Artykuł metodologiczny

Zoptymalizowany protokół dla zakażenia Candida albicans w Schmidtea mediterranea do badania patogenezy grzybów i obrony gospodarza

DOI:

10.3791/70500

⸱

17 kwietnia 2026

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Molecular and Cell Biology, University of California, Merced, 2Quantitative and Systems Biology Graduate Program, University of California, Merced, 3Health Sciences Research Institute, University of California, Merced, 4Center for Cellular and Biomolecular Machines, University of California, Merced

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protokół ten stanowi zoptymalizowany, szczegółowy przewodnik po wykorzystaniu planarialnej Schmidtea mediterranea jako modelu do badania interakcji gospodarz-patogen podczas infekcji grzybiczej. Metoda opiera się na wcześniejszej procedurze infekowania planarii ludzkim patogenem grzybowym Candida albicans, dostarczając szczegółowych wskazówek mających na celu zwiększenie powtarzalności i spójności eksperymentów.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Candida albicans to powszechny oportunistyczny patogen grzybowy, który bezobjawowo kolonizuje większość ludzi. Chociaż dysbioza wywołana stosowaniem antybiotyków, zaburzenia odporności lub uszkodzenia bariery nabłonkowej zazwyczaj są łagodne, mogą wywołać nadmierny wzrost i infekcje grzybiczne, od powierzchownych chorób błony śluzowej po zagrażającą życiu kandydozę ogólnoustrojową. Potrzebne są nowe przedkliniczne modele infekcji, aby rozłożyć patogenezę C. albicans in vivo na różnych stadiach infekcji i z różnymi mierzalnymi wynikami gospodarza. Planarialna Schmidtea Mediterranean została wcześniej ustanowiona jako gospodarz bezkręgowców do badania interakcji gospodarz z patogenem podczas infekcji C. albicans . S. mediterranea opiera się całkowicie na zachowanych mechanizmach odporności wrodzonej, zdolnych do zwalczania infekcji patogennymi mikroorganizmami, w tym bakteriami i grzybami. Niezwykła zdolność regeneracyjna planarian oraz dostępne populacje komórek macierzystych czynią ten organizm łatwym modelem do analizy wczesnych odpowiedzi immunologicznych, naprawy tkanek oraz oczyszczania patogenów in vivo. Model ten wspiera jednoczesną analizę zjadliwości grzybów oraz odpowiedzi transkrypcyjnej gospodarzy, dostarczając cennych informacji o dynamice infekcji. Przedstawiono tutaj zaktualizowany protokół z szczegółowymi modyfikacjami, ustandaryzowanymi procedurami i zoptymalizowanymi krokami infekowania S. mediterranea C. albicans, zaprojektowany w celu zwiększenia powtarzalności i umożliwienia systematycznych badań patogenezy grzybów i obrony gospodarza.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Candida albicans to powszechny oportunistyczny patogen grzybowy, który bezobjawowo kolonizuje 50-70% ludzi 1,2,3. Zazwyczaj jako nieszkodliwy kommensal, C. albicans może się rozrastać w takich warunkach jak zaburzenia równowagi mikrobioty, stosowanie antybiotyków, immunosupresja, zaburzenia bariery nabłonkowej lub obecność urządzeń medycznych, prowadząc do chorób od powierzchownych infekcji śluzówki po zagrażającą życiu kandydozą ogólnoustrojową 4,5. U osób z obniżoną odpornością – w tym z HIV/AIDS, pacjentów poddawanych chemioterapii lub terapiom immunosupresyjnym, osobom z chorobami przewlekłymi lub przebywającym na oddziałach intensywnej terapii – śmiertelność może przekraczać 70%, co podkreśla znaczące obciążenie zdrowotne inwazyjne kandydozy 6,7,8. Na całym świecie inwazyjne infekcje grzybicze dotykają ponad 6,5 miliona osób rocznie, a bezpośrednie koszty opieki zdrowotnej w samych Stanach Zjednoczonych przekraczają 8 miliardów dolarów rocznie dla zakażeń związanych z Candida. Pomimo dostępnych środków przeciwgrzybiczych, wskaźniki zachorowalności i śmiertelności związane z zakażeniami C. albicans pozostają w dużej mierze niezmienione przez dziesięciolecia, co podkreśla pilną potrzebę lepszego zrozumienia interakcji gospodarz-patogen w chorobach grzybowych.

C. albicans wykorzystuje różnorodny repertuar czynników zjadliwości, które wspierają kolonizację, trwałość i patogenezę w różnych środowiskach gospodarza. Należą do nich adhezja do tkanek gospodarza, unikanie odporności, przebudowa ściany komórkowej, wydzielanie enzymów hydrolitycznych, plastyczność morfologiczna oraz tworzenie biofilmu 11,12,13,14,15,16. Łącznie te cechy pozwalają C. albicans adaptować się do różnorodnych nisz gospodarzy, modulować odpowiedzi immunologiczne oraz opierać się terapiom przeciwgrzybiczym 16,17,18,19,20,21. Wyjaśnienie, jak te procesy wpływają na wyniki zakażeń – w tym zachorowalność gospodarzy, śmiertelność oraz usuwanie patogenów – jest niezbędne do opracowania skuteczniejszych strategii profilaktycznych i terapeutycznych.

Aby zbadać tę dynamikę gospodarz-patogen, stworzyliśmy system modelowy, wykorzystujący planarialną Schmidtea Mediterranean jako gospodarza 22,23,24. Model ten służy jako wszechstronna platforma do badania wielosystemowej odpowiedzi gospodarzy na infekcje grzybiczne, wykorzystując metodę zakażenia opartą na moczeniu, która umożliwia synchroniczne narażenie zwierząt na C. albicans. Poniższa sekcja przedstawia zaktualizowane, krok po kroku procedury, które udoskonalają ten protokół, poprawiają powtarzalność i ułatwiają spójną implementację w laboratoriach.

Planarii to wolnożyjące bezkręgowce o wyjątkowej zdolności regeneracyjnej, zdolne do szybkiego uzupełniania tkanek utraconych w wyniku urazu lub infekcji25. Nie mają adaptacyjnego układu odpornościowego i polegają całkowicie na zachowanych wrodzonych mechanizmach obronnych – w tym receptorach rozpoznawania wzorców, peptydach przeciwdrobnoustrojowych, wydzielaniu śluzu oraz komórkach fagocytowych – aby oczyścić patogeny bakteryjne i grzybowe w ciągudni 26, 27, 28, 29. Ponieważ odporność wrodzona stanowi pierwszą linię obrony wśród eukariontów i pozostaje niedostatecznie zbadana poza systemami ssaków27, planarie dają możliwość badania tych procesów in vivo z rozdzielczością komórkową i molekularną. Ich zdolność regeneracyjna jest napędzana przez dorosłe pluripotentne komórki macierzyste, zwane neoblastami, które stanowią około 30% komórek dorosłych i przyczyniają się do regeneracji po infekcji23,30. Te cechy czynią S. mediterranea potężnym modelem do rozkładania zjadliwości patogenów i obrony gospodarza na skali genetycznej, komórkowej, tkankowej i organizmowej, umożliwiając rozwiązywanie pytań często trudnych do badania przy użyciu tradycyjnych systemów ssaków.

Dodatkowo, niewielki rozmiar planarii (zazwyczaj kilka milimetrów długości), niskie koszty i łatwośćutrzymania umożliwiają przeprowadzanie eksperymentów na dużą skalę, unikając jednocześnie ograniczeń finansowych, etycznych i regulacyjnych charakterystycznych dla modeli kręgowców. Podobnie jak C. albicans, S. mediterranea jest genomowo łatwa do przejścia, posiada w pełni zsekwencjonowany i adnotowany genom, a także wspiera zaawansowane techniki molekularne i komórkowe – w tym profilowanie transkrypcyjne, wysokorozdzielczą immunohistochemię i histologię oraz odporną interferencję RNA (RNAi)32,33,34,35,36,37,38 . Narzędzia te umożliwiają równoległą analizę odpowiedzi gospodarza i patogenu podczas infekcji.

Do badania infekcji grzybiczych zastosowano kilka alternatywnych modeli przedklinicznych. Bezkręgowcy żywiciele, tacy jak Galleria mellonella (ćma woska), Caenorhabditis elegans (gąsta) i Drosophila melanogaster (muszka owocowa), a także kręgowiec Danio rerio (danio danio), każdy z nich oferuje unikalne korzyści eksperymentalne, ale ma też istotne ograniczenia. Systemy te często polegają na przeżyciu jako głównym celu, ponieważ infekcje szybko wywołują śmierć gospodarza, uniemożliwiając szczegółową ocenę zachorowalności, regeneracji i odpowiedzi wielosystemowych – cechy, które model planariański łatwo uwzględnia.

Modele ssaków, takie jak Mus musculus (mysz), Rattus norvegicus (szczur), Oryctolagus cuniculus (królik) oraz Cavia porcellus (świnka morska), lepiej oddają fizjologię człowieka, ale są ograniczone wysokimi kosztami, małymi grupami, wymogami etycznymi i regulacyjnymi oraz wyzwaniem odróżnienia wrodzonej od adaptacyjnej odpowiedzi immunologicznej. Co więcej, dekady badań nad patogenezą grzybów u myszy koncentrowały się głównie na zaawansowanych stadiach infekcji ogólnoustrojowych 39,40,41,42,43, często pomijając wczesne zdarzenia, takie jak zakłócenia bariery nabłonkowej i przerost błony śluzowej – najczęstsze drogi inicjacji choroby grzybowej u ludzi 44,45,46.

Badanie interakcji gospodarz z patogenem jest zatem niezbędne dla zrozumienia procesów biologicznych leżących u podstaw zjadliwości grzybów, obrony gospodarza i postępu choroby. Inwazyjne infekcje grzybicze stanowią narastające globalne zagrożenie, ponieważ wiele gatunków wykazuje obecnie odporność na wszystkie główne klasy leków przeciwgrzybiczych. Szacuje się, że ponad miliard osób jest dotknięty infekcjami grzybiczymi, a czynniki takie jak zmiany klimatu, powszechne stosowanie środków przeciwdrobnoustrojowych oraz rosnąca liczba osób immunokompromitowanych przyspieszają pojawianie się patogenów opornych na środki przeciwgrzybicze 47,48,49,50 . Zrozumienie, jak patogenne grzyby kolonizują i oddziałują ze swoimi gospodarzami, jest kluczowe dla opracowania nowych strategii profilaktycznych i terapeutycznych.

Poniżej opisano zrewidowany i ustandaryzowany protokół infekcji systemowej dla interakcji S. mediterranea-C. albicans, zaprojektowany w celu promowania powtarzalności oraz umożliwienia systematycznych badań patogenezy grzybów i mechanizmów obronnych gospodarza. Oryginalny protokół był stosowany w wcześniejszych publikacjach22, 23, 24. Tabela 1 podsumowuje kluczowe aktualizacje zawarte w tej zrewidowanej wersji, w tym ulepszenia procedur szczepienia grzybów, zmniejszenie objętości studni, określone kryteria włączenia zwierząt, określenie dawek zakaźnych i śmiertelnych oraz zaktualizowane zalecenia dotyczące hodowli zwierząt. Ten proces zawiera szczegółowe wskazówki dotyczące hodowli C. albicans, zakażania planarii poprzez ekspozycję na moczenie oraz oceny zjadliwości grzybów i odpowiedzi gospodarza na podstawie jakościowych i ilościowych odczytów w warunkach objawowych i śmiertelnych (Rysunek 1). Zoptymalizowane procedury przedstawione tutaj uwzględniają zmienne empirycznie zidentyfikowane jako kluczowe determinanty dynamiki infekcji i wyników gospodarza, co poprawia powtarzalność i umożliwia systematyczną ocenę interakcji gospodarz–patogen.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protokół ten opiera się na wcześniejszych metodach22, 23, 24 i ustanawia jasne, standaryzowane procedury zwiększające powtarzalność oraz umożliwiające systematyczne badania patogenezy grzybów i odpowiedzi gospodarzy w S. mediterranea. Kluczowe udoskonalenia protokołu obejmują wcześniej określone kryteria włączenia i wykluczenia zwierząt, standaryzowane przygotowanie mikroorganizmów oraz kompleksową ocenę punktów końcowych gospodarza.

Wszystkie procedury muszą być wykonywane przy użyciu odpowiednich technik sterylnych i aseptycznych o poziomie bezpieczeństwa biologicznego poziomu 2. Standardowy sprzęt ochrony osobistej (PPE) laboratoryjny, w tym rękawiczki, fartuch laboratoryjny i buty z zamkniętymi palcami, powinien być noszony przez cały czas. Procedury z udziałem planarialnego S. mediterranea przeprowadzono zgodnie z wytycznymi instytucjonalnymi dotyczącymi etycznego stosowania bezkręgowców.

Wszystkie udoskonalenia protokołu są podsumowane w Tabeli 1. Wszystkie odczynniki, sprzęt krytyczny, media, bufory i receptury immunobarwienia są wymienione w Tabeli Materiałów oraz Tabeli 2.
UWAGA: Wszystkie procedury dotyczące modelu bezkręgowca S. mediterranea powinny być przeprowadzane w celu zapewnienia najwyższych standardów dobrostanu zwierząt. S. mediterranea powinna być przechowywana w zoptymalizowanych warunkach symulujących naturalne siedliska. Eksperymenty powinny być projektowane tak, aby minimalizować potencjalny ból lub niepokój, aby zapewnić etyczne leczenie przez cały czas trwania badania.

1. Hodowla grzybowa

  1. Informacje o szczepach C. albicans
    1. Standardowy szczep laboratoryjny C. albicans SN25051 był używany jako szczep typu dzikiego we wszystkich eksperymentach i jest publicznie dostępny w Fungal Genetics Stock Center (http://www.fgsc.net/). SN250 pochodzi z izolatu klinicznego SC5314, pierwotnie pobranego z posiewu krwi pacjenta z rozpuszczoną kandydozą52.
    2. Szczepy C. albicans utrzymują się w stężeniu 25% glicerolu przy −80°C.
  2. Hodowla szczepów C. albicans pod kątem infekcji
    1. Smugi z materiału kriogenicznego
      1. Używając sterylnego aplikatora, nanieś pożądany szczep z wywaru −80°C na płytki agarowe z ekstraktu drożdżowego peptonu (YPD) (1% ekstrakt drożdżowy, 2% pepton, 2% glukozy; pH 6,8).
      2. Inkubować statycznie w temperaturze 30°C przez 72 godziny.
  3. Przygotowanie kultur nocnych
    1. Zaszczep pojedynczą kolonię na 4 mL płynnego YPD w sterylnych probówkach hodowli szkła borokrzemowego (18 mm × 150 mm) za pomocą sterylnego aplikatora.
    2. Zawiera rurkę z ujemnym kontrolowaniem zawierającą niezaszczepiony YPD w identycznych warunkach.
    3. Luźno zakręć rurki, aby umożliwić napowietrzanie i inkubuj przez noc (16 godzin) w 30 °C z potrząsaniem przy 220 obr./min (orbitalnie) w inkubatorze drżącym.
      UWAGA: Jeśli wzrost mikroorganizmów występuje w kontroli ujemnej, przerwij eksperyment i rozpocznij od nowa z nowym medium oraz techniką sterylną.
  4. Komórki zbierania i płukania
    1. Stosując technikę aseptyczną, przenosi się hodowle do oznakowanych rurek wirówek o pojemności 15 mL.
    2. Hodowla wirówka trwa 5 minut przy ~3 000 × g , aby rozpylić komórki.
    3. Ostrożnie usuń supernatant YPD, nie naruszając granulacji.
    4. Ponownie zawiesić pellet w wodzie planariańskiej (patrz Tabela 2 dla składu) w objętości równej objętości użytej przez YPD.
    5. Dokładnie wymieszaj przez wirowanie.
    6. Powtórz kroki 1.4.2-1.4.4 jeszcze dwa razy, aby całkowicie usunąć podłoże wzrostowe.
    7. Po ostatnim płukaniu ponownie zawiesij pellet komórkowy w słodkiej wodzie planariańskiej poprzez wirowanie.
  5. Ilościowe określenie stężenia komórek C. albicans
    1. Rozcieńczenie do pomiaru OD
      1. Przygotuj trzy sterylne rurki mikrowirówki o pojemności 1,7 mL z rozcieńczeniem 1:20 (50 μL hodowli + 950 μL wody planariańskiej) lub alternatywnym wybranym czynnikiem rozcieńczającym. Wymieszaj dokładnie.
      2. Przygotuj pustą probówkę zawierającą 1000 μL wody planariańskiej.
    2. Spektrofotometria
      1. Ustaw spektrofotometr do pomiaru gęstości optycznej na 600 nm (OD600).
      2. Wyłącz spektrofotometr wodą planarianą.
      3. Zmierz OD600 dla każdej rozcieńczonej próbki i zapisz wartości.
      4. Uśrednij trzy odczyty i pomnóż przez współczynnik rozcieńczenia, aby określić OD600 hodowli zwierząt. Przelicz OD600 na stężenie komórek.
        UWAGA: Współczynnik konwersji gęstości optycznej powinien być określany empirycznie dla każdego spektrofotometru. W zależności od zastosowanego instrumentu, OD600 równy 1 odpowiada około 2 ×10 7 komórek C. albicans/mL53.
  6. Określanie eksperymentalnych stężeń inokulum
    1. Przygotuj pożądane stężenie inokulum dla każdego warunku eksperymentalnego.
      UWAGA: Wykonaj co najmniej trzy biologiczne replikacje, aby określić skuteczną dawkę dla kolonii planariańskiej, szczególnie dla punktów końcowych zakaźnych lub śmiertelnych. Reprezentatywne obliczenia do przygotowania zakaźnych i śmiertelnych stężeń inokulum znajdują się w Pliku Uzupełniającym 1.

2. Gatunki planarialne i utrzymanie

  1. Gatunki planarialne i utrzymanie
    1. Do wszystkich eksperymentów używaj bezpłciowej linii klonalnej CIW4 planarialnej S. mediterranea .
    2. Utrzymuj kolonie planariów w przezroczystych, spożywczych plastikowych pojemnikach zawierających 1 500–2 000 mL wody 1× planarii.
    3. Przechowywaj pojemniki w ciemności w temperaturze 20 °C, z luźno zamkniętymi pokrywkami, aby umożliwić wymianę gazów.
    4. Nie lecz planarii antybiotykami.
  2. Utrzymanie kolonii i żywienie
    1. Karm kolonie świeżo przecedzionymi purée z wątróbki wołowej raz w tygodniu.
    2. Myj pojemniki dwa razy w tygodniu.
    3. Utrzymuj gęstość planariów na poziomie 200–400 osobników w pojemniku. Wcześniejsze prace demonstrują szczegółowe procedury przygotowania kolonii i długoterminowego utrzymania31.
  3. Warunkowanie przed eksperymentem
    1. Przed eksperymentalnym zakażeniem głodzi planariany przez 7–12 dni, aby ustandaryzować warunki metaboliczne i rozmiarowe.
    2. Dla każdego warunku eksperymentalnego używaj grup po 5–10 zwierząt na odwiert. Zapewnij równą liczbę zwierząt we wszystkich warunkach, w tym pozytywnych i negatywnych kontroli.
  4. Wybór rozmiaru zwierzęcia
    1. Wybrane planarie o długości około 5 mm, co odpowiada ~5 × 10 5komórek gospodarza na zwierzę54.
    2. Unikaj stosowania planarii mniejszych niż 5 mm, ponieważ zwierzęta tej wielkości mogą mieć osobniki z blastemami lub niepełnym rozwojem, co może powodować nieregularne rezultaty.
    3. Unikaj stosowania planarii większych niż 5 mm, ponieważ większe zwierzęta są mniej odpowiednie do fluorescencyjnego immunobarwienia.
    4. Stosuj planarie o długości około 5 mm przy ustalaniu warunków dawki zakaźnej (ID 50) i dawki śmiertelnej (LD50).
      UWAGA: Aby umożliwić spójny wybór rozmiarów, wydrukuj siatkę odniesienia o wymiarach 5 mm × 5 mm i umieść ją w plastikowej koszulce na segregator pod przezroczystym pojemnikiem planarianym. Upewnij się, że planarie są całkowicie wyprostowane przed pomiarem długości.
  5. Kryteria zdrowotne i włączenia
    1. KLUCZOWY KROK: Przed użyciem obejrzyj wszystkie planariuszy pod stereomikroskopem.
    2. Wyklucz zwierzęta z widocznymi uszkodzeniami lub obrażeniami, w tym z następującymi warunkami:
      1. Obecność blastemów (tkanek pozbawionych pigmentacji) lub niepełny rozwój pigmentacji.
      2. Nieprawidłowe pigmentacje, takie jak znacznie ciemniejsze obszary.
      3. Brakujące lub uszkodzone tkanki.
      4. Zmiany lub blizny.
      5. Otwarte rany.
      6. Nieprawidłowości morfologiczne lub deformacje.
      7. Każda przewlekła lub niegojąca się choroba.
    3. Wyklucz zwierzęta z nieprawidłowościami rozwojowymi.
      1. Podzielone lub zdublowane obszary głowy lub ogona.
      2. Deformowana lub asymetryczna morfologia ciała.
      3. Niewłaściwa liczba fotoreceptorów (akceptowalna jest tylko jedna para obustronna).
      4. Nienaturalnie ułożone gardło gardłowe.
      5. Wadliwe rzęski prowadzące do zaburzonej ruchliwości lub nieregularnego ślizgania się.
    4. Uwzględniać tylko zwierzęta o długości około 5 mm, w pełni rozwinięte i wolne od widocznych urazów lub nieprawidłowości.
  6. Przygotowanie talerza
    1. Przenieś zdrowe planarie spełniające wszystkie kryteria włączenia do 2 mL świeżej wody planariańskiej na odwierć w 6-dołkowej płycie polistyrenowej, która nie jest poddana hodowli tkankowej.
      UWAGA: Przenieś zwierzęta dzień przed zakażeniem, aby umożliwić aklimatyzację do nowego środowiska i gęstości populacji.
    2. Przypisz studnie do następujących warunków eksperymentalnych:
      1. Negatywne kontrole: zwierzęta niezainfekowane lub poddawane pozornemu leczeniu.
      2. Pozytywna kontrola: zwierzęta zakażone dzikim typem C. albicans.
    3. Usuń i zamień całą wodę na 2 mL świeżej wody planariańskiej, aby zapewnić jednolitość w studniach.

3. Przygotowanie do infekcji

  1. Przygotuj szczepienie (patrz Plik Uzupełniający 1 dla obliczeń próbki)
    1. Stosując technikę aseptyczną, delikatnie usuń całą wodę z płyty 6-dołkowej, przechylając płytkę w stronę użytkownika.
    2. Dodaj obliczoną objętość wody planariańskiej do każdej studni.
      UWAGA: Rób to po jednym, aby zapobiec wysychaniu zwierząt.
    3. Dodaj obliczoną objętość hodowli C. albicans do każdego odwiertu.
      UWAGA: Unikaj długotrwałego narażania zwierząt na powietrze, ponieważ suszenie może powodować stres i wpływać na wyniki infekcji.
  2. Eksperymentalne warunki inkubacji płytek
    1. Umieść zaszczepioną płytkę z 6 dołkami w ciemnym, statycznym miejscu w temperaturze pokojowej.
    2. Przechowywanie płytek eksperymentalnych w oddzielnym obszarze od niezakażonych kolonii planarii, aby zapobiec zanieczyszczeniu krzyżowemu.
    3. Zanotuj datę i godzinę szczepienia (oznaczoną jako czas 0 h).
      UWAGA: Unikaj miejsc o dużym natężeniu ruchu lub podatnych na wibracje (np. szuflady, powierzchni instrumentów czy zatłoczonych blatów stołowych), ponieważ ruch może stresować zwierzęta i zakłócać wyniki.
    4. Inkubować planarie C. albicans przez maksymalnie 72 godziny, w zależności od pożądanego punktu końcowego.
  3. Rezawisija komórek grzybowych
    1. W każdym momencie delikatnie zawieszaj osiadłe komórki C. albicans, nie przeszkadzając planarii.
      UWAGA: Czas (godziny [h] lub dni [d] po infekcji) odnosi się do czasu upływu od pierwszego narażenia (czas 0).
    2. Po 24 godzinach po zakażeniu (HPI)
      1. Używając sterylnej pipety transferowej o pojemności 3 mL, lekko przechyl płytkę w stronę użytkownika.
      2. Wdech wodę planarialną i delikatnie wlej ją do części studni wolnej od zwierząt, aby wymieszać osiadłą warstwę grzybów.
      3. Powtarzaj ten krok 5–10 razy na studnię, aby rozbić osiadłą warstwę grzybów, unikając bezpośredniego kontaktu z planariami.
      4. Obserwuj osadzanie grzybów na ciemnym tle, aby uzyskać najlepszą widoczność przed i po etapach ponownego zawieszenia.
      5. Ponownie zawiesij niezakażone studnie kontrolne w identycznych warunkach.
    3. Przy mocy 48 KM
      1. Powtórz procedurę ponownego zawieszenia opisaną powyżej.
      2. Wszystkie kroki ponownego zawieszenia wykonuj w ciągu ± godziny od wyznaczonego czasu.
  4. Koniec ekspozycji (72 hpi)
    1. Przy mocy 72 hpi delikatnie przenieś planarie na nową płytkę z 6 dołkami zawierającą 2 mL świeżej wody planarii na odwiert.
    2. Minimalizuj przenoszenie hodowli grzybów, używając jak najmniejszej ilości płynu.
    3. Po przeniesieniu zwierząt usuń całą wodę i zamień ją świeżą, planarialną wodą.
      UWAGA: Delikatnie obchodzić się ze zwierzętami i fragmentami tkanek, aby uniknąć urazów mechanicznych lub dodatkowego obciążenia.

4. Ocena punktów końcowych hosta

  1. Rejestrowanie wyników hostów
    1. Rozpocznij ocenę wyników u gospodarza po 1 dniu po zakażeniu (dpi) i kontynuuj codziennie aż do pożądanego eksperymentalnego punktu końcowego.
    2. Ilościowo określ uszkodzenia gospodarza za pomocą standaryzowanego systemu punktacji 0–3 (Rysunek 2).
      Wynik 0: Brak zmian u niezakażonych kontrolnych (zdrowych, bezobjawowych).
      Wynik 1: Łagodne objawy.
      Wynik 2: Ciężkie objawy.
      Ocena 3: Śmierć.
  2. Kryteria oceny objawów gospodarza
    1. Wynik 0 (bezobjawowy):
      1. Zidentyfikuj zwierzęta wykazujące prawidłową morfologię, pigmentację, zachowanie i reakcję, bez zauważalnych zmian w porównaniu do niezakażonych kontroli.
    2. Ocena 1 (łagodna):
      Przypisz łagodny wynik, gdy zaobserwowano co najmniej jeden z poniższych objawów w porównaniu do osób kontrolnych bezobjawowych.
      1. Zmniejszona prędkość ruchu lub nieprawidłowe zachowanie ślizgowe.
      2. Częściowa lub całkowita utrata odpowiedzi fototaktycznej.
      3. Długotrwałe lub powtarzające się skurcze ciała.
      4. Nieprawidłowe lub niejednorodne pigmentacje (jaśniejsze lub ciemniejsze obszary).
      5. Regresja tkanki głowy lub ogona.
    3. Ocena 2 (Ciężka):
      Przypisz ocenę ciężką, gdy jeden lub więcej z poniższych objawów występuje podczas życia zwierząt.
      1. Filmy oczne lub utrata jednego lub obu oczu.
      2. Całkowita utrata głowy lub zauważalne uszkodzenie tkanek przednich.
      3. Znaczna utrata tkanek w okolicy przedgardła.
      4. Fragmentacja na wiele obszarów ciała (cephalic, phathroatgeal, lub tylne segmenty).
      5. Otwarte rany z wydzielaniem śluzu lub bez niego lub wewnętrznym przeciekiem.
      6. Częściowa liza tkanek skutkuje utratą integralności strukturalnej.
      7. "Postawa ciała w kształcie litery C", paraliż lub poważne zaburzenia ruchliwości.
    4. Ocena 3 (Śmierć):
      Zidentyfikuj śmierć na podstawie jednego lub więcej z poniższych kryteriów.
      1. Cała liza tkanek lub całe zwierzę.
      2. Całkowita utrata reakcji na bodźce.
      3. Brak możliwości regeneracji lub regeneracji.
        UWAGA: Rysunek 2 przedstawia reprezentatywne obrazy i cechy definiujące każdy wynik, aby zapewnić spójną klasyfikację fenotypu gospodarza.

5. Określenie przeżycia gospodarza po ekspozycji na grzyby

  1. Po 3 dpi delikatnie przenieś planariuszy na nową płytkę z 6 dołkami zawierającą 2 mL świeżej wody planariańskiej na odwiert, unikając transferu pozostałości kultury grzybów.
  2. Obserwuj zwierzęta za pomocą mikroskopii świetlnej (≥ obiektyw 10x).
  3. Zapisz wyniki gospodarzy za pomocą standaryzowanej tabeli punktacji udostępnionej w Pliku Uzupełniającym 2.
  4. Określanie żywych zwierząt
    1. Zidentyfikuj żywe zwierzęta na podstawie jednego lub więcej z poniższych kryteriów.
      1. Negatywna fototaksja.
      2. Odpowiedź na delikatne zaburzenie pipety transferowej.
      3. Nienaruszona budowa ciała.
      4. Stabilne mocowanie do płyty.
  5. Ustalanie martwych zwierząt
    1. Zidentyfikuj martwe zwierzęta na podstawie jednego lub więcej z następujących kryteriów.
      1. Całkowita liza lub dezintegracja (tylko pozostałości szczątkowe).
      2. Przezroczyste lub wyprute ciało.
      3. Brak ruchu lub reakcji na bodźce.
      4. Brak regeneracji (brak powstawania blastemy).
  6. Usuwanie martwych zwierząt
    1. Usuwaj martwe zwierzęta i zanieczyszczenia dopiero po potwierdzeniu nieżywotności pod mikroskopem.
    2. KLUCZOWY KROK: Natychmiast usuń martwe zwierzęta, aby zapobiec zanieczyszczeniu krzyżowemu lub zmianom pomiarów przeżywalności.
    3. Jeśli pozostały pozostałości zanieczyszczenia lub grzybów, przenieś ocalałe zwierzęta ponownie na świeżą płytę z czystą wodą planarianą, aby zapobiec ponownemu siewaniu C. albicans lub tworzeniu biofilmu.
      UWAGA: Podczas inspekcji wizualnej umieść płytki 6-dołkowe na ciemnym tle, aby poprawić kontrast i ułatwić ocenę fenotypu.

6. Ocena obciążenia grzybami

  1. Kwantyfikacja jednostek tworzących kolonie (CFU)
    1. W pożądanych punktach czasu zakażenia zbieraj planariany (5–10 zwierząt na każde schorzenie dziennie). Uwzględnij dopasowane niezainfekowane/mock kontrole oraz dzikie typy zainfekowane.
    2. Delikatnie przepłucz studnie dwa razy 2 mL świeżej wody planariańskiej, aby usunąć komórki C. albicans z tła.
    3. Przełóż planarie do sterylnych i oznakowanych rurek mikrowirówek o pojemności 1,7 mL lub 5,0 mL i usuń całą resztkową wodę.
    4. Dodaj 300 μL świeżej wody planariańskiej do każdej rurki.
    5. Ujednolicaj zwierzęta za pomocą sterylnego tłuczka, aż nie pozostaną duże fragmenty (około 30–45 s).
    6. Wykonaj szeregowe rozcieńczenia homogenatu (np. 1:10, 1:100, 1:1000).
    7. Płytka 100–200 μL każdej rozcieńczeniny na płytki agarowe YPD z dodatkiem po 50 μg/mL ampicyliny, ryfampicyny, streptomycyny i neomycyny. Rozprowadz równomiernie za pomocą sterylnych szklanych kulek lub sterylnego rozpraszacza komórek.
    8. Pozwól, by płyty pozostały pionowe na blacie stołu przez 5–10 minut po pokryciu, aby umożliwić wchłanianie płynu do agaru.
    9. Przygotuj potrójne talerze dla każdego rozcieńczenia i warunku.
    10. Inkubuj płytki w temperaturze 30 °C przez 48 godzin.
    11. Policz CFU i pomnóż przez współczynnik rozcieńczenia.
    12. Normalizuj wartości CFU do liczby planariów, aby obliczyć średnie CFU na jednego planaria i stan. Na przykład, jeśli zaobserwuje się 100 kolonii przy rozcieńczeniu 10× z homogenity 5 zwierząt, obliczona wartość to 200 CFU na zwierzę.

7. Immunofluorescencyjne barwienie przeciw Candida

  1. Ogólne kwestie dotyczące barwienia
    1. Wszystkie kroki wykonuj z delikatnym kołyszaniem orbitalnym (100–140 obr./min) w temperaturze pokojowej, chyba że zaznaczono inaczej. Zobacz Plik Uzupełniający 1 , aby poznać szczegóły dotyczące przeciwciał i źródła odczynników.
      UWAGA: Formaldehyd, siarczan sodu dodecylowy (SDS) oraz nadtlenek wodoru są substancjami niebezpiecznymi i muszą być traktowane zgodnie z instytucjonalnymi przepisami bezpieczeństwa. Formaldehyd jest toksyczny i klasyfikowany jako czynnik rakotwórczy; SDS jest iritujący; a nadtlenek wodoru to silny utleniacz, który może powodować oparzenia. Noś odpowiedni sprzęt ochrony osobistej (fartuch laboratoryjny, rękawice nitrylowe, buty z zamkniętymi palcami i gogle ochronne). Wykonuj procedury z udziałem lotnych odczynników w certyfikowanym chemicznym okapie i utylizuj odpady zgodnie z instytucjonalnymi wytycznymi dotyczącymi zdrowia i bezpieczeństwa środowiskowego.
  2. Zbieranie próbek
    1. Zbieraj zwierzęta z każdego warunku eksperymentalnego i punktu czasowego.
    2. Przełóż zwierzęta do oznaczonych fiolek scyntylacyjnych o pojemności 20 mL zawierających 2 mL wody planarialnej.
    3. Usuń cały płyn, opłukaj raz 2 ml świeżej wody planariańskiej, a potem ponownie cały płyn.
  3. Fiksacja i permeabilizacja
    1. Ofiary dla zwierząt zawierających 7,5% N-acetylocyterynę (NAC) w 1× PBS przez 3 minuty.
    2. Usuń roztwór i podłącz zwierzęta do 4% formaldehydu w 0,3% PBSTx przez 15 minut.
    3. Płukaj próbki dwa razy 1× PBS.
    4. Przepuszczaj próbki w 1% SDS przez 15 minut.
    5. Przepłukaj próbki trzy razy 1× PBS.
  4. Wybielanie
    1. Próbki wybielacza w nadtlenku wodoru 6% w 1× PBS pod jasnym światłem LED przez 4–12 godzin.
      UWAGA: Jeśli wybielanie nie może być przeprowadzone od razu, przechowuj stałe próbki w 1× PBS w temperaturze 4 °C przez maksymalnie tydzień lub susz je w 100% metanolu do długotrwałego przechowywania.
  5. Blokowanie i inkubacja przeciwciał
    1. Przenieś zwierzęta na płytki z 24 dołkami zawierającymi 1× PBS.
    2. Blokuj niespecyficzne wiązanie w 2,5% PBS-TB (PBS zawierające tryton X-100 i albuminę surowicy bydłej) przez 4 godziny w temperaturze pokojowej lub 8 godzin w 4 °C.
    3. Inkubuj próbki z pierwotnym przeciwciałem przeciw Candida (1:500 w PBS-TB) przez 4 godziny w temperaturze pokojowej lub 8 godzin w temperaturze 4 °C.
    4. Usuwaj pierwotne przeciwciała i płucz próbki osiem razy co 20 minut z 0,3% PBSTx (łącznie ~2,5 h).
    5. Inkubuj próbki z przeciwciałem wtórnym przeciw królikom sprzężonym z Alexa-568 (1:800 w PBS-TB) przez 4 godziny w temperaturze pokojowej lub 8 godzin w 4 °C.
      UWAGA: Chroń próbki przed światłem, aby zapobiec fotobieleniu. Roztwory przeciwciał mogą być ponownie używane.
    6. Usuwaj przeciwciała wtórne i myj próbki osiem razy co 20 minut z 0,3% PBSTx.
  6. Opcjonalne mocowanie zamka
    1. Umieść zwierzęta na szkiełku mikroskopowym tak, że wszystkie są zwrócone do przodu do góry.
    2. Usuń nadmiar wody za pomocą pipety transferowej.
    3. Ostrożnie wchłaniaj pozostałą ciecz z krawędzi za pomocą krawędzi ręcznika papierowego.
    4. Dodaj 150–175 μL medium montażowego Gelvatol (Tabela 2 do składu) krople, aż zwierzęta będą całkowicie przykryte.
    5. Ostrożnie załóż na próbkę slip, unikając pęcherzyków powietrza.
    6. Pozwól Gelvatolowi zastygnąć co najmniej 2 godziny przed obrazowaniem.
    7. Sklepowe zjeżdżalnie znajdują się w chłodnym, ciemnym miejscu dla długoterminowej konserwacji.
  7. Obrazowanie
    1. Próbki obrazów wykorzystują wzbudzenie żółto-zielone (~578 nm) i obserwują emisję pomarańczowo-czerwoną (~603 nm).
    2. Użyj obiektywu 2x, aby zwizualizować wzory barw całych zwierząt.

8. Rozwiązywanie problemów

  1. Jeśli wyniki zakażeń są niespójne, należy wykonać krzywą dawki i titraci przy użyciu dzikiego typu SN250 lub innego szczepu bazowego w przyrastkach po 5–10 × 107 komórek /mL.
  2. Wykonaj co najmniej trzy biologiczne replikacje zawierające od 5 do 10 zwierząt na grupę.
  3. Uwzględnij grupy kontroli negatywnej i dodatniej, aby zidentyfikować potencjalne problemy, takie jak zanieczyszczenie krzyżowe, awaria techniki aseptycznej, problemy z żywotnością szczepu lub słaby stan zdrowia zwierząt.
  4. Po zakończeniu eksperymentu dawkowo-titracyjnego, pula replikuje się, aby określić medianę przeżycia w grupie.
  5. Analizuj różnice w przeżywalności za pomocą parowej analizy logarytmicznej rangi Mantela–Coxa.
  6. Wykorzystaj analizę przeżycia Kaplana–Meiera do oceny różnic w czasie śmierci między szczepami lub metodami leczenia.
  7. W przypadku stanów dawki subletalnej lub zakaźnej analizuj objawowe wyniki gospodarza (np. łagodne lub ciężkie fenotypy albo kolonizacja grzybów) zamiast przeżywalności.
  8. Porównaj odpowiedzi gospodarza w różnych grupach dawek, aby określić odpowiedni zakres dawki zakaźnej lub śmiertelnej dla kolejnych eksperymentów.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przedstawiono zaktualizowany protokół zakażania planarii C. albicans (rysunek 1) oraz systematycznego ilościowego określania wyników gospodarzy (rysunek 2). Ten udoskonalony sposób pracy wspiera solidną ocenę wielu parametrów infekcji, w tym zachorowalności (objawowe nasilenie choroby), przeżycia (śmiertelność), obciążenia grzybami (CFU) oraz dynamiki przestrzenno-czasowej kolonizacji patogenów (fluorescencyjne immunobarwienie). W przeciwieństwie do wię...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zmiana dawki zakaźnej dzikiego typu C. albicans powoduje powtarzalne, zależne od dawki różnice w zachorowalności u S. mediterranea, podkreślając wrażliwość modelu na ilościową ocenę zjadliwości grzybów. Protokół ten określa strategie ustalania podstawowych dawek zakaźnych i śmiertelnych w koloniach planaricznych utrzymywanych laboratoryjnie oraz przedstawia kryteria potwierdzania skutecznego zakażenia ogólnoustrojowego poprzez moczenie, integrując ocenę zdrowia gospodarza z pomiarami obciążenia grzybami...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

C.J.N. jest współzałożycielem BioSynesis, Inc., firmy rozwijającej diagnostykę i terapię w przypadku infekcji biofilmem. Wszyscy inni autorzy deklarują brak konkurencyjnych interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy dziękują wszystkim członkom laboratoriów Nobile, Oviedo i Hernday za wnikliwe dyskusje na temat modelu infekcji S. mediterranea-C. albicans oraz są wdzięczni Edelweiss Pfister za zarządzanie laboratoriami i pielęgnację planariów. Prace te były wspierane przez National Institutes of Health (NIH) National Institute of General Medical Sciences (NIGMS), które przyznawały R35GM156045 i R35GM124594 C.J.N., a także R35GM158501 i R01GM132753 dla N.J.O. Prace te były również wspierane przez rodzinę Kamangarów w formie fundowanego stanowiska dla C.J.N.S. N.M.S. zostało wsparte przez stypendia Center for Cellular and Biomolecular Machines (CCBM) National Science Foundation (NSF) Center of Research Excellence in Science and Technology (CREST) w ramach nagród NSF-HRD-1547848 oraz NSF-EES-2112675.

Fundatorzy nie mieli żadnej roli w projektowaniu badania, zbieraniu i analizie danych, interpretacji danych, pisaniu manuskryptu ani decyzji o publikacji wyników. N.M.S. potwierdza użycie ChatGPT do pomocy przy edycji manuskryptu (sprawdzanie pisowni, gramatyki, formatowania i struktury zdań).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
1,7 mL rurki mikrowirówkowe VWR/Genemate490004-436-BOXOF500Przezroczyste, pudełko z 500 elementami
20 mL fiolki scyntillonuFisher Scientific12-100-006Przezroczyste butelki szklane do immunobarwienia
Płytki polistyrenowe bez obróbki 24-dołkówFisher Scientific08-772-51Immunobarwienie
Mikrowirówki o pojemności 5,0 mL Eppendorf/Sigma AldrichEP0030119487-200EAPrzezroczyste, pudełko z 200 elementami
Płytki polistyrenowe nieobrobione z 6 dołkówFisher Scientific08-772-49Testy infekcji
AgarVWR89405-066Poziom bakteriologiczny dla medium YPD
Aplikatory patyczkiThermo Fisher/Puritan22-029-491C. albicans hodownictwo
BioRenderBioRender Inc.Nie maOprogramowanie do projektowania figurek używane do generowania ilustracji schematycznych
Chlorek wapnia (CaCl2)Sigma-AldrichC5080-500GWoda planarialna/1x Montjuï Sole C
Candida albicans przeciwciała poliklonalne przeciw królikom, IgGThermo FisherPA1-27158Immunobarwienie
Rurki wirówkoweVWR89039-664C. albicans zbiory
Rurki hodowlane szkło borokrzemowe 18x150mmVWR47729-583C. albicans hodownictwo
KuwettyFisher Scientific14-955-127Do pomiaru gęstości optycznej hodowli
Dekstroza (D-glukoza)Fisher ScientificD16-3Medium YPD
GlicerolFisher ScientificG33-4Klasa biologii molekularnej jako uzupełnienie kriogenicznego magazynowania C. albicans 
Narzędzie do tworzenia wykresów i wizualizacji danychGraphPad/PrismOprogramowanie statystyczne i narzędzie do wizualizacji. Verison 10.6.1.
Narzędzie do tworzenia wykresówROprogramowanie statystyczne. Verison 4.4.3.
Shaker inkubatorowyEppendorfEPM1282-0004-1EANew Brunswick Innova 44/44R C. albicans
Chlorek magnezu (MgCl2)SigmaM8266-100GJeśli chodzi o wodę planarialną  (1x Montjuï sole C)
Siarczan magnezu (MgSO4)Sigma-AldrichM7506-500GJeśli chodzi o wodę planarialną  (1x Montjuï sole C)
Szkiełka mikroskopoweVWR16004-368
Mikroskop multizoomNikonNikon AZ100 
N-acetylo-L-cysteinaSigma AldrichA7250-50GOdczynnik mukolityczny i ofiarny  Fiksacja
Paramaldehyd, roztwór 16%, stopień biologii molekularnejNauki o mikroskopii elektronowej15710Odczynnik utrwalający
Bezprzewodowy silnik Pellet PestleFisher Scientific12-141-361Homogenizacja planarialna
Peptone, stopień bakteriologicznyHIMEDIA/VWR89129-480Medium YPD
TłuczkiFisher Scientific12-141-368Jednorazowy pellet wolny od RNazy do homogenizacji planarialnej
Szalki Petriego, 100 x 15 mmVWR25384-342
Poliuretan (alkohol winylowy)Sigma-AldrichP-8136 Dla Gelvatol
Chlorek potasu (KCl)Sigma Life ScienceP9541-500GMedium planarialne/woda  (1x Montjuï sole C)
Przeciwciało wtórne przeciwciało dla kóz przeciwkrólikow, IgG, Alexa Fluor 568Fisher ScientificA-11011Immunobarwienie
SN250Centrum Zasobów Genetyki GrzybówDziki typ C. albicans szczep (https://www.fgsc.net/)
Azidek soduFisher ScientificS227-100Dla Gelvatol
Wodorowęglan sodu (NaHCO3)Sigma-AldrichS5761-1KGMedium planarialne/woda  (1x Montjuï sole C)
Chlorek sodu (NaCl)Sigma Life ScienceS3014-500GMedium planarialne/woda  (1x Montjuï sole C)
SpektrofotometrAgilent26354BioTek Epoch 2 Microplate do pomiaru gęstości optycznej
Statyczny inkubatorFisher Scientific15-015-2634C. albicans kulturowanie
Pipety transferoweFisher Scientific13-711-9CMSterylne, jednorazowe stopniowane pipety do transferu planariów
Baza TrisSigma-Aldrich252859Dla Gelvatol
Ekstrakt drożdżowyThermo Fisher212750Medium YPD

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Delavy, M., et al. Unveiling Candida albicans intestinal carriage in healthy volunteers: the role of micro- and mycobiota, diet, host genetics and immune response. Gut Microbes. 15 (2), 2287618(2023).
  2. Bays, D. J., Savage, H. P. Candida albicans gastrointestinal colonization resistance: a host-microbiome balancing act. Infect Immun. 93 (9), e0061024(2025).
  3. Nash, A. K., et al. The gut mycobiome of the Human Microbiome Project healthy cohort. Microbiome. 5 (1), 153(2017).
  4. Fróis-Martins, R., Lagler, J., LeibundGut-Landmann, S. Candida albicans virulence traits in commensalism and disease. Curr Clin Microbiol Rep. 11 (4), 231-240 (2024).
  5. Kumamoto, C. A., Gresnigt, M. S., Hube, B. The gut, the bad and the harmless: Candida albicans as a commensal and opportunistic pathogen in the intestine. Curr Opin Microbiol. 56, 7-15 (2020).
  6. Fisher, M. C., et al. Tackling the emerging threat of antifungal resistance to human health. Nat Rev Microbiol. 20 (9), 557-571 (2022).
  7. Gow, N. A. R., et al. The importance of antimicrobial resistance in medical mycology. Nat Commun. 13 (1), 5352(2022).
  8. Lockhart, S. R., Chowdhary, A., Gold, J. A. W. The rapid emergence of antifungal-resistant human-pathogenic fungi. Nat Rev Microbiol. 21 (12), 818-832 (2023).
  9. Denning, D. W. Global incidence and mortality of severe fungal disease. Lancet Infect Dis. 24 (7), e428-e438 (2024).
  10. Benedict, K., Jackson, B. R., Chiller, T., Beer, K. D. Estimation of direct healthcare costs of fungal diseases in the United States. Clin Infect Dis. 68 (11), 1791-1797 (2019).
  11. Gulati, M., Nobile, C. J. Candida albicans biofilms: development, regulation, and molecular mechanisms. Microbes Infect. 18 (5), 310-321 (2016).
  12. Nobile, C. J., Johnson, A. D. Candida albicans biofilms and human disease. Annu Rev Microbiol. 69 (1), 71-92 (2015).
  13. Höfs, S., Mogavero, S., Hube, B. Interaction of Candida albicans with host cells: virulence factors, host defense, escape strategies, and the microbiota. J Microbiol. 54 (3), 149-169 (2016).
  14. Talapko, J., et al. Candida albicans—the virulence factors and clinical manifestations of infection. J Fungi. 7 (2), 79(2021).
  15. Lopes, J. P., Lionakis, M. S. Pathogenesis and virulence of Candida albicans. Virulence. 13 (1), 89-121 (2022).
  16. Gaffar, N. R., Valand, N., Venkatraman Girija, U. Candidiasis: insights into virulence factors, complement evasion and antifungal drug resistance. Microorganisms. 13 (2), 272(2025).
  17. Xie, J., et al. White-opaque switching in natural MTLa/α isolates of Candida albicans: evolutionary implications for roles in host adaptation, pathogenesis, and sex. PLoS Biol. 11 (3), e1001525(2013).
  18. Costa-de-Oliveira, S., Rodrigues, A. G. Candida albicans antifungal resistance and tolerance in bloodstream infections: the triad yeast-host-antifungal. Microorganisms. 8 (2), 154(2020).
  19. Whaley, S. G., et al. Azole antifungal resistance in Candida albicans and emerging non-albicans Candida species. Front Microbiol. 7, 2173(2017).
  20. Marichal, P., et al. Contribution of mutations in the cytochrome P450 14α-demethylase to azole resistance in Candida albicans. Microbiology. 145 (10), 2701-2713 (1999).
  21. Lee, Y., Robbins, N., Cowen, L. E. Molecular mechanisms governing antifungal drug resistance. npj Antimicrob Resist. 1 (1), 5(2023).
  22. Maciel, E. I., Jiang, C., Barghouth, P. G., Nobile, C. J., Oviedo, N. J. The planarian Schmidtea mediterranea is a new model to study host-pathogen interactions during fungal infections. Dev Comp Immunol. 93, 18-27 (2019).
  23. Maciel, E. I., Valle Arevalo, A., Ziman, B., Nobile, C. J., Oviedo, N. J. Epithelial infection with Candida albicans elicits a multi-system response in planarians. Front Microbiol. 11, 629526(2021).
  24. Maciel, E. I., Valle Arevalo, A., Nobile, C. J., Oviedo, N. J. A planarian model system to study host-pathogen interactions. Methods Mol Biol. 2680, 231-244 (2023).
  25. Sánchez Alvarado, A. Planarian regeneration: its end is its beginning. Cell. 124 (2), 241-245 (2006).
  26. Sluys, R., Riutort, M. Planarian diversity and phylogeny. Methods Mol Biol. 1774, 1-56 (2018).
  27. Riera Romo, M., Pérez-Martínez, D., Castillo Ferrer, C. Innate immunity in vertebrates: an overview. Immunology. 148 (2), 125-139 (2016).
  28. Peiris, T. H., Hoyer, K. K., Oviedo, N. J. Innate immune system and tissue regeneration in planarians: an area ripe for exploration. Semin Immunol. 26 (4), 295-302 (2014).
  29. Kangale, L. J., Raoult, D., Fournier, P. E., Abnave, P., Ghigo, E. Planarians as an emerging model organism for investigating innate immune mechanisms. Front Cell Infect Microbiol. 11, 619081(2021).
  30. Karami, A., Tebyanian, H., Goodarzi, V., Shiri, S. Planarians: an in vivo model for regenerative medicine. Int J Stem Cells. 8 (2), 128-133 (2015).
  31. Oviedo, N. J., Nicolas, C. L., Adams, D. S., Levin, M. Establishing and maintaining a colony of planarians. Cold Spring Harb Protoc. 2008 (10), (2008).
  32. Ivanković, M., et al. A comparative analysis of planarian genomes reveals regulatory conservation in the face of rapid structural divergence. Nat Commun. 15, 8215(2024).
  33. Fincher, C. T., Wurtzel, O., De Hoog, T., Kravarik, K. M., Reddien, P. W. Cell type transcriptome atlas for the planarian Schmidtea mediterranea. Science. 360 (6391), eaaq1736(2018).
  34. Shibata, N., Agata, K. RNA interference in planarians: feeding and injection of synthetic dsRNA. Methods Mol Biol. 1774, 455-466 (2018).
  35. Rouhana, L., et al. RNA interference by feeding in vitro-synthesized double-stranded RNA to planarians: methodology and dynamics. Dev Dyn. 242 (6), 718-730 (2013).
  36. Winsor, L., Sluys, R. Basic histological techniques for planarians. Methods Mol Biol. 1774, 285-351 (2018).
  37. Lu, J., et al. 3D reconstruction of neuronal allometry and neuromuscular projections in asexual planarians using expansion tiling light sheet microscopy. eLife. 13, e101103(2025).
  38. Rink, J. C., Vu, H. T. K., Alvarado, A. S. The maintenance and regeneration of the planarian excretory system are regulated by EGFR signaling. Development. 138 (17), 3769-3780 (2011).
  39. Fajardo, P., Cuenda, A., Sanz-Ezquerro, J. J. A mouse model of candidiasis. Methods Mol Biol. 2321, 63-74 (2021).
  40. Singh, S., Singh, S., Kumar, A. Systemic Candida albicans infection in mice causes endogenous endophthalmitis via breaching the outer blood-retinal barrier. Microbiol Spectr. 10 (4), e01658-e01722 (2022).
  41. Spellberg, B., Ibrahim, A. S., Edwards, J. E., Filler, S. G. Mice with disseminated candidiasis die of progressive sepsis. J Infect Dis. 192 (2), 336-343 (2005).
  42. Andes, D. Use of an animal model of disseminated candidiasis in the evaluation of antifungal therapy. Methods Mol Biol. 118, 111-128 (2005).
  43. Spellberg, B., et al. Parenchymal organ, and not splenic, immunity correlates with host survival during disseminated candidiasis. Infect Immun. 71 (10), 5756-5764 (2003).
  44. Clinical overview of invasive candidiasis. , Centers for Disease Control and Prevention. Available at: https://www.cdc.gov/candidiasis/hcp/clinical-overview/index.html (2024).
  45. Kobayashi, G. S. Medical microbiology. , NCBI Bookshelf. Available at: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK8103/ (1996).
  46. Pappas, P. G., Lionakis, M. S., Arendrup, M. C., Ostrosky-Zeichner, L., Kullberg, B. J. Invasive candidiasis. Nat Rev Dis Primers. 4 (1), 18026(2018).
  47. Van Rhijn, N., Rhodes, J. Evolution of antifungal resistance in the environment. Nat Microbiol. 10 (8), 1804-1815 (2025).
  48. Brown, G. D., et al. The pathobiology of human fungal infections. Nat Rev Microbiol. 22 (11), 687-704 (2024).
  49. Osset-Trénor, P., Pascual-Ahuir, A., Proft, M. Fungal drug response and antimicrobial resistance. J Fungi. 9 (5), 565(2023).
  50. Yan, Z. Z., et al. Environmental microbiome, human fungal pathogens, and antimicrobial resistance. Trends Microbiol. 33 (1), 112-129 (2025).
  51. Homann, O. R., Dea, J., Noble, S. M., Johnson, A. D. A phenotypic profile of the Candida albicans regulatory network. PLoS Genet. 5 (12), e1000783(2009).
  52. Noble, S. M., French, S., Kohn, L. A., Chen, V., Johnson, A. D. Systematic screens of a Candida albicans homozygous deletion library decouple morphogenetic switching and pathogenicity. Nat Genet. 42 (7), 590-598 (2010).
  53. Gulati, M., et al. In Vitro Culturing and Screening of Candida albicans Biofilms. Current Protocols in Microbiology. 50 (1), e60(2018).
  54. Takeda, H., Nishimura, K., Agata, K. Planarians Maintain a Constant Ratio of Different Cell Types During Changes in Body Size by Using the Stem Cell System. Zoological Science. 26 (12), 805-813 (2009).
  55. Roberts-Galbraith, R. H. RNAi screening to assess tissue regeneration in planarians. Methods Mol Biol. 2450, 509-527 (2022).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Model planariiwrodzona odpowied immunologicznakolonizacja grzybowaimmunobarwienieinterakcja gospodarz patogenwysokoprzepustowe przesiewanie

Powiązane artykuły