Walidacja losowej integracji i ekspresji transgenów u pasożytów Eimeria

Summary

Przedstawiamy tutaj standaryzowaną metodę walidacji integracji i ekspresji obcych genów w transgenicznych pasożytach Eimeria . Poprzez integrację analiz genomowych i białkowych, ten proces ten potwierdza stabilne wstawianie i ekspresję genów. Takie podejście ułatwia rozwój transgenicznych Eimeria do badań i zastosowań szczepionkowych.

Abstract

Walidacja transgenicznych pasożytów Eimeria jest niezbędna do potwierdzenia stabilnej integracji genomowej i ekspresji genów egzogennych. Protokół ten opisuje kompleksowy sposób weryfikacji inserwacji transgenów i ekspresji białek w Eimeria tenella. Procedura rozpoczyna się od ekstrakcji genomowej DNA z zasporulowanych oocyst, po czym następuje amplifikacja PCR w celu wstępnej weryfikacji obecności docelowego fragmentu. Aby dodatkowo potwierdzić integrację genomową, przeprowadza się resekwencjonowanie całego genomu w celu identyfikacji miejsc wstawienia i oceny stabilności zintegrowanego konstruktu w genomie pasożyta. Ekspresja białek jest następnie badana za pomocą zachodniego blottingu lizatów przygotowanych z oczyszczonych sporozoitów, co umożliwia wykrywanie docelowego białka rekombinowanego. Ponadto lokalizacja wewnątrzkomórkowa jest wizualizowana za pomocą pośredniego testu immunofluorescencyjnego (IFA) z wykorzystaniem zakażonych komórek gospodarza. Razem te testy stanowią solidne i powtarzalne ramy do walidacji transgenicznych linii Eimeria . Ten przepływ umożliwia wiarygodne potwierdzenie integracji genomowej i ekspresji białek, wspierając tym samym zastosowania w manipulacji genetycznej, genomice funkcjonalnej oraz opracowywaniu szczepionek skierowanych przeciwko pasożytom Eimeria .

Introduction

Kokcydioza, wywoływana przez gatunki Eimeria, stanowi jedną z najbardziej istotnych dla gospodarzy chorób pasożytniczych u drobiu, prowadząc do zmniejszenia przyrostu masy ciała, słabej konwersji paszy oraz globalnych strat finansowych szacowanych na miliardy dolarów rocznie ^1,2,3. Manipulacja genetyczna pasożytów Eimeria stała się potężnym narzędziem zarówno w badaniach podstawowych, jak i w opracowywaniu szczepionek ^4,5,6. Stabilna transfekcja umożliwia integrację i ekspresję egzogennych genów, takich jak fluorescencyjne raportatory czy antygeny ochronne, umożliwiając wizualizację rozwoju pasożyta w czasie rzeczywistym oraz ukierunkowaną ocenę kandydatów na szczepionki ^7,8,9.

Poprzednia publikacja Duana i in. przedstawiła ustandaryzowany protokół nukleofekcji i in vivo propagacji transgenicznych Eimeria, ustanawiając efektywną metodę generowania i wzbogacania linii rekombinowanych pasożytów¹⁰. Jednak obecnie nie istnieje jednolity workflow do potwierdzania stabilnej integracji genomowej i funkcjonalnej ekspresji transgenów. Taka walidacja jest kluczowa dla zapewnienia autentyczności, stabilności i powtarzalności linii transgenicznych wykorzystywanych w dalszych badaniach biologicznych lub zastosowaniach szczepionek.

W tym artykule przedstawiono kompletny, krok po kroku protokół walidacji integracji i ekspresji transgenów w Eimeria tenella, wykorzystując transgeniczną linię E. tenella ekspresującą antygen VP2 wirusa choroby zakaźnej (IBDV) VP2 (Et-VP2) jako model¹¹. Ekspresja plazmidu p5′AMic2linkerVP2m3′A, niosąca gen VP2 oraz reportera mCherry, została transfekowana do dzikich sporozoitów E. tenella (Et-WT). Czerwone fluorescencyjne cysty zostały wyizolowane przez fluorescencjonalnie aktywowane sortowanie komórek (FACS) i seryjne przepuszczane u kurczaków wolnych od kokcydii. Ten proces demonstruje procedury ekstrakcji DNA genomowej, wstępnej analizy integracyjnej opartej na PCR, resekwencjonowania całego genomu w celu identyfikacji miejsc wstawienia, western blottingu do weryfikacji ekspresji białek oraz pośredniego testu immunofluorescencji (IFA) do wizualizacji wewnątrzkomórkowej lokalizacji białka rekombinowanego. Razem te metody stanowią powtarzalne i kompleksowe ramy potwierdzające autentyczność transgenicznych linii Eimeria , umożliwiając ich niezawodne wykorzystanie w badaniach genomiki funkcjonalnej i rozwoju szczepionek.

Protocol

Wszystkie eksperymenty na zwierzętach z udziałem kur zostały zatwierdzone przez Komitet ds. Opieki i Wykorzystania Zwierząt Chińskiego Uniwersytetu Rolniczego (numer zatwierdzenia: CAU20160628-2). Wszystkie procedury hodowlane i eksperymentalne były prowadzone zgodnie z wytycznymi Instytucjonalnego Komitetu ds. Opieki i Wykorzystania Zwierząt Chińskiego Uniwersytetu Rolniczego oraz zgodne z Międzynarodowymi Zasadami Przewodnimi Badań Biomedycznych z udziałem zwierząt. W badaniu wykorzystano siedmiodniowe kury białego leghornu wolnego od specyficznych patogenów (SPF). Ptaki były utrzymywane w standardowych warunkach hodowlanych, z nieograniczonym dostępem do paszy i wody przez cały okres eksperymentalny. Odczynniki i używany sprzęt są wymienione w Tabeli Materiałów.

1. Ekstrakcja DNA genomowego z zasporowanych oocystów rodzaju Eimeria.

1. Przelej 1 mL zawiesiny oocysty (≥1 × 10^{7 mL}) do rurki mikrowirówki o pojemności 1,5 mL. Dodaj taką samą objętość szklanych kulek o średnicy 1 mm, odpowiadającą oocystowi pelletowi. Rozbij oocysty za pomocą homogenizatora tkanek, intensywnie bijąc kulkami w temperaturze 60 Hz przez 5 minut, aż ściany oocysty zostaną całkowicie przełamane i zawartość uwolniona.
2. Zbierz mieszankę (z wyłączeniem szklanych kulek) do nowej rurki i wiruj w 12 000 x g przez 1 minutę. Usuń supernatant, dodaj 500 μL buforu CTAB i 40 μL proteinazy K, a następnie inkubuj mieszaninę w 60 °C przez 30 minut.
3. Dodaj 500 μL fenol:chloroform:alkohol izoamylowy (25:24:1), zamieszaj przez 10 sekund i wiruj w 12 000 x g przez 5 minut. Przelej górną fazę wodną do nowej rurki.
   UWAGA: Szczelnie zakryj i wyrzuć rurkę zawierającą warstwę organiczną, aby zapobiec zanieczyszczeniu środowiska. (Opcjonalnie) Jeśli zanieczyszczenie białkiem pozostaje wysokie, powtórz krok 1.3 1–2 razy więcej.
4. Dodaj 500 μL chloroformu: alkohol izoamylowy (24:1), zatwórz przez 10 sekund i wiruj w 12 000 x g przez 5 minut. Przelej fazę wodną do nowej rurki i dodaj równą ilość izopropanolu. Mieszaj przez inwersję, aż pojawią się wydzieliny DNA.
   UWAGA: Opady w temperaturze −20 °C przez ≥1 godzinę lub w nocy zwiększają plony.
5. Wiruj w 12 000 x g przez 10 minut, aby rozpuścić granulki DNA. Przemyj granulek 70% etanolem, wiruj w 12 000 x g przez 5 minut i wyrzuć supernatant. Ostrożnie usuń resztki cieczy za pomocą pompy próżniowej i susz pellet na powietrzu w temperaturze pokojowej lub 37 °C.
6. Rozpuść wysuszony pellet DNA w buforze zawierającym RNazę ddH_{, 2O}lub TE. Inkubować w temperaturze 37 °C przez ≥1 godzinę lub w 4 °C przez noc, aby usunąć pozostałe RNA. Przechowuj oczyszczone DNA w temperaturze −20 °C.
   UWAGA: Dla długoterminowej konserwacji nierozpuszczone granulki DNA można przechowywać bezpośrednio w temperaturze −20 °C lub −80 °C. Przed dalszymi aplikacjami oceń integralność i stężenie DNA za pomocą elektroforezy żelu agarozowego.

2. Potwierdzenie obecności konstruktu Et-VP2 w genomie pasożyta PCR

1. Projektuj pary primerów (Tabela 1) w celu weryfikacji integracji genomowej konstruktu Et-VP2.
   UWAGA: Sekwencje starterów zostały zaprojektowane przy użyciu Primer-BLAST, z typowymi parametrami długości 18–24 bp, temperaturą topnienia około 55–60 °C oraz minimalnym powstawaniem struktury wtórnej. Specyficzność każdej pary starterów została dodatkowo sprawdzona względem genomu Eimeria tenella , aby uniknąć niespecyficznego amplifikowania.
2. Przygotuj mieszaninę reakcji 50 μL zawierającą 25 μL 2× Taq Master Mix, 21 μL ddH₂O, po 1 μL sprężarek do przodu i do tyłu oraz 2 μL matrycy DNA.
3. Wykonaj wzmocnienie przy następujących warunkach cyklu termicznego: początkowa denaturacja w 95 °C przez 5 minut; 30 cykli 95 °C przez 30 s, 55 °C przez 30 s i 72 °C przez 1 minutę; następnie nastąpiło ostateczne przedłużenie temperatury 72 °C na 10 minut.
   UWAGA: Upewnij się, że wszystkie odczynniki są dokładnie wymieszane przed cyklem termicznym. Używaj świeżo przygotowanych szablonów DNA, aby osiągnąć optymalną efektywność amplifikacji.

3. Resekwencjonowanie linii pasożyta transgenicznego (Et-VP2)

1. Zgłoszenie próbek i budowa biblioteki
   1. Złóż zawiesę oocysty o pojemności 1 mL (≥1 × 10^{7 mL}) do komercyjnego dostawcy usług sekwencjonowania do analizy nowej generacji.
   2. Po ocenie jakości DNA genomowego fragmentuj DNA poprzez mechaniczne zakłócenia za pomocą ultradźwięków. Oczyść fragmentowane DNA, wykonać naprawę końców, dodać zasadę adeninu (A) do końców 3′ i podwiązać adaptery sekwencjonowania.
   3. Wybierz fragmenty DNA o pożądanym rozmiarze za pomocą elektroforezy żelu agarozowego i wykonaj amplifikację PCR, aby stworzyć bibliotekę sekwencjonowania.
   4. Poddać wybudowaną bibliotekę kontroli jakości. Wykonaj sekwencjonowanie parowe na platformie Illumina NovaSeq, używając długości odczytu 150 bp. Utrzymuj głębokość sekwencjonowania na poziomie 100× aby zapewnić dokładność danych, generując co najmniej 6 GB surowych danych z minimalnym wynikiem jakości Q20 >90%.
      UWAGA: Należy obsługiwać wszystkie odczynniki i próbki DNA za pomocą technik aseptycznych, aby zapobiec zanieczyszczeniu. Sprawdź, czy parametry sekwencjonowania spełniają wymagane metryki głębokości i jakości, zanim przejdziesz do analizy danych.
2. Analiza danych
   1. Filtruj surowe dane sekwencjonowania za pomocą oprogramowania Fastp (v0.23.2) zgodnie z następującymi kryteriami¹²:
      1. Usuń sekwencje adapterów.
      2. Ustaw próg niskiej jakości na Q20 i usuń odczyty, w których bazy niskiej jakości stanowią ponad 30% całkowitej długości odczytu.
      3. Usuń odczyty krótsze niż 50 bp.
   2. Dopasuj odczyty kontrolowane jakościowo do genomu referencyjnego E. tenella (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/assembly/GCA_905310635.1) za pomocą oprogramowania Bowtie2 (v2.4.5)¹³. Losowość danych sekwencjonowania nowej generacji jest oceniana na podstawie głębokości i jednolitości pokrycia.
   3. Upewnij się, że odczyty sekwencjonowania są wyrównane z sekwencją wektorów transgenicznych. Usuń odczyty, które nie mapują regionu T-DNA, aby uzyskać odczyty chimeryczne, w których jeden koniec mapuje się na T-DNA, a drugi na genom referencyjny E. tenella .
   4. Na podstawie sekwencji odczytów chimerycznych wykonaj wyrównanie za pomocą ToxoDB (wersja 64), aby określić konkretne położenie potencjalnych miejsc wszczepienia T-DNA. Analizuj głębokość sekwencjonowania w obszarach homologicznych pomiędzy wektorem a genomem Eimeria (tj. obszary regulacyjne 5′ i 3′) za pomocą oprogramowania Mosdepth (v0.3.3)¹⁴.
   5. Zidentyfikuj potencjalne miejsca integracji plazmidu transgenicznego w genomie E. tenella i zweryfikowaj je za pomocą PCR za pomocą systemu reakcji opisanego w kroku 2.1.
      UWAGA: Zapewnij konsekwentne stosowanie wersji oprogramowania i ustawień parametrów podczas analizy, aby zachować dokładność i powtarzalność danych.

4. Zachodnie blottingowanie transgenicznych białek Eimeria

1. Pobierz zawiesinę PBS zawierającą co najmniej 5 × 10⁶ sporozoitów w rurce wirówki o pojemności 1,5 mL i wirówkę o pojemności 2500 x g przez 5 minut. Ponownie zawiesić pellet w buforze lizy RIPA o pojemności 100 μL i inkubować na lodzie przez 1 godzinę. Dodaj 20 μL bufora załadowującego białko o pojemności 6× i podgrzej mieszankę w temperaturze 100 °C przez 10 minut.
2. Przygotuj żele SDS-PAGE na szklanej płycie o średnicy 1,5 mm. Dostosuj stężenie akryloamidu zgodnie z masą cząsteczkową docelowego białka. Podczas polimeryzacji nałóż żel rozdzielający wodą destylowaną, aby zapewnić równomierną powierzchnię przed dodaniem żelu stosowego.
3. Wiruj lizat w ilości 10 000 x g przez 5 minut i załaduj 40 μL supernatantu do każdego toru próbki. Załaduj 10 μL markera białka na osobny pas i wypełnij pozostałe pasy 40 μL bufora 1× jako kontrolę.
4. Wykonaj elektroforezę w 1× uruchom bufora na 70 V przez 20 minut, a następnie 120 V przez 60–90 minut, aż czoło barwnika dotrze do dna żelu.
5. Wycinaj żel zgodnie z przewidywaną wielkością białka. Przedaktywuj membranę PVDF w metanolu przez 1 minutę i złóż kanapkę transferową w następującej kolejności: gąbka, papier filtrujący, żel (po stronie katody), membrana PVDF, papier filtracyjny, gąbka. Usuń wszelkie pęcherzyki powietrza i przelej białka pod napięciem 70 V przez 3 godziny w buforze transferowym.
6. Przemyj membranę trzy razy PBST (5 minut każda) i blokuj mlekiem beztłuszczowym o stężeniu 5% przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej lub przez noc w 4 °C. Membranę myj dwukrotnie PBST, aby usunąć resztki roztworu blokujące.
7. Inkubuj błonę przeciwciałami pierwotnymi rozcieńczonymi w buforze przeciwciał: myszy poliklonalny anty-Flag (1:2000) oraz myszy monoklonalny anty-GAPDH (1:2000). Inkubuj przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej lub przez noc w 4 °C z delikatnym potrząsaniem. Zbieraj roztwór przeciwciał i myj błonę pięć razy PBST (5 minut każda).
8. Inkubuj błonę z HRP-sprzężonym anty-myszim preparatem IgG (1:2000) przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Płucz błonę pięć razy PBST (5 minut każda).
9. Przygotuj podłoże ECL, mieszając równe objętości roztworu A i B. Nałóż podłoże równomiernie na błonę i wykrywaj sygnały białkowe za pomocą systemu obrazowania chemiluminescencyjnego.
   UWAGA: Wszystkie etapy dotyczące próbek białek wykonuj na lodzie, chyba że zakreślono inaczej. Obchodz się z podłożami metanolowymi i ECL w kapturze wyparowniczy, nosząc rękawiczki i okulary ochronne.

5. Wewnątrzkomórkowy pośredni test immunofluorescencji (IFA) transgenicznych eimerii

1. Oczyszczanie sporozoitów za pomocą kolumny chromatycznej
   1. Podłącz kolumnę chromatyczną do pompy perystaltycznej i dostosuj przepływ do 50–60 Hz. Przemyj kolumnę wodą destylowaną i roztworem glicyny.
   2. Dodawaj zawiesinę DE-52 celulozy do kolumny, jednocześnie ciągle dodając roztwór glicyny, aż warstwa celulozy osiągnie około 1 cm wysokości.
   3. Załaduj sporozoity oczyszczone metodą Percolla na kolumnę. Utrzymuj przepływ 30–40 Hz za pomocą roztworu glicyny i zbieraj przepływ w rurce wirówki o pojemności 50 mL.
   4. Monitoruj eluate, umieszczając krople na szklanym szkiełku do mikroskopowej obserwacji. Gdy nie wykryto sporozoitów, zatrzymaj pompę. Wiruj zebraną frakcję w dawce 2 500 x g przez 5 minut, odrzucaj supernatant i ponownie zawiesij granulat w PBS.
      UWAGA: Wszystkie kroki wykonuj w warunkach sterylnych, aby zapobiec skażeniu mikroorganizmów. Utylizacja glicyny i odpadów Percoll zgodnie z instytucjonalnymi przepisami dotyczącymi biobezpieczeństwa.
2. Zakażenie komórkami HFF spowodowane sporozoitami
   1. Nasiono 1 × 10⁶ sporozoitów w płytki z 24 dołkami zawierające monowarstwy komórek HFF. Dodaj penicylinę-streptomycynę do końcowego stężenia 1× (100 U/mL penicyliny i 100 μg/mL streptomycyny), wymieszaj delikatnie i inkubuj w 37 °C przez 4–6 godzin, aby umożliwić inwazję. Usuń podłoże, umyj raz 1 mL PBS i wyrzuć supernatant.
   2. Ostrożnie usuń szklane pokrywki z dołków za pomocą sterylnych kleszczy i przenieś je na nową płytkę z 24 dołkami. Utrwal próbki w 1 mL 4% paradehydu na 30 minut, raz przemyj 1 ml PBS i wyrzuć supernatant.
   3. Przepuszczaj komórki 1 mL 0,25% Triton X-100 przez 30 minut. Raz umyj 1 ml PBS i wyrzuć supernatant.
   4. Zablokuj próbki 1 mL 3% BSA przez 30 minut. Raz umyj 1 ml PBS i wyrzuć supernatant.
   5. Rozcieńczone monoklonalne przeciwciało antyflagowe (1:200) w 3% BSA. Umieść krople rozcieńczonego przeciwciała na folię uszczelniającą i odwróć pokrywki (od strony komórki do dołu) na krople. Inkubuj pokrywy w nawilżonej komorze w 37 °C przez 1 godzinę. Myj trzy razy z 1 mL PBS (5 minut każdy).
   6. Rozcieńczony FITC-sprzężony anty-myszy anty-myszy IgG (1:200) i Hoechst 33258 (1:100) w 3% BSA. Umieść krople mieszanki barwiącej na folii uszczelniającej i odwróć pokrywki na krople. Inkubuj w nawilżonej komorze w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę, a następnie przemyj pięć razy 1 mL PBS (5 minut każda).
   7. Nakładki osłonowe montuj, umieszczając na szklanym suwaku medium antyfade o pojemności 5 μL. Odwróć pokrywkę (od strony komórki do dołu) na drop, unikając pęcherzyków powietrza, i uszczelnij krawędzie. Przechowuj zamontowane szkiełka w nawilżonej komorze w temperaturze 4 °C do czasu wykonania obrazowania.
      UWAGA: Obchodz się z paraformaldehydem i Tritonem X-100 w kapturze chemicznej, nosząc rękawiczki i ochronę oczu. Formuły odczynników stosowane w tym zabiegu wymienione są w Tabeli 2.

Results

Analiza PCR genomowa potwierdziła obecność docelowego fragmentu u pasożytów transgenicznych, podczas gdy u grupy kontrolnej typu dzikiego nie wykryto odpowiadających pasów (Rysunek 1A). Resekwencjonowanie całego genomu wykazało również, że zlinearyzowany plazmid był stabilnie zintegrowany z genomem pasożyta, a przewidywane miejsce integracji zostało zweryfikowane przez amplifikację PCR w obszarze połączenia (Rysunek 1B).

Ekspresję bia...

Discussion

Protokół ten ustanawia kompleksowy workflow do weryfikacji integracji genomowej, ekspresji białek oraz wewnątrzkomórkowej lokalizacji genów egzogennych w transgenicznej E. tenella. Zamiast polegać na jednym badaniu, podejście to łączy dowody genomowe i białkowe, zapewniając, że inserwacja transgenu jest zarówno strukturalnie potwierdzona, jak i funkcjonalnie ekspresyjna.

Kilka kluczowych etapów tego protokołu ma silny wpływ na skuteczną walidację linii transgenicznych. Problemy techni...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Medium montażowe antyfade	MCE	HYK1042	Medium mocujące fluorescencyjne, aby zapobiec fotobieleniu
BSA (3%)	Beyotime	ST023	Bufor blokujący i bufor rozcieńczający przeciwciała dla IFA; Blokuj w temperaturze pokojowej przez 30 minut
Chloroform: alkohol izoamylowy (24:1)	Sigma	C0549	Odczynnik do usuwania pozostałego fenolu podczas ekstrakcji DNA genomowej
Kury wolne od kokcydii	Boehringer-Ingelheim	SPF	Stosowany do przepuszczania in vivo i amplifikacji szczepów transgenicznych; zatwierdzone przez Komisję Etyki (numer zatwierdzenia: CAU20160628-2)
CTAB (bromek cetyltrimetylammonowy)	Merck KGaA	H5882	Składnik buforu ekstrakcji DNA genomowego; formuła: 3 g CTAB + 12,27 g NaCl + 15 mL 1 mol/L Tris-HCl + 6 mL 0,5 mol/L EDTA, skorygowane do końcowej objętości 150 mL z ddH2O
Celuloza DE-52	Solarbio	C8350	Ośrodek chromatografii jonowowymiennej do oczyszczania sporozoitów; sekwencyjnie traktowana NaOH, HCl i wodą destylowaną, a następnie wyrównywana roztworem glicyny
Podłoże ECL (Roztwór A + Roztwór B)	Thermofisher	32106	Odczynnik wykrywający chemiluminescencję; Przed użyciem wymieszaj równe ilości roztworu A i B
IgG z kozą sprzężoną z FITC	Sigma	AP124F	Fluorescencyjne przeciwciało wtórne dla IFA, współczynnik rozcieńczenia 1:200
Koraliki szklane	Sigma	Z250473-1PAK
Roztwór glicyny	Sigma	67419	Bufor równowagi i elucii dla kolumn chromatografii; formuła: 0,75 g glicyny + 7,9 g NaCl rozpuszczonego w wodzie destylowanej 500 mL, pH dostosowane do 7,4-7,6, autoklawowane
Hoechst 33258	Sigma	94403	Odczynnik do barwienia jądrowego, współczynnik rozcieńczenia 1:100; Wykorzystywane do lokalizacji IFA
Anty-myszy IgG kozy sprzężone z HRP	Sigma	12-349	Przeciwciało wtórne przeciwko western blottingowi, współczynnik rozcieńczenia 1:2000
Platforma sekwencjonowania Illumina NovaSeq	Personalbio Biotechnology Co., Ltd. (Szanghaj, Chiny)		Platforma sekwencjonowania nowej generacji; sekwencjonowanie parowane (długość odczytu 150 bp), głębokość sekwencjonowania 100&krotnie, generowanie ≥ 6 GB surowych danych (Q20>90%)
Wirówka o niskich prędkościach	WIRÓWKA BEILI Z CZASÓW PEKINU	DT5-2
Mysie monoklonalne przeciwciało przeciwflagowe	Sigma	F1804	Przeciwciało pierwotne, współczynnik rozcieńczenia 1:200; używany do wykrywania IFA białka fuzyjnego oznaczonego flagą
Mysie monoklonalne przeciwciało przeciw GAPDH	Sigma	G8795	Przeciwciało pierwotne, współczynnik rozcieńczenia 1:2000; używany jako kontrola ładowania w Western blottingu
Mleko beztłuszczowe (5%)	Beyotime	P0216	Blokowanie bufora dla Western blotting; blok w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę lub 4 stopnie; C w nocy
Paraformaldehyd (4%)	Merck KGaA	30525	Roztwór utrwalania komórek; Ustalić w temperaturze pokojowej przez 30 minut
PBS	Solarbio	P1010
Penicylina-Streptomycyna (100 razy;)	Yeasen	60162ES76	Antybiotyk do hodowli komórek; hamuje skażenie mikroorganizmów
Percoll (DG gradient stock	GE Healthcare	17-0891-09
Fenol:chloroform:alkohol izoamylowy (25:24:1)	Merck KGaA	77617	Reagent do usuwania białek podczas ekstrakcji DNA genomowej
Bufor ładowania białek (6&razy;)	Beyotime	P0015F	Bufor obciążenia elektroforezy białkowej; formuła: 100 mM Tris (pH 6,8), 4% SDS, 2 mM EDTA, 2% glicerol, 6 M mocznika; mieszać z 50 μ L 2 M DTT i 50 μ Przed użyciem L. 5% błękitu bromofenolowego
Proteinaza K	Merck KGaA	39450-01-6	200 mg rozpuszczonego w 10 mL ddH2O, używanego do trawienia białek podczas ekstrakcji DNA genomowej
Membrana PVDF	Thermofisher	88518	Błona transferowa białka; Aktywowany metanolem na 1 minutę przed użyciem
Bufor lizy RIPA	Yeasen	20101	Bufor lizy do ekstrakcji białka sporozoitowego
RNaza A	Merck KGaA	9001-99-4	25 mg rozpuszczone w 2,5 mL 0,01 mol/L NaAc, podgrzane w temperaturze 100 stopni i deg; C przez 10-15 minut, pH skorygowane do 7,4 przy 1 mol/l Tris-HCl; Wykorzystywane do usuwania RNA z próbek DNA
Odczynniki żelowe SDS-PAGE (akrylamid, bisakrylamid, tris, SDS, APS, TEMED)	Biografia	101	Odczynniki do przygotowania żelu SDS-PAGE; Stężenie akryloamidu dostosowane do masy cząsteczkowej białka docelowego
Hydrat taurodeoksycholatu sodu	Sigma	T0875
rozwiązanie)
Taq Master Mix (2&razy;)	Vazyme	P112-01/02/03	Premix amplifikacyjny PCR zawierający polimerazę Taq, dNTP itp.
Triton X-100 (0,25%)	Merck KGaA	9036	Roztwór permeabilizacji komórek; Inkubuj w temperaturze pokojowej przez 30 minut
Trypsyna	Solarbio	T8150
Vortex Mixer	Pekin Północny TZ-Biotech	HQ-60-II
Termostat kąpielowy w kąpieli wodnej	Instrumenty Granta (Cambridge)	GD120,GM0815010