Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Wizualizacja i ilościowa analiza aktywacji PARP1/PARP2 indukowanej genotoksinami w komórkach z wykorzystaniem reportera opartego na białku fuzyjnym fluorescencyjnym

374 wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/70497

⸱

17 kwietnia 2026

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Pathology and Laboratory Medicine, Warren Alpert Medical School & Legorreta Cancer Center, Brown University, 2Department of Pharmacology & Mitchell Cancer Institute, University of South Alabama

W tym artykule

Podsumowanie

Tu opisujemy metodę wizualizowania opartych na komórkach, lokalizacji subkomórkowej i analizy ilościowej ognisk wzbogaconych poli(ADP-rybozą) (PAR) w fiksowanych komórkach ssaków. Ten test umożliwia ilościową ocenę miejsc aktywacji PARP indukowanej uszkodzeniem DNA, w tym związaną z naprawą po wycinaniu zasad lub naprawą pojedynczych rozerwaniach łańcucha, w jądrach komórek narażonych na genotoksyczne substancje.

Streszczenie

Poli(ADP-ryboza) (PAR) to polimer ADP-rybozy syntetyzowany przez cztery członków rodziny enzymów polimerazy ADP-rybozy — PARP1, PARP2, PARP5a i PARP5b. Jednak tylko PARP1 i PARP2 syntetyzują PAR w odpowiedzi na łamanie DNA. PAR jest definiowane jako modyfikacja białka potranslacyjna, ale wykazano również, że istnieje jako modyfikacja DNA lub RNA. Poziomy PAR są dodatkowo regulowane przez PARG, glikohydrolazę PAR, która wraz z PARP1 i PARP2, reguluje poziomu PAR indukowanego uszkodzeniem DNA w komórce. Dynamiczna synteza i degradacja PAR jest kluczowa dla jego roli regulatorowej w naprawie DNA oraz reakcji na uszkodzenie DNA, co z kolei wpływa na reorganizację chromatyny, replikację, transkrypcję i śmierć komórki. Aktywacja PARP1/PARP2 i akumulacja PAR mogą być uważane za miejsca trwającej naprawy przez wycinanie zasady lub naprawy pojedynczego łamania DNA; jednak liczne aktywaty PARP1/PARP2 są również związane ze stresem replikacyjnym i innymi procesami metabolicznymi DNA. Po uformowaniu, łańcuchy PAR ułatwiają rekrutację czynników naprawy DNA i reakcji na uszkodzenie DNA (DDR) do miejsc uszkodzenia DNA lub genomicznej obrażenia poprzez ich domeny wiązania PAR (PBD). Dziesięć różnych PBD rozpoznaje różne regiony cząsteczki PAR, w tym motyw wiązania PAR, cynkowy palec PAR binding, domenę WWE i makrodomenę, między innymi PBD. Aby ułatwić analizę komórkową dynamiki PAR, użyliśmy PBD połączonych z ulepszoną zieloną białkową fluorescencyjną (EGFP), aby zoptymalizować ilościową analizę PAR w komórkach. Opisujemy test, który wykorzystuje fragment RNF146 kodujący domenę PBD/WWE, połączony z EGFP, do wizualizacji i ilościowego określenia akumulacji PAR w miejscach genomicznej obrażenia i trwającej BER lub SSBR. Opisujemy kroki eksperymentalne, w tym produkcję cząstek lentiwirusowych, transdukcję docelową linię komórek, leczenie komórek ssaczych w celu wywołania uszkodzenia genomicznego DNA, pozyskiwanie konfokalnych mikrogrfii fluorescencyjnych i półautomatyczną ilościową analizę danych.

Wprowadzenie

Ten protokół opisuje test LivePAR, który umożliwia wizualizację i ilościową analizę poli(ADP-rybozy) (PAR) w miejscach obrażeń genomu, głównie związanych z naprawą usuwania zasad (BER) lub naprawą pojedynczych łańcuchów (SSBR), w komórkach ssaków1,2,3. BER jest kluczowy dla ścieżki naprawy DNA, która usuwa uszkodzone lub zmodyfikowane zasady z DNA (dla przeglądów na temat BER i PARylacji, patrz4,5,6,7). BER zaczyna się od glikozylaz DNA, które rozpoznają i wycinają zmodyfikowane zasady4, pozostawiając miejsce apurynowo/apyrimidynowe (AP), na przykład, metylopurynowa glikozylaza (MPG), która wycina smetryzowane zasady8,9, lub 8-oksogwaninowa glikozylaza (OGG1), która wycina 8-oksogwaninę9,10. Miejsca AP są następnie ścinane przez endonukleazę AP 1 (APE1)11,12,13, tworząc nacięcie w łańcuchu DNA. Polimeraza, a mianowicie polimeraza DNA β (Polβ)14,15, dostosowuje i wypełnia lukę używając nieuszkodzonego łańcucha jako szablonu, a na koniec ligazy DNA uszczelniają naprawiony łańcuch16,17, na przykład, ligaza DNA I lub ligaza DNA III.

Kluczowymi graczami w BER i SSBR są poli(ADP-rybozy) polimerazy 1 i 2 (PARP1/PARP2)18,19,20, enzymy, które szybko wykrywają łamania łańcucha DNA podczas BER lub SSBR. Po wykryciu tych łamań, PARP1/PARP2 katalizuje dodanie polimerów ADP-rybozy do siebie i innych białek—proces nazywany PARylacją (dla przeglądu, patrz6)—poprzez hydrolizę NAD+. To tworzy dynamiczny szkielet białkowy (PAR), który rekrutuje inne czynniki naprawy DNA do miejsca uszkodzenia, poprawiając wierność naprawy DNA. Aby zarządzać tym dynamicznym szkieletem PAR, kilka białek przyczynia się do hydrolizy i usuwania łańcuchów PAR, w tym hydrolaza akceptora ADP-rybozy 3 (ARH3), terminalna glikozylohydrolaza ADP-rybozy 1 (TARG1), hydrolaza mono-ADP-rybozy 1/2 (MacroD1/2) i glikohydrolaza poli(ADP-rybozy) (PARG)6,21,22,23,24,25,26. Jednak PARG jest głównie odpowiedzialny za ten proces21,27 i odgrywa kluczową rolę w reakcji na uszkodzenie DNA (DDR)28,29.

PARG jest więc krytycznie związany z funkcją PARP1 i PARP2. Podczas gdy PARP1 i PARP2 tworzą polimery PAR, PARG działa jako enzym "czyszczący", hydrolizując te polimery i skutecznie odwracając PARylację30,31. Ten proces jest niezbędny do zakończenia zarówno BER, jak i SSBR oraz do pozwolenia PARP1/PARP2 na recykling, aby odpowiedzieć na nowe uszkodzenia DNA. W konsekwencji, PARP1, PARP2, PARylacja i PARG działają w skoordynowany sposób, zapewniając wydajną i odwracalną naprawę DNA przez BER i SSBR4,6.

Stopień PARylacji może być wpłynięty przez różne czynniki i odgrywa istotną rolę w ogólnej reakcji na uszkodzenie DNA32. Te czynniki obejmują ekspozycję na genotoksyny, które dodają addukty do zasad DNA, takie jak N-metylo-N'-nitro-N-nitrozoguanidyna (MNNG), metyl metansulfonian (MMS), nadtlenek wodoru (H2O2) lub terc-butylohydroperoksym (tBuOOH). Ponadto, stopień PARylacji może być wpłynięty przez cząsteczki, które modulowują proces PARylacji, takie jak dihydronikotynamidowe rybozyd (NRH), prekursor NAD+, który zwiększa aktywację PARP poprzez zwiększenie poziomów NAD+, lub FK866, inhibitor NAMPT, który może zmniejszać poziomy NAD+ i negatywnie regulować aktywację PARP3. Wreszcie, mutacje genetyczne lub inhibicja małymi cząsteczkami enzymów takich jak PARP1/PARP2, PARG lub innych białek naprawy DNA (np. defekty w BER lub rekombinacji homologicznej, takie jak BRCA1/BRCA2) mogą zmienić aktywację PARP33,34,35,36.

Test LivePAR wykorzystuje fragment białka z pierścieniem palca 146

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Produkcja lentiwirusu

UWAGA: W tym protokole wykorzystywany jest system pakowania lentiwirusów trzeciej generacji42,43 do wygenerowania komórek ekspresujących genetycznie zakodowanego reportera PAR. Cząstki lentiwirusowe są produkowane w komórkach 293FT za pomocą systemu czterech plazmidów, obejmującego komponenty osłonki, regulacyjne i pakujące, wraz z konstruktem pLV-EF1A-LivePAR-Hygro kodującym domeny WWE z domeną EGFP RNF146, która wiąże łańcuchy poli(ADP-rybozy). Otrzymany wirus jest używany do wygenerowania stabilnych linii komórkowych do wizualizowania i ilościowego określania akumulacji PAR.

  1. Hodowla komórek 293FT o niskiej liczbie przeszczepów w DMEM zawierającym 10% FBS i 1% Pen/Strep w zwilżonej atmosferze w 37 ˚C i 5% CO2. Upewnij się, że komórki 293FT nie były w hodowli dłużej niż 3 tygodnie.
    UWAGA: Rutynowo używamy komórek 293FT o liczbie przeszczepów od 3 do 10. Komórki 293FT zostały przetransformowane i skutejone przez dużą antygenę T wirusa SV40. Komórki te mają wysoką skuteczność transfekcji, która jest niezbędna do produkcji białek rekombinowanych i badań nad ekspresją genów. Reagują dobrze zarówno na metody transfekcji oparte na lipidach, jak i transdukcji wirusowej.
  2. Na dzień 1, rozłóż 1,7 x 105 komórek 293FT na 60 mm naczyń do hodowli tkankowej w końcowej objętości 5,5 mL pożywki do 5,5 mL. Włóż naczynia z komórkami do inkubatora na 24 h.
  3. Na dzień 2 (dzień transfekcji), dodaj 375 μL pożywki DMEM bez FBS i Pen/Strep do 1,5 mL sterylnej mikrocentrifugacji. Następnie dodaj 10 μL lipidowego reagentu transfekcyjnego, 4 μg plazmidu pLV-EF1A-LivePAR-Hygro, 2 μg plazmidu pMD2.g(VSVG), 2 μg plazmidu pRSV-REV i 2 μg plazmidu pMDLg/pRRE. Delikatnie stuknij mikrocentrifugacyjną tubę, aby wymieszać pożywkę, reagent transfekcyjny i DNA plazmidu (unikaj wirowania). Inkubator przez 15-30 min w temperaturze pokojowej, aby pozwolić na utworzenie kompleksu DNA/reagent transfekcyjny.
  4. Dodaj mieszaninę plazmidu/reagentu transfekcyjnego do 60 mm naczynia zawierającego komórki 293FT do transfekcji bez usuwania pożywki, kroplą po kropli. Włóż komórki z powrotem do inkubatora na 48 h.
    UWAGA: Ten okres pozwala na produkcję i uwolnienie cząstek lentiwirusowych do pożywki wzrostu.
  5. Na dzień 4, zebrać pożywkę kulturową z transfekowanych komórek 293FT w celu izolowania cząstek lentiwirusu. Przefiltrować przez sterylny filtr 0,45 μm, aby oddzielić szczątki komórkowe od cząstek lentiwirusu.
  6. Określić tytuł lentiwirusu z dostępnymi reagentami (opcjonalnie).
    UWAGA: Ta metoda zwykle daje 105 do 106 jednostek infekcyjnych na mL (IFU/mL), co odpowiada około mnożnikowi infekcji (MOI) ~5, gdy jest używany zgodnie z poniższym punktem transdukcji.
  7. Rozłóż pożywkę zawierającą cząstki lentiwirusu do czterech sterylnych kriowialek (1,0 mL na tubę) i przechowuj w -80 ˚C.

2. Transdukcja

UWAGA: Ta sekcja opisuje protokół transdukcji lentiwirusowej stosowany do wprowadzenia transgenu do linii komórkowych (Rysunek 1B). Był on konsekwentnie skuteczny w naszym laboratorium1,3,33,37,44,45.

  1. Hodowla linii komórkowej do wyboru (niska liczba przeszczepów) w odpowiedniej pożywce w zwilżonej atmosferze w 37 ˚C i 5% CO2.
    UWAGA: Zacznij od wczesnego przeszczepu potrzebnego typu komórek. Nowa fiolka komórek musi być rozmrożona i przeszczepiona co najmniej raz przed zasiewem do transdukcji.
  2. Na dzień 1, zasiej 1 x 105-1,5 x 105 komórek na dole, na każdej połowie 6-dzielnej płytki w 2 mL pożywki do wzrostu. Włóż komórki z powrotem do inkubatora na 24 h.
  3. Na dzień 2 (dzień transdukcji), upewnij się, że komórki mają pomiędzy 20% a 40% konfluencji. Dodaj 1 mL wirusa, 1 mL pożywki do wzrostu i 2 μL polibreny (2 mg/mL) do 15 mL stożkowej tubki i delikatnie wymieszaj przez inwersję (unikaj wirowania).
    UWAGA: Polibrena jest używana podczas transdukcji lentiwirusowej, aby zapobiec odpychaniu elektrostatycznemu między cząstkami wirusa a błoną komórkową. Ponieważ polibrena jest dodatnio naładowana, oddziałuje z ujemnie naładowanymi glikoproteinami wirusowymi, neutralizując ich ładunek. Ponadto polibrena wiąże glikozaminoglikany w pożywce kulturalnej, zapobiegając

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Komórki wykazujące ekspresję sondy LivePAR można uzyskać poprzez wytworzenie lentiwirusa kodującego białko fuzyjne RNF146(100-182)-EGFP (Ryc. 1A). Komórki można analizować po ekspresji przejściowej przez okres do dwóch tygodni po transdukcji lub jako stabilne linie komórkowe po selekcji higromycyną (Ryc. 1B)1. Po traktowaniu genotoksyną, indukowane uszkodzeniem DNA ogniska PAR można zwizualizować w jądrze komórkowym, a następnie, po utrwa...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Test LivePAR został opracowany w celu wykrycia miejsc uszkodzeń DNA jądrowego, w których PARP1/PARP2 aktywnie syntetyzuje łańcuchy PAR. Aby to osiągnąć, fragment RNF146 kodujący domenę WWE (aminokwasy 100–182) został połączony z EGFP1,2,3,37. Dodatkowe sondy PAR, które opisaliśmy, kodują EGFP połączone z resztkami aminokwasowymi 1 do 166 DTX4, resztkami aminokwasowymi 22 do 112 PARP11 i aminokw...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

R.W.S. jest współzałożycielem firmy Canal House Biosciences, LLC, jest w Radzie Doradczej Naukowej i ma udziały w firmie, ale ta firma nie była zaangażowana ani konsultacje nie były związane z tym badaniem. Autorzy oświadczają, że nie ma konfliktu interesów.

Podziękowania

Specjalne podziękowania dla Marie Migaud (University of South Alabama) za jej ciągłe wsparcie dotyczące dostarczania NRH na przestrzeni lat i za jej fachowe rady. Badania w laboratorium Sobola nad naprawą DNA, analizą uszkodzenia DNA oraz wpływem ekspozycji genotoksycznej & stresu replikacyjnego były wspierane przez granty z NIH [ES029518, ES028949, CA238061, CA236911, AG069740 i ES032522] oraz z NSF [NSF-1841811]. Wsparcie zostało również zapewnione przez Legoretta Cancer Center Endowment Fund (dla R.W.S.).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Czynniki reagujące, chemikalia i peptydy
0.45 µm Durapore steriflip filtersSigma-AldrichCat# SE1M003M00
20 x 20 mm Microscope coverslipsThermo Fisher ScientificCat# 22-170-371
AcetoneThermo Fisher ScientificCat# A18-1
Cell culture dishes, 100 mmVWRCat# 25382-166
Cell culture dishes, 60 mmFisher ScientificCat# 430166
Cell culture plates, 6-wellVWRCat# 62406-161
Cryovials, 2 mLVWRCat# 89499-722
Diethyl etherThermo Fisher ScientificCat# 60-29-7
Dimethyl sulfoxideThermo Fisher ScientificCat# BP231-1
Disposable sterile filters, 0.45 µmSigma-AldrichCat# SE1M003M00
DMEMCorningCat# 15-017-CV
Ethanol, 200 proofDecon LabsCat# 2701
Glass microscope slidesThermo Fisher ScientificCat# 12-544-4
Heat-inactivated fetal bovine serumAtlanta BiologicsCat# S11150
Hydrochloric acidThermo Fisher ScientificCat# A144-212
HygromycinThermo Fisher ScientificCat# 10687010
Large Kim WipesKimberly-ClarkCat# 34256
Lenti-X GoStix Plus KitTakaraCat# 631280
MethanolThermo Fisher ScientificCat# A452SK-4
MNNGMolportCat# N493990
NRH (1-[(2R,3R,4S,5R)-3,4-Dihydroxy-5-(hydroxymethyl) tetrahydrofuran-2-yl]-4H-pyridine-3-carboxamide)Marie Migaud lub NuChem Sciences Inc
PARG inhibitor (PDD00017273)Sigma-AldrichCat# SML1781
PARPi inhibitor (Veliparib, ABT-888)MedChemExpressCat# HY-10129
Penicillin/streptomycinGibcoCat# 15140-122
PolybreneSigma-AldrichCat# TR-1003-G
tBuOOHThermo Fisher ScientificCat# 180345000
TransIT-x2 (Transfection reagent)MirusCat# MIR-6006
Triton-X100VWRCat# 0694
Trypsin-EDTAThermo Fisher ScientificCat# 25200-056
Vectashield (H-1000) anti-fade mounting mediumThermo Fisher ScientificCat# NC1695563
Linie komórkowe
293-FTThermo Fisher ScientificCat# R70007
(derived from human embryonal kidney cells transformed with the SV40 large T antigen)Thermo Fisher ScientificCat# R70007
LN428Generosity gift fromN/A
(Human glioblastoma tumor cell line)Dr. Ian Pollack (University of Pittsburgh)N/A
RPE-1ATCCCat# CRL-4000
(human hTERT-immortalized retinal pigment epithelial cells)ATCCCat# CRL-4000
U2OSATCCCat# HTB-96
(Human osteosarcoma cell line)ATCCCat# HTB-96
Recombinant DNA
pMDLg/pRRELab stock# 253Addgene, Cat# 12251
pRSV-RevLab stock# 254Addgene, Cat# 12253
pMD2.GLab stock# 252Addgene, Cat# 12259
pLV-EF1A-LivePAR-Hygro
(LivePAR is the WWE domain of RNF146, amino acid residues 100-182, fused to EGFP; contains a Hygromycin resistance cassette)		Lab stock# 1727Addgene, Cat# 176063
Oprogramowanie i algorytmy
Adobe Illustrator (for preparation of figures)Adobe SystemsVersion 2024
GraphPad PrismGraphPadVersion 10.5.0 (Mac OS X)
ImageJNIHhttps://imagej.net/ij/download.html

Bibliografia

  1. Koczor, C. A., et al. Quantitative analysis of nuclear poly(ADP-ribose) dynamics in response to laser-induced DNA damage. Methods Mol Biol. 2609, 43-59 (2023).
  2. Koczor, C. A., et al. Live cell detection of poly(ADP-ribose) for use in genetic and genotoxic compound screens. Cancers (Basel). 14 (15), 3676 (2022).
  3. Koczor, C. A., et al. Temporal dynamics of base excision/single-strand break repair protein complex assembly/disassembly are modulated by the PARP/NAD(+)/SIRT6 axis. Cell Rep. 37 (5), 109917 (2021).
  4. Almeida, K. H., Sobol, R. W. A unified view of base excision repair: lesion-dependent protein complexes regulated by post-translational modification. DNA Repair (Amst). 6 (6), 695-711 (2007).
  5. Krokan, H. E., Bjoras, M. Base excision repair. Cold Spring Harb Perspect Biol. 5 (4), a012583 (2013).
  6. Al-Rahahleh, R. Q., Sobol, R. W. Poly-ADP-ribosylation dynamics, signaling, and analysis. Environ Mol Mutagen. 65 (9), 315-337 (2024).
  7. Saville, K. M., et al. NAD(+)-mediated regulation of mammalian base excision repair. DNA Repair (Amst). 93, 102930 (2020).
  8. Ibeanu, G., et al. Overexpression of human DNA repair protein N-methylpurine-DNA glycosylase results in the increased removal of N-methylpurines in DNA without a concomitant increase in resistance to alkylating agents in Chinese hamster ovary cells. Carcinogenesis. 13 (11), 1989-1995 (1992).
  9. Svilar, D., Goellner, E. M., Almeida, K. H., Sobol, R. W. Base excision repair and lesion-dependent subpathways for repair of oxidative DNA damage. Antioxid Redox Signal. 14 (12), 2491-2507 (2011).
  10. Bjoras, M., et al. Opposite base-dependent reactions of a human base excision repair enzyme on DNA containing 7,8-dihydro-8-oxoguanine and abasic sites. EMBO J. 16 (20), 6314-6322 (1997).
  11. Chen, D. S., Herman, T., Demple, B. Two distinct human DNA diesterases that hydrolyze 3'-blocking deoxyribose fragments from oxidized DNA. Nucleic Acids Res. 19 (21), 5907-5914 (1991).
  12. Demple, B., Herman, T., Chen, D. S. Cloning and expression of APE, the cDNA encoding the major human apurinic endonuclease: definition of a family of DNA repair enzymes. Proc Natl Acad Sci U S A. 88 (24), 11450-11454 (1991).
  13. Almeida, K. H., Andrews, M. E., Sobol, R. W. AP endonuclease 1: biological updates and advances in activity analysis. Methods Enzymol. 705, 347-376 (2024).
  14. Dianov, G., Price, A., Lindahl, T. Generation of single-nucleotide repair patches following excision of uracil residues from DNA. Mol Cell Biol. 12 (4), 1605-1612 (1992).
  15. Sobol, R. W., et al. Requirement of mammalian DNA polymerase-beta in base-excision repair. Nature. 379 (6561), 183-186 (1996).
  16. Kubota, Y., et al. Reconstitution of DNA base excision-repair with purified human proteins: interaction between DNA polymerase beta and the XRCC1 protein. EMBO J. 15 (23), 6662-6670 (1996).
  17. Prasad, R., et al. Specific interaction of DNA polymerase beta and DNA ligase I in a multiprotein base excision repair complex from bovine testis. J Biol Chem. 271 (27), 16000-16007 (1996).
  18. Alkhatib, H. M., et al. Cloning and expression of cDNA for human poly(ADP-ribose) polymerase. Proc Natl Acad Sci U S A. 84 (5), 1224-1228 (1987).
  19. Cherney, B. W., et al. cDNA sequence, protein structure, and chromosomal location of the human gene for poly(ADP-ribose) polymerase. Proc Natl Acad Sci U S A. 84 (23), 8370-8374 (1987).
  20. Ame, J. C., et al. PARP-2, a novel mammalian DNA damage-dependent poly(ADP-ribose) polymerase. J Biol Chem. 274 (25), 17860-17868 (1999).
  21. Fisher, A. E., Hochegger, H., Takeda, S., Caldecott, K. W. Poly(ADP-ribose) polymerase 1 accelerates single-strand break repair in concert with poly(ADP-ribose) glycohydrolase. Mol Cell Biol. 27 (15), 5597-5605 (2007).
  22. Jankevicius, G., et al. A family of macrodomain proteins reverses cellular mono-ADP-ribosylation. Nat Struct Mol Biol. 20 (4), 508-514 (2013).
  23. Zaja, R., et al. Comparative analysis of MACROD1, MACROD2 and TARG1 expression, localisation and interactome. Sci Rep. 10 (1), 8286 (2020).
  24. Ishiwata-Endo, H., et al. ARH family of ADP-ribose-acceptor hydrolases. Cells. 11 (23), 3853 (2022).
  25. Prokhorova, E., et al. Unrestrained poly-ADP-ribosylation provides insights into chromatin regulation and human disease. Mol Cell. 81 (12), 2640-2655.e8 (2021).
  26. Groslambert, J., et al. The interplay of TARG1 and PARG protects against genomic instability. Cell Rep. 42 (9), 113113 (2023).
  27. Min, W., Wang, Z. Q. Poly(ADP-ribose) glycohydrolase (PARG) and its therapeutic potential. Front Biosci (Landmark Ed). 14 (5), 1619-1626 (2009).
  28. Gagne, J. P., Hendzel, M. J., Droit, A., Poirier, G. G. The expanding role of poly(ADP-ribose) metabolism: current challenges and new perspectives. Curr Opin Cell Biol. 18 (2), 145-151 (2006).
  29. Bonicalzi, M. E., Haince, J. F., Droit, A., Poirier, G. G. Regulation of poly(ADP-ribose) metabolism by poly(ADP-ribose) glycohydrolase: where and when?. Cell Mol Life Sci. 62 (7-8), 739-750 (2005).
  30. Brochu, G., et al. Mode of action of poly(ADP-ribose) glycohydrolase. Biochim Biophys Acta. 1219 (2), 342-350 (1994).
  31. Thomassin, H., Menard, L., Hengartner, C., Kirkland, J. B., Poirier, G. G. Poly(ADP-ribosyl)ation of chromatin in an in-vitro poly(ADP-ribose)-turnover system. Biochim Biophys Acta. 1137 (2), 171-181 (1992).
  32. Kratz, A., et al. A multi-scale map of protein assemblies in the DNA damage response. Cell Syst. 14 (6), 447-463.e8 (2023).
  33. Li, J., et al. NAD(+) bioavailability mediates PARG inhibition-induced replication arrest, intra S-phase checkpoint and apoptosis in glioma stem cells. NAR Cancer. 3 (4), zcab044 (2021).
  34. Khan, M. M., et al. DNA polymerase beta expression in head and neck cancer modulates the poly(ADP-ribose)-mediated replication checkpoint. DNA Repair (Amst). 150, 103853 (2025).
  35. Ibrahim, M., et al. Replication-associated base excision repair/single-strand break repair regulates PARG inhibitor response via the PRMT1/PRMT5/ATR axis. NAR Cancer. 7 (4), zcaf057 (2025).
  36. Acharya, G., et al. CHK1 inhibitor induced PARylation by targeting PARG causes excessive replication and metabolic stress and overcomes chemoresistance in ovarian cancer. Cell Death Discov. 10 (1), 278 (2024).
  37. Al-Rahahleh, R. Q., et al. Overexpression of the WWE domain of RNF146 modulates poly-(ADP)-ribose dynamics at sites of DNA damage. DNA Repair (Amst). 150, 103845 (2025).
  38. He, F., et al. Structural insight into the interaction of ADP-ribose with the PARP WWE domains. FEBS Lett. 586 (21), 3858-3864 (2012).
  39. Wang, Z., et al. Recognition of the iso-ADP-ribose moiety in poly(ADP-ribose) by WWE domains suggests a general mechanism for poly(ADP-ribosyl)ation-dependent ubiquitination. Genes Dev. 26 (3), 235-240 (2012).
  40. DaRosa, P. A., et al. Allosteric activation of the RNF146 ubiquitin ligase by a poly(ADP-ribosyl)ation signal. Nature. 517 (7533), 223-226 (2015).
  41. Kang, H. C., et al. Iduna is a poly(ADP-ribose) (PAR)-dependent E3 ubiquitin ligase that regulates DNA damage. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (34), 14103-14108 (2011).
  42. Dull, T., et al. A third-generation lentivirus vector with a conditional packaging system. J Virol. 72 (11), 8463-8471 (1998).
  43. Rubinson, D. A., et al. A lentivirus-based system to functionally silence genes in primary mammalian cells, stem cells and transgenic mice by RNA interference. Nat Genet. 33 (3), 401-406 (2003).
  44. Inanc, B., et al. TRIP12's role in the governance of DNA polymerase beta involvement in DNA damage response and repair. Nucleic Acids Res. 53 (12), gkaf574 (2025).
  45. Li, J., et al. Overcoming temozolomide resistance in glioblastoma via enhanced NAD(+) bioavailability and inhibition of poly-ADP-ribose glycohydrolase. Cancers (Basel). 14 (15), 3572 (2022).
  46. Yang, Y., Zhang, N., Zhang, G., Sauve, A. A. NRH salvage and conversion to NAD(+) requires NRH kinase activity by adenosine kinase. Nat Metab. 2 (4), 364-379 (2020).
  47. Yang, Y., Mohammed, F. S., Zhang, N., Sauve, A. A. Dihydronicotinamide riboside is a potent NAD(+) concentration enhancer in vitro and in vivo. J Biol Chem. 294 (23), 9295-9307 (2019).
  48. Nowak, K., et al. Engineering Af1521 improves ADP-ribose binding and identification of ADP-ribosylated proteins. Nat Commun. 11 (1), 5199 (2020).
  49. Kalisch, T., Ame, J. C., Dantzer, F., Schreiber, V. New readers and interpretations of poly(ADP-ribosyl)ation. Trends Biochem Sci. 37 (9), 381-390 (2012).
  50. Barkauskaite, E., et al. The recognition and removal of cellular poly(ADP-ribose) signals. FEBS J. 280 (15), 3491-3507 (2013).
  51. Karlberg, T., Langelier, M. F., Pascal, J. M., Schuler, H. Structural biology of the writers, readers, and erasers in mono- and poly(ADP-ribose) mediated signaling. Mol Aspects Med. 34 (6), 1088-1108 (2013).
  52. Krietsch, J., et al. Reprogramming cellular events by poly(ADP-ribose)-binding proteins. Mol Aspects Med. 34 (6), 1066-1087 (2013).
  53. Li, M., Lu, L. Y., Yang, C. Y., Wang, S., Yu, X. The FHA and BRCT domains recognize ADP-ribosylation during DNA damage response. Genes Dev. 27 (16), 1752-1768 (2013).
  54. Teloni, F., Altmeyer, M. Readers of poly(ADP-ribose): designed to be fit for purpose. Nucleic Acids Res. 44 (3), 993-1006 (2016).
  55. Furman, J. L., Mok, P. W., Shen, S., Stains, C. I., Ghosh, I. A turn-on split-luciferase sensor for the direct detection of poly(ADP-ribose) as a marker for DNA repair and cell death. Chem Commun (Camb). 47 (1), 397-399 (2011).
  56. Krastev, D. B., et al. Coupling bimolecular PARylation biosensors with genetic screens to identify PARylation targets. Nat Commun. 9 (1), 2016 (2018).
  57. Serebrovskaya, E. O., et al. Genetically encoded fluorescent sensor for poly-ADP-ribose. Int J Mol Sci. 21 (14), 5004 (2020).
  58. Challa, S., et al. Development and characterization of new tools for detecting poly(ADP-ribose) in vitro and in vivo. Elife. 11, e72464 (2022).
  59. Hanzlikova, H., et al. The importance of poly(ADP-ribose) polymerase as a sensor of unligated Okazaki fragments during DNA replication. Mol Cell. 71 (2), 319-331.e3 (2018).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Aktywacja PARP1odpowiedź na genotoksynypolia DPRodpowiedź na uszkodzenia DNAfluorescencyjny test reporterowymikroskopia konfokalnatransdukcja lentiwirusowaanaliza w programie ImageJkwantyfikacja ognisk PAR
Wizualizacja i ilościowa analiza aktywacji PARP1/PARP2 indukowanej genotoksinami w komórkach z wykorzystaniem reportera opartego na białku fuzyjnym fluorescencyjnym
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.