linie komórkowe wyrażające transgen RNF146(100–182)-EGFP, następnie rozpocznij selekcję higromycyny po 2 dniach inkubacji, zgodnie z krokiem 2.5.
   1. Alternatywnie, powiększ populację komórek transdukowanych w przypadku braku higromycyny i wykorzystaj do analizy PAR w ciągu następnych 10–14 dni (transdukcja przejściowa), jak opisano wcześniej¹.
7. Przełóż komórki na płytkę o średnicy 100 mm, gdy urosną w obecności higromycyny i powiększ się tak bardzo, jak to konieczne.
8. Przygotuj zapasy kriogeniczne przekształconych komórek do przyszłego użytku.
9. Zweryfikować ekspresję transgenu RNF146(100–182)-EGFP za pomocą mikroskopii konfokalnej, zgodnie z sekcją 3. Transgen RNF146(100–182)-EGFP będzie wyrażany w całej komórce.
10. Zweryfikować ekspresję transgenu RNF146(100–182)-EGFP za pomocą immunoblotu, jak opisano w innym miejscu ^1,37.

3. Mikroskopia konfokalna i analiza

UWAGA: Ta część protokołu szczegółowo opisuje przygotowanie slipów pokrywkowych, zasiewanie komórek ekspresujących LivePAR, ekspozycję na zabiegi (tBuOOH, MNNG, PARGi, PARPi i/lub NRH) oraz przygotowanie komórek stałych na szkiełkach mikroskopu do obrazowania konfokalnego i analizy ognisk PAR (Rysunek 1C). Opisuje także użycie oprogramowania ImageJ oraz niestandardowego makra do półautomatycznej ilościowej identyfikacji ognisk PAR. Protokół ten może być wykorzystywany do badania wpływu różnych czynników (np. małych cząsteczek, knockoutów białek BER) na parylację zależną od uszkodzenia DNA i został z powodzeniem zastosowany w naszym laboratorium^34,37.

1. Przygotowanie pokrywek
   1. Mocz 20 × 20 mm pokrywek przez 20 minut w eterze dietylowym w szklanym pojemniku w okapie oparowym.
      UWAGA: Używaj okapu do pracy z eterem dietylowym ze względu na jego łatwopalność i potencjalne zagrożenia.
   2. Usuń eter dietylowy i myj pokrywy w coraz mniejszym stężeniu etanolu [100%, 70%, 50%, a potem 0% (ddH₂O)].
   3. Usuń wodę i namocz pokrywki przez 20 minut w 1 N HCl z delikatnym mieszaniem.
   4. Zdejmij HCl i umyj pokrywki 3 razy z ddH₂0.
   5. Przechowuj pokrywki w 70% etanolu w temperaturze 4 °C do użycia.
2. Płytowanie komórek
   1. Umieść dwie sterylne pokrywy 20 × 20 mm w naczyniu do hodowli komórek o średnicy 60 mm obok siebie. Przygotuj tyle dań, ile potrzeba do eksperymentu. Upewnij się, że cały etanol wyparował, zanim dodasz komórki do naczynia zawierającego pokrywki. Usuń resztki etanolu, dodając sterylny PBS do naczynia przez 10–15 minut; usuń PBS przed zasiewem komórek.
   2. Nasiej 200 000 komórek ekspresujących LivePAR na miskę hodowlę. Pozwól komórkom przylgnąć do pokrywek 24–36 godzin, kondycjonuj podłoże i zacznij się rozmnażać (rosnąć).
3. Indukcja ognisk PAR
   1. Wystaw komórki wyrażające LivePAR na 100 μM NRH, 10 μM PARGi oraz 10 μM MNNG lub 40 μM tBuOOH. Ponadto, aby sprawdzić powstawanie PAR zależnego od PARP1/PARP2, hamuj PARP1/PARP2 poprzez dodanie 10 μM PARPi. Dodaj związki bezpośrednio do podłoża zawierającego komórki na pokrywkach i delikatnie mieszaj je w naczyniach do hodowli komórek, aby rozprowadzić związki. Inkubuj naczynia o średnicy 60 mm w temperaturze 37 °C przez 60–90 minut.
      UWAGA: NRH jest stosowane, aby zapewnić wystarczające poziomy komórkowego NAD⁺ dla optymalnej PARylacji PARP1/PARP2 pośredniczonej 33,46,47. PARGi jest używane, aby zapobiec rozbiciu łańcuchów PAR syntetyzowanych przez PARP1/PARP2 przez PARG. MNNG lub tBuOOH jest używany do indukowania modyfikacji zasad DNA w celu zainicjowania BER, co prowadzi do aktywacji PARP1/PARP2. PARPi służy do potwierdzenia, że sygnał (ogniska) wynika z aktywacji PARP1/PARP2.
4. Mocowanie komórek i montaż pokrywek
   1. Usuń podłoże i przepłucz PBS.
      UWAGA: Ważne jest jednorazowe lub dwukrotne płukanie PBS, ponieważ podłoże używane do hodowli komórek zawiera wysokie stężenie białek surowicowych. Mycie PBS usuwa też wszelkie pozostałości MNNG lub tBuOOH w mediach.
   2. Prefiks w 4% formaldehydu w PBS przez 15 minut w temperaturze pokojowej. Płucz komórki 3 razy PBS.
   3. Napraw to przez dodanie 3 mL zimnego (-20 ^°C) metanolu: acetonu (7:3) do ogniw. Stawiaj naczynia w temperaturze -20 ^°C przez 9 minut.
   4. Usuń metanol: aceton. Myj 3 razy PBS.
   5. Na szkiełkach szklanych nałóż 15 μL medium anty-fade zawierającego DAPI. Delikatnie zamontuj pokrywki na miejscu podłoża mocującego tak, że komórki są skierowane do środka, minimalizując bąbelki.
   6. Wycentruj, zabezpiecz i uszczelnij boki pokrywy do szkła, nakładając niewielką ilość przezroczystej emalii do paznokci na boki pokrywki. Umieść szkiełki w ciemności, aby emalia z paznokci wyschła (~10 min). Przechowuj preparaty w ciemności w temperaturze 4 °C, aż będą gotowe do zdjęcia.
5. Komórki obrazujące
   1. Obrazuj wszystkie preparaty co najmniej 10 razy przy powiększeniu 63×, używając mikroskopu konfokalnego. Wykrywanie ognisk PAR za pomocą lasera 488 nm oraz barwienia jądrowego (DAPI) za pomocą lasera 405 nm (na przykład patrz Rysunek 2).
6. Analiza obrazów konfokalnych
   1. Stwórz plik tekstowy zawierający następujący tekst i nazwij go "LivePAR_Macro". To makro ułatwia "automatyczną" ilościową identyfikację ognisk PAR w jądrach komórek ekspresujących LivePAR:
      macro "DAPI pozytywne barwienie [1]" {
      tit=getTitle();
      bieg ("Duplikat... ", "title=DAPI duplicate");
      selectWindow("DAPI")
      run("8-bit");
      run ("Split Channels")
      selectWindow("C2-"+"DAPI");
      close();
      selectWindow("C1-"+"DAPI");
      bieg ("Gaussian Blur... ", "Sigma=3");
      setAutoThreshold("Domyślny");
      run ("Make Binary");
      run("Invert")
      run ("Fill Holes")
      run ("Watershed")
      run("Analizuj cząstki... ", "size=50.00-Infinity cyrcularity=0.00-1.00 pokaż=Inspekty dodają, wykluczają in_situ");
      przemianowanie ("DAPI_"+tit);
      selectWindow("DAPI_"+tit);
      close();
      }
      macro "PAR [2]" {
      setBatchMode(true);
      run("8-bit");
      t=getTitle();
      bieg ("Duplikat... ", "title=GB1 duplicate");
      bieg ("Duplikat... ", "title=GB20 duplicate");
      selectWindow("GB20")
      bieg ("Gaussian Blur... ", "radius=20 stos");
      selectWindow("GB1");
      bieg ("Gaussian Blur... ", "radius=1 stos");
      imageCalculator("Odjąć tworzenie stosu", "GB1", "GB20");
      selectWindow("GB1");
      close();
      selectWindow("GB20");
      close();
      selectWindow("Rezultat GB1");
      przemianowanie ("Blank_GB1-GB20_"+t);
      tytuł = getTitle();
      run ("Split Channels")
      selectWindow("C1-"+title);
      close();
      selectWindow("C2-"+title);
      setThreshold(90,255) //wartość 90 można zmienić, aby uwzględnić zmienność eksperymentalną
      run("Analizuj cząstki... ", "rozmiar=0,00-200 cyrcularity=0,00-1,00 show=Masks sumaryze");
      zakończenie ("C2-"+tytuł);
      selectWindow("Mask of C2-"+title);
      close ();
      setBatchMode(false);
      }
   2. Pobierz i zainstaluj ImageJ na komputerze (https://imagej.net/ij/download.html).
   3. Otwórz ImageJ i zainstaluj makrę (plik tekstowy: LivePAR_Macro), klikając na Wtyczki | Makra | Zainstaluj.
   4. Otwórz wszystkie pliki konfokalne w ImageJ i zapisz je jako pliki *.tif, aby zachować oryginalne pliki.
   5. Otwórz dokument kalkulacyjny i zapisz go jako [data]_[Cell Line]_Foci Analiza.
   6. Analizuj po jednym *.tif pliku na raz. Naciśnij 1 , aby znaleźć jądra; gdy otworzy się okno zatytułowane ROI Manager , zaznacz wszystkie wpisy w oknie i naciśnij dodaj , aby nałożyć obszar jąder na oryginalny obraz. Usuń błędnie zidentyfikowane jądra. Narysuj jądro za pomocą narzędzia do wyboru odręcznego i naciśnij 2 , aby zmierzyć ogniska PAR.
      UWAGA: Nie włączaj jąder, które nie znajdują się w pełni w ramce.
   7. Wybierz każde jądro w menedżerze ROI pojedynczo i naciśnij 2. Pojawi się liczenie wskazujące liczbę ognisk w wybranym jądrze. Gdy ogniska wszystkich jąder pliku zostaną ocenowane, skopiuj i wklej informacje do otwartego dokumentu kalkulacyjnego.
   8. Powtórz kroki 3.6.6 i 3.6.7 ze wszystkimi plikami *.tif.
   9. Rysuj ogniska PAR dla jądra w wybranym oprogramowaniu (np. patrz Rysunek 3).

Results

Komórki ekspresujące sondę LivePAR można generować poprzez produkcję lentiwirusa kodującego białko fuzyjne RNF146(100-182)-EGFP (Rysunek 1A). Komórki można oceniać po ekspresji przejściowej do dwóch tygodni po transdukcji lub jako stabilne linie komórkowe po selekcji w higromycynie (Rysunek 1B)¹. Po leczeniu genotoksynami ogniska PAR wywołane uszkodzeniem DNA mogą być widoczne w jądrze i po ustabilizowaniu obrazowane za pomocą mikroskopii...

Discussion

Test LivePAR został opracowany do wykrywania miejsc uszkodzeń genomu jądrowego, gdzie PARP1/PARP2 aktywnie syntetyzuje łańcuchy PAR. Aby to osiągnąć, fragment RNF146 kodujący domenę WWE (aminokwasy 100–182) został połączony z EGFP 1,2,3,37. Dodatkowe sondy PAR, które opisaliśmy, kodują EGFP fuzjonowany z resztami aminokwasowymi 1 do 166 w DTX4, resztami aminokwasowymi 22 do 112 w PARP11 oraz am...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Odczynniki, chemikalia i peptydy
0,45 & mikro; m Durapore steriflip filtry	Sigma-Aldrich	Cat# SE1M003M00
20 x 20 mm pokrywek mikroskopowych	Thermo Fisher Scientific	Katalog# 22-170-371
Aceton	Thermo Fisher Scientific	Katalog# A18-1
Naczynia hodowlane komórek, 100 mm	VWR	Katalog# 25382-166
Naczynia hodowlane komórek, 60 mm	Fisher Scientific	Cat# 430166
Płytki hodowli komórkowych, 6-dołkowa	VWR	Katalog# 62406-161
Krioviały, 2 mL	VWR	Katalog# 89499-722
Eter dietylowy	Thermo Fisher Scientific	Katalog# 60-29-7
Dimetylsulfoksyd	Thermo Fisher Scientific	Cat# BP231-1
Jednorazowe filtry sterylne, 0,45 i mikro; m	Sigma-Aldrich	Cat# SE1M003M00
DMEM	Corning	Cat# 15-017-CV
Etanol, 200 proof	Decon Labs	Cat# 2701
Szkiełka mikroskopowe szkiełka	Thermo Fisher Scientific	Katalog# 12-544-4
Serum bydła płodowe inaktywowane przez ciepło	Atlanta Biologics	Cat# S11150
Kwas solny	Thermo Fisher Scientific	Katalog# A144-212
Higromycyna	Thermo Fisher Scientific	Cat# 10687010
Duże Kim Wipes	Kimberly-Clark	Katalog# 34256
Zestaw Lenti-X GoStix Plus	Takara	Katalog# 631280
Metanol	Thermo Fisher Scientific	Cat# A452SK-4
MNNG	Molport	Cat# N493990
NRH (1-[(2R,3R,4S,5R)-3,4-dihydroksy-5-(hydroksymetylo) tetrahydrofuran-2-yl]-4H-pirydyna-3-karboksamid)	Marie Migaud lub  NuChem Sciences Inc
Inhibitor PARG (PDD00017273)	Sigma-Aldrich	Cat# SML1781
PARPi inhibitor (Veliparib, ABT-888)	MedChemExpress	Cat# HY-10129
Penicylina/streptomycyna	Gibco	Cat# 15140-122
Polibrene	Sigma-Aldrich	Cat# TR-1003-G
tBuOOH	Thermo Fisher Scientific	Cat# 180345000
TransIT-x2 (reagent transfekcyjny)	Mirus	Cat# MIR-6006
Triton-X100	VWR	Cat# 0694
Trypsin-EDTA	Thermo Fisher Scientific	Katalog# 25200-056
Osłona Vectashield (H-1000) z systemem montażowym antyzanikającym	Thermo Fisher Scientific	Cat# NC1695563
linie komórkowe
293-FT	Thermo Fisher Scientific	Cat# R70007
(pochodzącym z ludzkich komórek nerkowych embrionalnych przekształconych za pomocą dużego antygenu T SV40)	Thermo Fisher Scientific	Cat# R70007
LN428	Hojny dar od	Nie ma
(Linia komórkowa guza glejaka ludzkiego)	Dr Ian Pollack (Uniwersytet w Pittsburghu)	Nie ma
RPE-1	ATCC	Cat# CRL-4000
(ludzkie komórki nabłonkowe pigmentu siatkówki uwiecznione przez hTERT)	ATCC	Cat# CRL-4000
U2OS	ATCC	Cat# HTB-96
(Linia komórkowa osteosarcoma u człowieka)	ATCC	Cat# HTB-96
DNA rekombinowane
pMDLg/pRRE	Zapas laboratoryjny #253	Addgene, Cat# 12251
pRSV-Rev	Zapas laboratoryjny #254	Addgene, Cat# 12253
pMD2.G	Zapas laboratoryjny #252	Addgene, Cat# 12259
pLV-EF1A-LivePAR-Hygro (LivePAR to domena WWE RNF146, reszty aminokwasowe 100-182, zrośnięte z EGFP; zawiera kasetę oporną na higromycynę)	Zapas laboratoryjny # 1727	Addgene, Cat# 176063
oprogramowanie i algorytmy
Adobe Illustrator (do przygotowywania figurek)	Adobe Systems	Wersja 2024
GraphPad Prism	GraphPad	Wersja 10.5.0  (Mac OS X)
ImageJ	NIH	https://imagej.net/ij/download.html