Method Article

Generowanie i analiza transkryptomiczna pojedynczokomórkowych raków trzębowokomórkowych po leczeniu farmakologicznym

DOI:

10.3791/70511

⸱

May 26th, 2026

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1School of Basic Medical Science, Guangzhou Medical University, 2Guangzhou Municipal and Guangdong Provincial Key Laboratory of Protein Modification and Degradation, Guangzhou Medical University, 3Affiliated Cancer Hospital and Institute, Guangzhou Medical University, 4The First Clinical School of Guangzhou Medical University, Guangzhou Medical University, 5Department of Obstetrics, Guangzhou Eighth People's Hospital, Guangzhou Medical University, 6Department of Pediatric Surgery, Guangzhou Institute of Pediatrics, Guangzhou Women and Children's Medical Center, Guangzhou Medical University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protokół ten określa uproszczoną metodę generowania raka wątrobowokomórkowego, stosowania leczenia farmakologicznego oraz sekwencjonowania RNA pojedynczych komórek przed i po leczeniu w celu scharakteryzowania zmian transkrypcyjnych związanych z leczeniem.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Rak wątrobowokomórkowy jest główną przyczyną śmiertelności związanej z nowotworami na całym świecie i charakteryzuje się wyraźną heterogenicznością wewnątrznową, co przyczynia się do zmiennych odpowiedzi leczenia, nawrotów guza oraz postępu choroby. Głębsze zrozumienie, jak komórki nowotworowe zmieniają się na poziomie transkrypcyjnym przed i po leczeniu farmakologicznym, jest zatem niezbędne dla poprawy strategii terapeutycznych. Jednak praktyczne eksperymentalne procesy łączące leczenie leków na bazie organoidów z profilowaniem transkryptomicznym pojedynczych komórek pozostają ograniczone. W tym badaniu opracowano ustandaryzowany workflow generowania raka wątrobowokomórkowego, stosowania zdefiniowanego leczenia lekowego oraz sekwencjonowania pojedynczych komórek RNA na próbkach pobranych przed i po leczeniu. Protokół obejmuje ożywienie i rozszerzenie organoidów, ocenę jakości przed leczeniem, ekspozycję na leki, przygotowanie organoidów do dysocjacji pojedynczej komórki, konstrukcję biblioteki oraz podstawową analizę porównawczą danych transkryptomicznych pojedynczych komórek. Wprowadzane są kluczowe środki ostrożności techniczne, aby poprawić powtarzalność i jakość próbki. Ten przepływ umożliwia równoległą charakterystykę składu komórkowego i zmian transkrypcyjnych związanych z leczeniem farmakologicznymi w organoidach raka wątrobowokomórkowego. Protokół jest solidny, skalowalny i adaptowalny w różnych układach organoidalnych, zapewniając praktyczną platformę do badania zmian ekspresji genów związanych z leczeniem w rozdzielczości pojedynczych komórek.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Rak wątrobowokomórkowy (HCC) jest najczęstszym pierwotnym rakiem wątroby u dorosłych i główną przyczyną zgonów związanych z nowotworami na całym świecie 1,2,3. Słaby wynik kliniczny wynika ze znacznej heterogeniczności wewnątrzguza, co prowadzi do oporności na leczenie i nawrotu4. Najnowsze badania wskazują, że różnorodność rozwojowa i plastyczność stanów komórkowych, napędzana kluczowymi programami transkrypcyjnymi, takimi jak oś FOXM1/CEBPB, przyczyniają się do oporności terapeutycznej w HCC5. Te wyniki podkreślają potrzebę zr....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Badania z wykorzystaniem ludzkich tkanek zostały przeanalizowane i zatwierdzone przez Komitety ds. Etycznego Przeglądu Badań Uniwersytetu Medycznego w Kantonie (nr zatwierdzenia GYZL-2024-KY31). Wszystkie procedury z udziałem próbek ludzkich były przeprowadzane zgodnie z wytycznymi instytucjonalnymi dotyczącymi badań na ludziach. Wszyscy pacjenci uzyskali pisemną świadomą zgodę na wykorzystanie ich próbek klinicznych do badań medycznych. Odczynniki i używany sprzęt są wymienione w Tabeli Materiałów.

Ten przepływ pracy obejmuje odzyskiwanie i rozszerzanie krioprezerwacji raka hepatokomórkowych organoidów z drobnymi adaptacja....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Rysunek 1 przedstawia powstawanie i charakteryzację organoidów raka wątrobowokomórkowego (HCC). Na Rysunku 1A do ustanowienia hodowli organoidów do analizy histologicznej i badań leczenia wykorzystano tkanki nowotworowe pochodzące od pacjentów. Rysunek 1B pokazuje obrazy organoidów w jasnym polu w dniach 1 i 6 po odzyskaniu, pokazując przeżywalność i ekspansję w standardowych warunkach trójwymiarowej hodowli. Od pierwszego dnia orga.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aby zapewnić powtarzalność, efektywność i wysokiej jakości analizę transkryptomii pojedynczych komórek, kilka technicznych etapów w tym procesie wymaga starannej kontroli. Konsekwencja podczas ożywienia i rozszerzania organoidów HCC pochodzących od pacjenta jest kluczowa, ponieważ różnice gęstości nasiew, składu matrycy błony podstawnej oraz czasu hodowli mogą wpływać na morfologię, wzrost oraz reakcje na leczenie w dalszej fazieleczenia 13,14. Ponadto wysoka żyw.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają żadnych konfliktów interesów do ujawnienia.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Badania te były wspierane przez Narodową Fundację Nauk Przyrodniczych Chin (82303022; 82122048; 82372714; 82203380), Fundację Badań Podstawowych i Stosowanych Guangdong (2023A1515011416) oraz Fundację Badań Podstawowych i Stosowanych w Kantonie (2024A04J6575). Niektóre elementy schematu zostały stworzone przy użyciu Home for Researchers (https://www.home-for-researchers.com) i zostały zaadaptowane przez autorów. Schematyczne ilustracje zostały stworzone przy użyciu Figdraw (https://www.figdraw.com) i zaadaptowane przez autorów.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
[Leu15]-gastrin I ludzkiMerckG9145
Mikrorurki 1,5 mLMerckAXYMCT150LC
Bufor lizy 1X RBCThermo Fisher Scientific00-4333-57
2,0 ml fiolki kriogeniczne z nitem wewnętrznymGniazdo607001
A8301 (inhibitor TGFb)Tocris Bioscience2939
Przeciwciało poliklonalne AFPProteintech14550-1-AP
Przeciwciało antyalbuminowe [ALB/2144]abcamab236492
Przeciwciało anty-HNF-4-alfa [EPR16885] - Klasa ChIPabcamab181604
Przeciwciało anty-prealbuminowe [EPR3219]abcamab92469
Przeciwciało przeciw SOX9 [EPR14335-78]abcamab185966
Suplement B27 (503), minus witamina AThermo Fisher Scientific12587010
Roztwór do odzyskiwania komórek, 100 mLCorning354253Odczynnik używany do rozpuszczania matrycy błony podstawowej i odzyskiwania organoidów przed ponownym powlekiem lub dalszym przetwarzaniem
CellTiter-Glo®   Analiza żywotności komórek 3DPromegaG9681
CHIR99021MerckSML1046
Chromium Next GEM Single Cell 3' GEM, Biblioteka & Biblioteka & Zestaw Gel Bead v3.110x GenomicsCG000227
Sitnik komórek Corning, 40 & mu; m, Niebieski, S, IND, 1/50Corning431750
Costar 24-dołkowy przezroczysty płaski dno Ultra-niskie mocowanie Wielodołkowe płytki, indywidualnie owinięte, sterylneCorning3473
Cultrex Obniżony Czynnik Wzrostu BME, Typ 2 PathClear (BME)Merck3533-005-02Macierz zewnątrzkomórkowa wykorzystywana do wspierania trójwymiarowej hodowli organoidów i tworzenia kopuły
DMSOMerckC6164Rozpuszczalnik używany do przygotowywania roztworów zapasowych leków i kontroli pojazdów
Zmodyfikowany Eagle Medium firmy Dulbecco/F-12 HamThermo Fisher Scientific12634028Zaawansowany DMEM/F-12
E7080 (Lenvatinib)SelleckS1164Inhibitor kinazy tyrozyny stosowany do leczenia organoidów i terapeutycznej perturbacji
Wartość płodowej surowicy bydłej FBSGibcoA5256701
ForskolinTocris Bioscience1099
Suplement GlutaMAXThermo Fisher Scientific35050061
Zestaw do barwienia hematoksyliny i eozynyBeyotimeC0105S
HEPES, 1 MThermo Fisher Scientific15630080
Mikroskop zmotoryzowany Leica DM6 B FluorescencjiLeicaNie ma
Suplement N2 (1003)Thermo Fisher Scientific17502048
N-acetylocysteinaMerckA0737-5MG
NikotynamidMerckN0636
Nunc 15 mL stożkowe rurki do wirówki z polipropylenemThermo Fisher Scientific339651
Penicylina/streptomycyna (10 000 U/mL)Thermo Fisher Scientific15140122
Sól fizjologiczna z buforem fosforanowymBIOGRAFIA GENOMUGNM20012Bufor używany do płukania organoidów i przygotowania próbek do dalszego przetwarzania
Rekombinowany ludzki EGFPeprotechAF-100-15
Rekombinowany ludzki FGF10Peprotech100-26
Rekombinowany ludzki HGFPeprotech100-39
Rekombinowany ludzki NogginPeprotech120-10°C
Inhibitor kinazy Rho Y-27632 dichlorekMerckY0503Inhibitor ROCK stosowany w celu zwiększenia przeżywalności organoidów po rozmrażeniu lub przechodzeniu
Medium warunkowane R-spodin1(Broutier i in.)Nie maWydzielanie linii komórkowych
Trypan Blue Stain, 0,4% filtrowany błonowo, przygotowany w 0,85% soli fizjologicznejGibco15250061
Enzym TrypLE Express (1x), bez fenolu czerwonegoThermo Fisher Scientific12604013Substytut trypsyny
Medium kondycjonowane Wnt-3a(Broutier i in.)Nie maWydzielanie linii komórkowych

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Hepatocellular Carcinoma OrganoidsSingle Cell RNA SequencingDrug Treatment ResponseOrganoid Drug ScreeningOrganoid DissociationCell Viability AssayOrganoid Morphology AnalysisGene Expression ProfilingTumor HeterogeneityPathway Enrichment Analysis

Related Articles