Weryfikacja losowego integrowania i ekspresji transgenów u pasożytów z rodzaju Eimeria

Podsumowanie

Przedstawiamy tutaj standaryzowaną metodę walidacji integracji i ekspresji obcych genów w transgenicznych pasożytach Eimeria. Integrując analizy genomowe i na poziomie białek, ten przepływ pracy potwierdza stabilne wstawianie i ekspresję genów. Takie podejście ułatwia rozwój transgenicznych Eimeria w zastosowaniach badawczych i szczepionkowych.

Streszczenie

Walidacja transgenicznych pasożytów Eimeria jest niezbędna do potwierdzenia stabilnej integracji genomowej i ekspresji genów egzogennych. Ten protokół opisuje kompleksowy przebieg weryfikacji wstawienia transgenu i ekspresji białka w Eimeria tenella. Procedura rozpoczyna się od ekstrakcji DNA genomowego z zarodkowanej oocysty, następnie przeprowadza się amplifikację PCR w celu wstępnego potwierdzenia obecności fragmentu docelowego. Aby dodatkowo potwierdzić integrację genomową, przeprowadza się resekwencjonowanie całego genomu w celu identyfikacji miejsc wstawiania i oceny stabilności wstawionej konstrukcji w genomie pasożyta. Ekspresję białka następnie bada się za pomocą Western blotu z wykorzystaniem lizatów przygotowanych z oczyszczonych sporozoitów, co umożliwia wykrycie docelowe białko rekombinowane. Ponadto lokalizacja wewnątrzkomórkowa jest wizualizowana za pomocą pośredniego testu immunofluorescencyjnego (IFA) z wykorzystaniem zakażonych komórek gospodarza. Razem te testy zapewniają solidną i powtarzalną ramę dla walidacji transgenicznych linii Eimeria. Ten przebieg umożliwia niezawodne potwierdzenie integracji genomowej i ekspresji białka, co wspiera dalsze zastosowania w manipulacji genetycznej, genomice funkcjonalnej i rozwoju szczepionek przeciwko pasożytom Eimeria.

Wprowadzenie

Kokcydioza, spowodowana przez gatunki Eimeria, jest jedną z najważniejszych ekonomicznie chorób pasożytniczych drobiu, prowadzącą do obniżonego przyrostu masy ciała, złego wykorzystania paszy i globalnych strat finansowych szacowane na miliardy dolarów rocznie^1,2,3. Manipulatacja genetyczna pasożytów Eimeria stała się potężnym narzędziem zarówno w badaniach podstawowych, jak i rozwoju szczepionek^4,5,6. Stabilna elektrotransfekcja umożliwia integrację i ekspresję egzogennych genów, takich jak reportery fluorescencyjne lub antygeny ochronne, pozwalając na wizualizację rozwoju pasożyta w czasie rzeczywistym i ukierunkowane ocenę kandydatów na szczepionki^7,8,9.

Poprzednia publikacja Duana i współpracowników dostarczyła standaryzowanego protokołu nukleofekcji i propagacji in vivo transgenicznych Eimeria, ustanawiając efektywną metodę generowania i wzbogacania linii pasożytów rekombinowanych¹⁰. Jednakże, obecnie nie istnieje ujednolicony proces potwierdzania stabilnej integracji genomowej i funkcjonalnej ekspresji transgenów. Taka walidacja jest kluczowa dla zapewnienia autentyczności, stabilności i reproduktywalności linii transgenicznych używanych w dalszych badaniach biologicznych lub zastosowaniach szczepionkowych.

Niniejszy artykuł przedstawia kompletny, krok po kroku, protokół walidacji integracji i ekspresji transgenów w Eimeria tenella, używając transgenicznej linii E. tenella ekspresującej antygen wirusa zakaźnej choroby uchyłkowej (IBDV) VP2 (Et-VP2) jako modelu¹¹. Plasmida ekspresyjna p5′AMic2linkerVP2m3′A, zawierająca gen VP2 i reporter mCherry, została przetransfekowana do dzikich sporozoitów E. tenella (Et-WT). Czerwone fluorescencyjne oocysty zostały izolowane przez sortowanie komórek aktywowanych fluorescencyjnie (FACS) i przekazywane seryjnie u kurcząt wolnych od kokcydii. Ten proces obejmuje procedury ekstrakcji genomowego DNA, wstępną analizę integracji opartą na PCR, resekwencjonowanie całego genomu w celu zidentyfikowania miejsc wstawienia, blotowanie Westerna dla weryfikacji ekspresji białka oraz pośredni test immunofluorescencyjny (IFA) do wizualizowania lokalizacji wewnątrzkomórkowej rekombinowanego białka. Razem, te metody zapewniają reproduktywalny i kompleksowy rama dla potwierdzenia autentyczności transgenicznych linii Eimeria, umożliwiając ich niezawodne wykorzystanie w badaniach genomiki funkcjonalnej i rozwoju szczepionek.

Protokół

Wszystkie eksperymenty na zwierzętach z udziałem kurcząt zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki nad Zwierzętami i Wykorzystywania Zwierząt Uniwersytetu Rolniczego w Chinach (numer zgody: CAU20160628-2). Wszystkie procedury hodowlane i eksperymentalne przeprowadzono zgodnie z wytycznymi Instytucjonalnego Komitetu ds. Opieki nad Zwierzętami i Wykorzystywania Zwierząt Uniwersytetu Rolniczego w Chinach oraz zgodnie z Międzynarodowymi Zasadami Przewodnimi dla Badań Biomedycznych z Udziałem Zwierząt. W badaniu tym użyto 7-dniowych samców kurcząt wolnych od patogenów (SPF) rasy White Leghorn. Ptaki były utrzymywane w standardowych warunkach chowu z wolnym dostępem do pokarmu i wody przez cały okres eksperymentu. Reaktanty i sprzęt użyty są wymienione w Tabeli Materiałów.

1. Ekstrakcja genomowej DNA z oocyst sporulowanych Eimeria spp.

1. Przenieś 1 mL zawiesiny oocyst (≥1 × 10⁷/mL) do 1,5 mL mikrocentrfużującej probówki. Dodaj równą objętość 1 mm kul szklanych odpowiadającą pelletowi oocyst. Zniszcz oocysty za pomocą homogenizatora tkankowego poprzez energiczną bicie kulkami z częstotliwością 60 Hz przez 5 min, aż ściany oocyst zostaną całkowicie zniszczone, a zawartość uwolniona.
2. Zbierz mieszaninę (bez kul szklanych) do nowej probówki i wyśrodkuj przez 1 min przy 12 000 x g. Odsuń nadstan, dodaj 500 µL buforu CTAB i 40 µL proteazy K, a następnie inkubaty mieszaninę w 60 °C przez 30 min.
3. Dodaj 500 µL fenolu:chloroformu:alkoholu izoamylowego (25:24:1), wymieszaj przez 10 s i wyśrodkuj przez 5 min przy 12 000 x g. Przenieś górną fazę wodną do nowej probówki.
   UWAGA: Ścisło zamknij i wyrzuć probówkę zawierającą warstwę organiczną, aby zapobiec zanieczyszczeniu środowiska. (Opcjonalnie) Jeśli pozostaje wysokie zanieczyszczenie białkami, powtórz krok 1.3 1-2 razy dodatkowo.
4. Dodaj 500 µL chloroformu:alkoholu izoamylowego (24:1), wymieszaj przez 10 s i wyśrodkuj przez 5 min przy 12 000 x g. Przenieś fazę wodną do nowej probówki i dodaj równą objętość izopropanolu. Mieszaj przez odwrócenie, aż pojawią się osady DNA.
   UWAGA: Precypitacja w −20 °C przez ≥1 h lub na noc poprawia wynik.
5. Wyśrodkuj przez 10 min przy 12 000 x g, aby osiadła DNA. Przepłucz pellet 70% etanolem, wyśrodkuj przez 5 min przy 12 000 x g, a następnie odsuń nadstan. Ostrożnie usuń pozostałą ciecz za pomocą pompy próżniowej i osusz pellet w temperaturze pokojowej lub 37 °C.
6. Rozpuść osuszony pellet DNA w ddH₂O zawierającym RNazę lub buforze TE. Inkubaty w 37 °C przez ≥1 h lub w 4 °C na noc, aby usunąć resztki RNA. Przechowuj oczyszczoną DNA w −20 °C.
   UWAGA: W przypadku długotrwałego przechowywania nierozpuszczone pellety DNA można przechowywać bezpośrednio w −20 °C lub −80 °C. Przed zastosowaniami poniżej oceń integralność i stężenie DNA za pomocą elektroforezy na żelu agarozy przed.

2. Weryfikacja PCR obecności konstruktu Et-VP2 w genomie pasożyta

1. Zaprojektuj pary primerów (Tabela 1), aby zweryfikować genomową integrację konstruktu Et-VP2.
   UWAGA: Sekwencje primerów zostały zaprojektowane za pomocą Primer-BLAST, z typowymi parametrami długości primerów 18-24 bp, temperaturą topnienia około 55-60 ℃ oraz minimalnym tworzeniem struktur wtórnych. Specyficzność każdej pary primerów została dodatkowo sprawdzona względem genomu Eimeria tenella, aby uniknąć niespecyficznej amplifikacji.
2. Przygotuj 50 µL mieszaniny reakcyjnej zawierającej 25 µL 2× Taq Master Mix, 21 µL ddH₂O, 1 µL każdego z primerów do przodu i wstecz oraz 2 µL DNA szablonu.
3. Przeprowadź amplifikację przy użyciu następujących warunków cyklu termicznego: początkowa denaturacja w 95 °C przez 5 min; 30 cykli 95 °C przez 30 s, 55 °C przez 30 s i 72 °C przez 1 min; następnie końcowe przedłużenie w 72 °C przez 10 min.
   UWAGA: Upewnij się, że wszystkie reagenty są dokładnie wymieszane przed cyklem termicznym. Użyj świeżo przygotowanych szablonów DNA, aby osiągnąć optymalną wydajność amplifikacji.

3. Resekwencjonowanie linii pasożyta transgenicznego (Et-VP2)

1. Przes

Wyniki

Analiza genomiczna PCR potwierdziła obecność fragmentu docelowego w pasożytach transgenicznych, podczas gdy nie wykryto odpowiednich pasm w kontroli typu dzikiego (Rysunek 1A). Całkowite sekwencjonowanie genomu wykazało, że linearyzowany plasmid został stabilnie zintegrowany z genomem pasożyta, a przewidywane miejsce integracji potwierdzono za pomocą amplifikacji PCR na przekroju strefy połączenia (Rysunek 1B).

Ekspresję białka zweryf...

Dyskusja

To protokół ustanawia kompleksowy proces walidacji integracji genomowej, ekspresji białka i lokalizacji wewnątrzkomórkowej genów egzogennych w transgenicznym E. tenella. Zamiast polegać na pojedynczym aparacie, podejście łączy dowody na poziomie genomowym i białkowym, zapewniając zarówno strukturalne potwierdzenie wstawienia transgenu, jak i funkcjonalne wyrażenie.

Kilka kluczowych kroków w tym protokole ma znaczący wpływ na pomyślną walidację linii transgenicznych. Problemy techniczn...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Środek montażowy antyfade	MCE	HYK1042	Środek fluorescencyjny do montażu, aby zapobiec fotobleachowi
BSA (3%)	Beyotime	ST023	Bufor blokujący i bufor do rozcieńczania przeciwciał do IFA; blokować w temperaturze pokojowej przez 30 min
Chloroform:alkohol izoamylowy (24:1)	Sigma	C0549	Środek do usuwania resztkowego fenolu podczas ekstrakcji genomowej DNA
Kurczaki wolne od coccidii	Boehringer-Ingelheim	SPF	Stosowane do in vivo przekazywania i amplifikacji szczepów transgennych; zatwierdzone przez Komitet Etyczny (numer zatwierdzenia: CAU20160628-2)
CTAB (cetylotrimetyloamoniowy bromek)	Merck KGaA	H5882	Składnik bufora ekstrakcji genomowej DNA; formuła: 3 g CTAB + 12,27 g NaCl + 15 mL 1 mol/L Tris-HCl + 6 mL 0,5 mol/L EDTA, dostosowane do końcowej objętości 150 mL za pomocą ddH2O
Celuloza DE-52	Solarbio	C8350	Środek do chromatografii wymiennej jonowej do oczyszczania sporozoitów; sekwencyjnie traktowane NaOH, HCl i wodą destylowaną, następnie zrównoważone z roztworem glicyny
Substrat ECL (roztwór A + roztwór B)	thermofisher	32106	Środek do wykrywania chemiluminescencyjnego; przed użyciem mieszaj równe objętości roztworu A i B
FITC-koniugowane przeciwko mysiemu IgG	Sigma	AP124F	Fluorescencyjne przeciwciało wtórnego do IFA, stosunek rozcieńczania 1:200
Koraliki szklane	Sigma	Z250473-1PAK
Roztwór glicyny	Sigma	67419	Bufor do równoważenia i elucji kolumn chromatograficznych; formuła: 0,75 g glicyny + 7,9 g NaCl rozpuszczone w 500 mL wody destylowanej, pH dostosowane do 7,4-7,6, autoklawowane
Hoechst 33258	Sigma	94403	Środek do barwienia jądra, stosunek rozcieńczania 1:100; stosowany do lokalizowania IFA
HRP-koniugowane przeciwko mysiemu IgG	Sigma	12-349	Przeciwciało wtórne do blotowania Western, stosunek rozcieńczania 1:2000
Platforma sekwencjonowania Illumina NovaSeq	Personalbio Biotechnology Co., Ltd. (Szanghaj, Chiny)		Platforma sekwencjonowania nowej generacji; sekwencjonowanie paired-end (150 bp długość odczytu), głębokość sekwencjonowania 100×, generowanie ≥6 GB surowych danych (Q20>90%)
Centrifugę niskoprężną	BEIJING ERA BEILI CENTRIFUGE	DT5-2
Przeciwciało monoklonalne przeciwko Flagowi mysiego	Sigma	F1804	Przeciwciało pierwotne, stosunek rozcieńczania 1:200; stosowane do wykrywania białka fuzyjnego z tagiem Flag w IFA
Przeciwciało monoklonalne przeciwko GAPDH mysiego	Sigma	G8795	Przeciwciało pierwotne, stosunek rozcieńczania 1:2000; stosowane jako kontrola ładowania do blotowania Western
Mleko beztłuszczowe (5%)	Beyotime	P0216	Bufor blokujący do blotowania Western; blokować w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę lub 4°C przez noc
Paraformaldehyd (4%)	Merck KGaA	30525	Roztwór do fiksacji komórek; fiksować w temperaturze pokojowej przez 30 min
PBS	Solarbio	P1010
Penicylina-streptomycyna (100×)	Yeasen	60162ES76	Antybiotyk do hodowli komórek; hamuje zakażenie mikrobiologiczne
Percoll (DG gradient stock	GE Healthcare	17-0891-09
Fenol:chloroform:alkohol izoamylowy (25:24:1)	Merck KGaA	77617	Środek do usuwania białka podczas ekstrakcji genomowej DNA
Bufor ładowania białka (6×)	Beyotime	P0015F	Bufor ładowania do elektroforeza białka; formuła: 100 mM Tris (pH 6,8), 4% SDS, 2 mM EDTA, 2% glicerol, 6 M mocznika; przed użyciem mieszaj z 50 μL 2 M DTT i 50 μL 5% bromofenolu niebieskiego
Proteinaza K	Merck KGaA	39450-01-6	200 mg rozpuszczonych w 10 mL ddH2O, stosowanych do trawienia białka podczas ekstrakcji genomowej DNA
Membranę PVDF	thermofisher	88518	Membranę do transferu białka; aktywowana metanolem przez 1 min przed użyciem
Bufor lizacyjny RIPA	Yeasen	20101	Bufor lizacyjny do ekstrakcji białka sporozoitu
RNase A	Merck KGaA	9001-99-4	25 mg rozpuszczonych w 2,5 mL 0,01 mol/L NaAc, podgrzewanych w 100°C przez 10-15 min, pH dostosowane do 7,4 za pomocą 1 mol/L Tris-HCl; stosowany do usuwania RNA z próbek DNA
Środki do przygotowania żelu SDS-PAGE (akrylamide, bis-akrylamide, tris, SDS, APS, TEMED)	Bio	101	Środki do przygotowania żelu SDS-PAGE; stężenie akrylamidu dostosowane do masy cząsteczkowej docelowego białka
Taurodeoksycholanu sodu hydrat	Sigma	T0875
Roztwór)