Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Generowanie i analiza transkryptomiczna pojedynczokomórkowych raków trzębowokomórkowych po leczeniu farmakologicznym

495 wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/70511

⸱

26 maja 2026

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1School of Basic Medical Science, Guangzhou Medical University, 2Guangzhou Municipal and Guangdong Provincial Key Laboratory of Protein Modification and Degradation, Guangzhou Medical University, 3Affiliated Cancer Hospital and Institute, Guangzhou Medical University, 4The First Clinical School of Guangzhou Medical University, Guangzhou Medical University, 5Department of Obstetrics, Guangzhou Eighth People's Hospital, Guangzhou Medical University, 6Department of Pediatric Surgery, Guangzhou Institute of Pediatrics, Guangzhou Women and Children's Medical Center, Guangzhou Medical University

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Protokół ten określa uproszczoną metodę generowania raka wątrobowokomórkowego, stosowania leczenia farmakologicznego oraz sekwencjonowania RNA pojedynczych komórek przed i po leczeniu w celu scharakteryzowania zmian transkrypcyjnych związanych z leczeniem.

Streszczenie

Rak wątrobowokomórkowy jest główną przyczyną śmiertelności związanej z nowotworami na całym świecie i charakteryzuje się wyraźną heterogenicznością wewnątrznową, co przyczynia się do zmiennych odpowiedzi leczenia, nawrotów guza oraz postępu choroby. Głębsze zrozumienie, jak komórki nowotworowe zmieniają się na poziomie transkrypcyjnym przed i po leczeniu farmakologicznym, jest zatem niezbędne dla poprawy strategii terapeutycznych. Jednak praktyczne eksperymentalne procesy łączące leczenie leków na bazie organoidów z profilowaniem transkryptomicznym pojedynczych komórek pozostają ograniczone. W tym badaniu opracowano ustandaryzowany workflow generowania raka wątrobowokomórkowego, stosowania zdefiniowanego leczenia lekowego oraz sekwencjonowania pojedynczych komórek RNA na próbkach pobranych przed i po leczeniu. Protokół obejmuje ożywienie i rozszerzenie organoidów, ocenę jakości przed leczeniem, ekspozycję na leki, przygotowanie organoidów do dysocjacji pojedynczej komórki, konstrukcję biblioteki oraz podstawową analizę porównawczą danych transkryptomicznych pojedynczych komórek. Wprowadzane są kluczowe środki ostrożności techniczne, aby poprawić powtarzalność i jakość próbki. Ten przepływ umożliwia równoległą charakterystykę składu komórkowego i zmian transkrypcyjnych związanych z leczeniem farmakologicznymi w organoidach raka wątrobowokomórkowego. Protokół jest solidny, skalowalny i adaptowalny w różnych układach organoidalnych, zapewniając praktyczną platformę do badania zmian ekspresji genów związanych z leczeniem w rozdzielczości pojedynczych komórek.

Wprowadzenie

Rak wątrobowokomórkowy (HCC) jest najczęstszym pierwotnym rakiem wątroby u dorosłych i główną przyczyną zgonów związanych z nowotworami na całym świecie 1,2,3. Słaby wynik kliniczny wynika ze znacznej heterogeniczności wewnątrzguza, co prowadzi do oporności na leczenie i nawrotu4. Najnowsze badania wskazują, że różnorodność rozwojowa i plastyczność stanów komórkowych, napędzana kluczowymi programami transkrypcyjnymi, takimi jak oś FOXM1/CEBPB, przyczyniają się do oporności terapeutycznej w HCC5. Te wyniki podkreślają potrzebę zrozumienia, jak populacje komórek nowotworowych adaptują się i przechodzą między stanami pod długotrwałą presją leczenia. Jednak większość modeli przedklinicznych nie oddaje w pełni dynamicznego, ciągłego charakteru tych przejść stanów związanych z leczeniem, co ogranicza mechanistyczne badania adaptacji guza i niepowodzenia terapeutycznego.

Organoidy pochodzące od pacjentów (PDO) stanowią użyteczną platformę do tego celu, ponieważ zachowują istotne zmiany genomowe oraz heterogeniczność komórek oryginalnego guza6. Organoidy HCC mogą być utrzymywane w hodowli długoterminowej, zachowując jednocześnie kluczowe cechy tkanki7, co czyni je szczególnie odpowiednimi do badań odpowiedzi na leczenie. Ponadto badania oparte na organoidach wykazały wykonalność wykorzystania organoidów raka wątroby do testów lekowych oraz do uchwycenia różnic między pacjentami i wewnątrzguzowymi w wrażliwości terapeutycznej, co potwierdza ich wartość jako modeli przedklinicznych badań nad leczeniem i odpowiedzią 8,9. Jednak większość badań nad lekami opartymi na organoidach nadal opiera się głównie na pomiarach żywotności końcowych lub koncentruje się głównie na masowych odpowiedziach fenotypowych, dostarczając tym samym tylko ograniczone informacje o heterogenicznych odpowiedziach komórkowych i zmianach transkrypcyjnych związanych z leczeniem. Równolegle szybki rozwój strategii terapeutycznych opartych na RNA dla HCC dodatkowo podkreśla potrzebę istnienia systemów przedklinicznych, które potrafią dokładnie przewidywać i mechanistycznie rozkładać odpowiedzi leczenia z rozdzielczością pojedynczych komórek10.

Sekwencjonowanie RNA pojedynczych komórek (scRNA-seq) umożliwia wysokorozdzielczą charakterystykę składu komórkowego i stanów transkrypcji w modelach organoidalnych11. Stosowane do organoidów pobranych przed i po leczeniu, scRNA-seq może ujawnić zmiany w ekspresji genów, przesunięcia populacji komórek oraz odpowiedzi heterogeniczne, które nie są uchwycone przez testy masowe. To podejście stanowi zatem praktyczną i skuteczną strategię badania remodelowania transkrypcyjnego związanego z leczeniem w organoidach HCC. Jednak praktyczny, powtarzalny sposób pracy integrujący hodowlę organoidów HCC, leczenie farmakologiczne oraz sekwencjonowanie RNA pojedynczych komórek przed i po leczeniu pozostaje niewystarczający. Taki przepływ pracy jest najskuteczniejszy, gdy podczas ekspozycji na leki zachowana jest integralność organoidów i odzyskiwana jest wystarczająca liczba żywotnych komórek do dalszego profilowania pojedynczych komórek. Podobnie jak w przypadku innych metod narządowych, ważne ograniczenia obejmują niepełną reprezentację stromalnych, naczyniowych i immunologicznych komponentów mikrośrodowiska nowotworowego, a także potencjalne błędy selekcji podczas długotrwałej hodowli in vitro.

Opisany jest zintegrowany eksperymentalny workflow do generowania organoidów HCC, stosowania zdefiniowanego leczenia leków oraz przetwarzania próbek organoidów do sekwencjonowania RNA pojedynczych komórek przed i po leczeniu. Ten proces obejmuje przywracanie i rozszerzanie organoidów, ocenę jakości przed leczeniem, kontrolowaną ekspozycję na leki oraz sekwencjonowanie pojedynczych komórek RNA dopasowanych próbek. Podejście to zapewnia praktyczne ramy do porównywania, w rozdzielczości pojedynczej komórki, zmian związanych z leczeniem w składzie komórkowym i programach ekspresji genów w organoidach HCC.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Badania z wykorzystaniem ludzkich tkanek zostały przeanalizowane i zatwierdzone przez Komitety ds. Etycznego Przeglądu Badań Uniwersytetu Medycznego w Kantonie (nr zatwierdzenia GYZL-2024-KY31). Wszystkie procedury z udziałem próbek ludzkich były przeprowadzane zgodnie z wytycznymi instytucjonalnymi dotyczącymi badań na ludziach. Wszyscy pacjenci uzyskali pisemną świadomą zgodę na wykorzystanie ich próbek klinicznych do badań medycznych. Odczynniki i używany sprzęt są wymienione w Tabeli Materiałów.

Ten przepływ pracy obejmuje odzyskiwanie i rozszerzanie krioprezerwacji raka hepatokomórkowych organoidów z drobnymi adaptacjami do dalszych terapii i sekwencjonowania RNA pojedynczych komórek. Celem jest wygenerowanie hodowli organoidów o odpowiedniej jakości i spójności dla kolejnych eksperymentów leczenia farmakologicznymi12.

1. Ustanowienie i rozszerzenie organoidów pochodzących od pacjentów HCC

  1. Rozmrażanie i odzyskiwanie kriokonserwowanych organoidów
    1. Przygotowanie przed rozmrażeniem
      1. Podgrzej kąpiel wodną do 37 °C. Urządź wstępne wyważenie płytki z 24 dołkami w inkubatorze 37 °C przez co najmniej 1 godzinę przed pokryciem.
      2. Przygotuj wcześniej kompletne pożywkę do hodowli organoidów i trzymaj ekstrakt z błony podstawnej (BME) na lodzie do czasu użycia. Skład kompletnego pożywki hodowlanej organoidów przedstawiono w Tabeli Uzupełniającej 1.
    2. Rozmrażanie organoidów
      1. Usuń krioviale zawierające zamrożone organoidy HCC ze zbiornika ciekłego azotu i natychmiast umieść je w kąpieli wodnej o temperaturze 37 °C.
      2. Delikatnie porusz fiolkę i zatrzymaj rozmrażanie, gdy zostanie tylko mały kryształ lodu.
    3. Usunięcie krioprotektantu
      1. Delikatnie pipetować rozmrożoną zawieszkę raz, aby ponownie zawiesić zawartość.
      2. Przełóż zawiesinę do stożkowej probówki o pojemności 15 mL zawierającej 3–5 ml kompletnego medium do hodowli organoidów.
      3. Wirować w 300 × g przez 5 minut w 4 °C. Ostrożnie zasysaj i wyrzucaj supernatant, nie naruszając granulki.
  2. Osadzanie i ponowne pokrycie organoidów
    1. Przygotowanie mieszanki odzyskiwanej
      1. Ponownie zawiesij pellet organoidalny w kompletnym pożywce hodowlanym organoidów. Skład kompletnego pożywki hodowlanej organoidów przedstawiono w Tabeli Uzupełniającej 1.
      2. Delikatnie wymieszaj z równą ilością lodowatego BME, aby uzyskać mieszankę do talerza.
        UWAGA: Utrzymuj mieszankę na lodzie, aby zapobiec przedwczesnej polimeryzacji.
    2. Płytowanie kopuł organoidalnych
      1. Do każdego dołku podgrzanej płyty 24-dołowej należy wydać 50 μL mieszaniny organoidów i matrycy.
      2. Inkubuj w temperaturze 37 °C przez 30 minut, aby umożliwić zastygnięcie matrycy.
      3. Do każdego odwiertu wzdłuż ściany odwiertu należy dodać 500 μL kompletnego pożywki hodowlanego organoidalnego z dodatkiem 20 μM Y-27632.
        UWAGA: Ogranicz użycie Y-27632 do pierwszych 2–3 dni po rozmrażeniu lub przejściu. Upewnij się, że każda kopuła pozostaje zwarta i przymocowana do dna studni, nie rozprzestrzeniając się na zewnątrz.
  3. Kultura i ekspansja organoidów
    1. Warunki hodowli rekonwalencyjnej
      1. Utrzymuj organoidy w temperaturze 37 °C z stężeniem 5%CO2.
      2. Użyj podłoża zawierającego 20 μM Y-27632 w ciągu pierwszych 2–3 dni po rozmrażeniu.
    2. Wymiana medium
      1. Wymieniaj podłoże hodowlane co 3–4 dni, stosując delikatną aspirację.
      2. Dodaj świeży podłoże wzdłuż ściany każdego odwiertu, aby nie zakłócać kopuł matrycy.
      3. Utrzymuj ten sam harmonogram wymiany medium we wszystkich odwiertach w ramach tego samego eksperymentu.
    3. Monitorowanie wzrostu
      1. Monitoruj odzyskiwanie i rozszerzanie organoidów za pomocą mikroskopu jasnego pola przy stałych ustawieniach obrazowania.
      2. Rejestruj reprezentatywne obrazy w określonych punktach czasowych podczas odzyskiwania i ekspansji.
      3. Potwierdza się pomyślne odzyskanie, gdy większość struktur pozostaje nienaruszona, organoidy wykazują morfologię okrągłą do owalnej z gładkimi brzegami, obserwuje się stopniowe powiększanie w czasie, a obecność minimalnych zanieczyszczeń lub zawalonych struktur.
      4. Wykluczyć odwierty zawierające mniej niż 10 nienaruszonych organoidów z analizy ilościowej w dalszej fazie.
    4. Kryteria przejścia i rozszerzenia
      1. Obserwuje się organoidy przejściowe po stabilnej ekspansji.
      2. Potwierdzaj stabilną ekspansję poprzez powtarzalne zwiększenie rozmiaru organoidów lub całkowitej powierzchni przy zachowaniu morfologii.
      3. Stosuj spójne kryteria interwału obrazowania, powiększenia i uwzględnienia w różnych eksperymentach.
      4. Generuj reprezentatywne krzywe wzrostu na podstawie powierzchni organoidów lub liczb, aby potwierdzić stabilność.
    5. Kryteria dalszych eksperymentów
      1. Używaj linii organoidalnych, które wykazują stabilny trójwymiarowy wzrost, nie wykazują skażenia ani rozległego zapadania się oraz zapewniają wystarczającą wydajność dla równoległych warunków eksperymentalnych.
      2. Utrzymuj hodowle przez co najmniej 7–10 dni po rozmrażeniu lub do zakończenia procesu odbudowy i jednego cyklu ekspansji.
      3. Przesuwaj tylko linie organoidalne wykazujące spójną morfologię na odwierzach replikacyjnych.

2. Przygotowanie organoidów do terapeutycznej perturbacji

  1. Ocena jakości przed leczeniem
    1. Ocena oparta na morfologii
      1. Potwierdź, że organoidy mają morfologię okrągłą lub owalną.
      2. Potwierdź, że organoidy mają gładkie i wyraźnie zdefiniowane granice.
      3. Potwierdź minimalną ilość komórkowych szczątków w kopule.
      4. Wyklucz hodowle z rozległą fragmentacją, ciemnymi lumenami, rozległym zapadaniem się lub oczywistym skażeniem.
    2. Ocena stanu ekspansji
      1. Używaj wyłącznie hodowli organoidów, które zakończyły regenerację i weszły w stabilną ekspansję.
      2. Potwierdź stopniowe powiększanie w czasie.
      3. Potwierdź spójną morfologię w odwierzach replikacyjnych.
  2. Ponowne pokrycie organoidów do leczenia farmakologicznego
    1. Odzyskiwanie organoidów z matrycy
      1. Rozpuszczaj kopuły organoidalne na lodzie, używając 1 mL roztworu do odzyskiwania lodowych komórek na odwiert przez 15–20 minut.
      2. Delikatnie pipetuj co 5 minut podczas inkubacji.
      3. Wiruj odzyskaną zawiesiną w 300 × g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.
      4. Ponownie zawiesić pellet w pełnym pożywce hodowlowym organoidalnym.
    2. Standaryzacja przed ponownym pokładaniem
      1. Standaryzuj początkowe obciążenie organoidami w studniach przed leczeniem farmakologicznym.
      2. Określ żywotną liczbę komórek po częściowej dysocjacji, gdy to możliwe.
      3. Normalizuj próbki do tej samej liczby komórek wejściowych na studnię.
      4. Nakładać około 1 000–5 000 żywotnych komórek na odwór w formacie 24-dołkownym.
      5. Jeśli nie jest wykonywane bezpośrednie liczenie komórek, normalizuj to poprzez zapewnienie porównywalnej liczby morfologicznie nienaruszonych organoidów w dołku oraz podobnego rozkładu wielkości między grupami.
      6. Zapisz początkową liczbę organoidów i morfologię wyjściową dla każdego z nich na długo przed leczeniem.
      7. Stosuj identyczne kryteria włączenia i strategię platingu we wszystkich dołkach w tym samym eksperymencie.
    3. Ponowne nakładanie do leczenia uzależnień
      1. Zmieszanie odzyskanych organoidów z lodowatą matrycą błony podstawnej w końcowym stężeniu 30%–50%.
      2. Do każdej studni płyty z 24 dołkami należy wprowadzić kopuły o pojemności 50 μL.
      3. Inkubuj w temperaturze 37 °C przez 30 minut, aby umożliwić polimeryzację.
      4. Dodaj 500 μL kompletnej hodowli organoidów na odwiert wzdłuż ściany odwiertu.
        UWAGA: Upewnij się, że każda kopuła pozostaje zwarta i przymocowana do dna studni, nie rozprzestrzeniając się na zewnątrz. Użyj identycznej objętości kopuły i stężenia matrycy we wszystkich studniach w tym samym eksperymencie.
  3. Powrót do zdrowia przed leczeniem farmakologicznym
    1. Odzysk po ponownym pokryciu
      1. Pozwól organoidom na regenerację przez noc w standardowych warunkach hodowlanych.
      2. Leczenie rozpocznij dopiero po przywróceniu nienaruszonej morfologii w obrębie ponownie pokrytych kopuł.
    2. Kryteria wejścia do leczenia uzależnień
      1. Leczenie farmakologiczne należy rozpocząć tylko wtedy, gdy organoidy pozostają nienaruszone po ponownym pokryciu warstwy, nie występuje rozległe zapadanie się ani nadmierne ilości zanieczyszczeń, a obciążenie organoidami jest porównywalne w różnych odwiertach.
      2. Przed zabiegiem należy rejestrować zdjęcia w jasnym polu dla wszystkich grup eksperymentalnych.
      3. Zachowanie identycznego początkowego obciążenia organoidów, czasu regeneracji po ponownym powłocie oraz czasu rozpoczęcia leczenia we wszystkich kontrolnych i leczonych studniach.
  4. Kwestie bezpieczeństwa
    1. Wykonuj wszystkie procedury z udziałem organoidów pochodzenia ludzkiego, używając odpowiedniego sprzętu ochrony osobistej oraz praktyk biobezpieczeństwa.
    2. Ostrożnie obchodzić się z enzymatycznymi odczynnikami dysocjacyjnymi, aby uniknąć ekspozycji skóry lub oczu.
    3. Utylizacja ciekłych i stałych odpadów biologicznych zgodnie z instytucjonalnymi przepisami dotyczącymi biobezpieczeństwa.

3. Leczenie farmakologiczne organoidów HCC

  1. Przygotowanie i leczenie leków
    1. Przygotowanie leków
      1. Przygotuj roztwór lenvatinibu w DMSO zgodnie z instrukcjami producenta.
      2. Rozcieńcz roztwór wywarczy w podgrzewanym medium kulturowym tuż przed użyciem do określonej koncentracji roboczej.
      3. Utrzymuj identyczne końcowe stężenie DMSO we wszystkich odwiertach (≤ 0,1%).
      4. Przygotuj odpowiednią objętość, aby zapewnić równą końcową objętość oczyszczania w każdym odwiercie.
    2. Leczenie uzależnień
      1. Dodaj medium zawierające lenwatyn (20 μM) wzdłuż ściany każdego otworu, aby uniknąć zakłócania kopuł matrycy.
      2. Uwzględnij kontrolę pojazdu z tym samym końcowym stężeniem DMSO.
      3. Inkubować organoidy w standardowych warunkach hodowli przez określony czas leczenia.
      4. Wymiana podłoża zawierającego lek co 48–72 godziny na czas trwania leczenia dłuższego niż 72 godziny.
      5. Stosuj ten sam harmonogram wymiany medium we wszystkich studniach w eksperymencie.
      6. Przed zabiegiem nagraj zdjęcia w jasnym polu bazowym.
      7. Wykonuj zdjęcia w stałych odstępach czasu podczas zabiegu, używając identycznych ustawień mikroskopu, powiększenia i pozycji pola.
  2. Ocena odpowiedzi na leczenie
    1. Ocena oparta na morfologii
      1. Oceń odpowiedź na leczenie, korzystając z następujących odczytów obrazowych: krzywa wzrostu powierzchni organoidów, średnia średnica organoidów oraz liczba zachowanych organoidów.
      2. Stosuj identyczne ustawienia ekspozycji, powiększenie i progi analizy dla wszystkich obrazów.
      3. Mierz krzywą wzrostu powierzchni organoidów, obliczając całkowitą powierzchnię organoidów na dołkę lub pole w każdym punkcie czasowym i normalizując do poziomu wyjściowego.
      4. Zmierz średnią średnicę organoidów, określając średnicę pojedynczych nienaruszonych organoidów i obliczając średnią wartość na odwiert.
      5. Określić liczbę ocalałych organoidów, licząc morfologicznie rozpoznawalne nienaruszone organoidy oraz wykluczając szczątki i zapadłe fragmenty.
    2. Opcjonalne pomiary opłacalności
      1. Wykonaj trójwymiarowy test żywotności luminescencji na punkcie końcowym leczenia, jeśli potrzebna jest dodatkowa ocena żywotności objętej.
      2. Postępuj zgodnie z instrukcjami producenta dotyczącymi wykonania testu.
  3. Analiza danych
    1. Wyznacz krzywe wzrostu powierzchni organoidów w czasie.
    2. Porównaj średnią średnicę organoidów między grupami leczonymi przez wehikuerium a lenvatinibem.
    3. Porównaj liczbę ocalałych organoidów między grupami leczenia.
    4. Stosuj identyczne harmonogramy pozyskiwania obrazów, kryteria włączenia organoidów oraz parametry analizy we wszystkich grupach, aby zapewnić powtarzalność.

4. Przygotowanie organoidów do sekwencjonowania RNA pojedynczych komórek

  1. Selekcja i odzysk organoidów
    1. Ocena przeddysocjaccyjna
      1. Wybrane studnie organoidalne, które wykazują nienaruszoną morfologię trójwymiarową bez szerokiego zapadania się, zawierają wystarczającą ilość materiału do przechwytywania pojedynczych komórek w dalszej części i nie wykazują widocznego skażenia.
      2. Zbieranie organoidów w zgodnych punktach czasowych eksperymentów w próbkach kontrolnych i obtraktowanych.
      3. Utrzymuj identyczną gęstość powłoki, harmonogram leczenia oraz warunki wymiany medium dla wszystkich próbek.
      4. Nagrywaj obrazy jasnego pola każdego wybranego na długo przed dysocjacją, używając identycznych ustawień mikroskopu, powiększenia i kryteriów wyboru pola.
    2. Usunięcie macierzy
      1. Aspiruj pożywkę hodowlową całkowicie z każdego dołku.
      2. Przepłucz każdą studnię dwukrotnie lodowatym PBS, aby usunąć pozostałości i zanieczyszczenia.
      3. Dodaj 1 ml roztworu do odzyskiwania lodowatych ogniw do każdego otworu.
      4. Inkubuj na lodzie przez 20–30 minut.
      5. Delikatnie podaj pipetę co 5–7 minut podczas inkubacji, aby ułatwić rozpuszczanie matrycy.
      6. Przenieś rozpuszczony materiał do wcześniej schłodzonych rur za pomocą szerokiego lub ciętego końcówki pipety, aby zminimalizować naprężenia ścinające.
      7. Przechodzimy do dysocjacji enzymatycznej dopiero po dużym rozpuszczeniu matrycy i minimalnym widocznym pozostałościami żelu.
  2. Dysocjacja enzymatyczna i przygotowanie zawiesiny jednokomórkowej
    1. Dysocjacja enzymatyczna
      1. Wirówka odzyskanego organoidu w stężeniu 300 × g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.
      2. Usuń supernatant ostrożnie, nie ruszając granulki.
      3. Ponownie zawiesij pellet w 1 mL enzymu do dysocjacji komórek rekombinowanych.
      4. Inkubuj w temperaturze 37 °C przez 5–10 minut.
      5. Delikatnie pipetuj 8–10 razy co 2–3 minuty, używając szerokiego końcówki P1000, aby sprzyjać dysocjacjacjom.
      6. Zatrzymaj trawienie, gdy większość fragmentów organoidów rozproszyła się do pojedynczych komórek, a pozostały tylko niewielkie skupiska resztkowe.
      7. Unikaj przedłużonego trawienia, aby zapobiec obniżeniu żywotności komórek, artefaktom transkrypcyjnym związanym ze stresem oraz zwiększonej kontaminacji RNA otoczenia.
    2. Hartowanie i filtracja
      1. Dodaj 4 mL lodowatego PBS zawierającego 2% surowicy bydlęcej płodu, aby zatrzymać trawienie.
      2. Przefiltruj zawiesinę przez sitko ogniwa 40 μm.
      3. Przeprać raz PBS, aby usunąć pozostałości enzymów, kruszy i zanieczyszczenia.
      4. Wykonaj lizę czerwonych krwinek, jeśli obecne jest skażenie erytrocytami, zgodnie z zaleceniami producenta.
    3. Przygotowanie komórek i kontrola jakości
      1. Liczenie komórek za pomocą wykluczenia trypanowego niebieskiego.
      2. Określ żywotność komórek przed przygotowaniem do biblioteki.
      3. Używaj tylko próbek o żywotności ≥ 85%.
      4. Dostosuj końcowe stężenie komórek do 700–1 200 komórek/μL.
      5. Wyklucz próbki z nadmiarem zanieczyszczeń, obfitością martwych komórek, dużymi widocznymi agregatami lub niepełną dysocjacją.
      6. Powtórz filtrację przed załadowaniem, jeśli obecne są kruszywa.
      7. Kontrolowanie procesu i obróbka próbek w identycznych warunkach, w tym enzym dysocjacyjny, czas trawienia, częstotliwość pipetowania, metoda filtracji, stężenie komórek oraz strategia ładowania.
  3. Przygotowanie i sekwencjonowanie bibliotek jednokomórkowych
    1. Przechwytywanie pojedynczych komórek i przygotowanie biblioteki
      1. Załaduj przygotowaną zawiesinę jednokomórkową na platformę przechwytywania jednokomórkowej opartej na kroplach zgodnie z instrukcjami producenta.
      2. Wykonaj transkrypcję wsteczną, amplifikację cDNA oraz budowę biblioteki przy użyciu odpowiedniego workflow pojedynczej komórki 3′.
    2. Parametry sekwencjonowania
      1. Biblioteki sekwencji o głębokości co najmniej 50 000 odczytów na komórkę.
      2. Ogniwa obciążeniowe, aby uzyskać odzyskanie około 6 000–10 000 komórek na bibliotekę.
      3. Chemia sekwencjonowania nagrań, struktura odczytu i ustawienia instrumentów.
  4. Kryteria jakości analizy dalszej
    1. Upewnij się, że końcowe przygotowanie ma wysoką żywotność komórek, minimalne zanieczyszczenia i niskie obciążenie agregatem.
    2. Potwierdźcie przydatność do dalszej analizy transkryptomicznej pojedynczej komórki heterogeniczności komórki i przejść między stanami komórkowymi.

5. Podstawowe przetwarzanie i kontrola jakości danych sekwencjonowania RNA z pojedynczych komórek

  1. Przetwarzanie pierwotne
    1. Generowanie macierzy liczenia
      1. Przetwarzaj surowe dane sekwencjonowania przy użyciu zalecanego potoku dla wybranej platformy.
      2. Generuj macierz liczenia gen po komórce.
      3. Nagraj wersję oprogramowania, odnośnikowy genom i wydawanie adnotacji transkrypcji.
    2. Początkowa ocena jakości na poziomie biblioteki
      1. Podsumuj metryki sekwencjonowania dla każdej biblioteki, w tym łączną liczbę odczytów, szacowaną liczbę odzyskanych komórek, medianę genów na komórkę, medianę UMI na komórkę oraz nasycenie sekwencjonowania (jeśli dotyczy).
      2. Używaj identycznych ustawień genomu referencyjnego i adnotacji we wszystkich próbkach.
  2. Kontrola jakości na poziomie komórek
    1. Filtrowanie komórek niskiej jakości
      1. Dla każdej komórki należy ocenić liczbę wykrytych genów, całkowitą liczbę UMI, udział transkryptów mitochondrialnych oraz dowody na podwójne lub multiplety.
      2. Wyklucz komórki o bardzo niskiej liczbie genów, bardzo niskiej liczbie UMI lub nieprawidłowo wysokich frakcjach transkryptów mitochondrialnych.
      3. Zdefiniuj progi filtrowania na podstawie rozkładu zbioru danych.
      4. Stosuj identyczne progi w dopasowanych grupach leczenia.
    2. Usunięcie prawdopodobnych dubletów
      1. Zidentyfikuj prawdopodobne dublety za pomocą odpowiedniej metody obliczeniowej.
      2. Usuń dublety za pomocą platformowego workflow wykrywania.
      3. Zastosuj tę samą strategię wykrywania dubletów we wszystkich próbkach.
  3. Normalizacja, klasteryzacja i adnotacja
    1. Normalizacja danych
      1. Normalizuj macierz filtrowanej liczby za pomocą standardowego workflow jednokomórkowego RNA-seq.
      2. Zastosuj identyczne procedury normalizacji we wszystkich próbkach.
    2. Redukcja wymiarowości i klastrowanie
      1. Wykonaj redukcję wymiarowości.
      2. Przeprowadz nienadzorowane klasteryzowanie w celu identyfikacji głównych populacji transkrypcyjnych.
      3. Wizualizuj stany komórek za pomocą metody osadzania o niskich wymiarach, takiej jak UMAP.
    3. Identyfikacja genów markerowych
      1. Identyfikacja genów markerowych za pomocą analizy różnicowej ekspresji między klastrami.
      2. Przypisz biologiczną interpretację głównych stanów komórek nabłonkowych na podstawie ekspresji markerów.
  4. Analiza porównawcza warunków leczenia
    1. Integracja metadanych
      1. Oznacz każdą komórkę warunkami leczenia, linią organoidalną pochodzącą od pacjenta oraz partią przetwarzania.
      2. Utrzymuj spójną strukturę metadanych we wszystkich próbkach.
    2. Analiza zmian związanych z leczeniem
      1. Porównaj próbki kontrolne i obtraktowane.
      2. Zidentyfikuj remodelację transkrypcyjną powiązaną z leczeniem.
      3. Zidentyfikuj zmiany w składzie stanu komórki.
      4. Zidentyfikuj populacje komórek kandydatów związane z adaptacją terapeutyczną.
      5. Interpretuj wyniki wraz z odczytami morfologii i opłacalności.
  5. Wyniki analizy danych
    1. Sgeneruj macierz liczb genów po komórkach kontrolowaną jakością.
    2. Generuj niskowymiarowe wizualizacje populacji odróżniających się transkrypcją.
    3. Zidentyfikuj geny markerowe dla głównych klastrów.
    4. Zachowanie spójności we wszystkich próbkach w genomie referencyjnym, przepływie procesu wstępnego przetwarzania, kryteriach filtrowania, strategii klastrowania oraz kryteriach adnotacji.
    5. Dokumentuj wszelkie odstępstwa specyficzne dla próbki od standardowego workflow.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Rysunek 1 przedstawia proces generowania i charakterystyki organoidów raka hepatokomórkowego (HCC). Na Rysunku 1A pokazano wykorzystanie tkanek nowotworowych pochodzących od pacjentów do utworzenia kultur organoidów do analizy histologicznej oraz badań nad leczeniem. Rysunek 1B przedstawia obrazy organoidów w polu jasnym w 1. i 6. dniu po rekonwalescencji, co demonstruje ich przeżycie i ekspansję w standardowych warunkach hodowli tr...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Aby zapewnić powtarzalność, efektywność i wysokiej jakości analizę transkryptomii pojedynczych komórek, kilka technicznych etapów w tym procesie wymaga starannej kontroli. Konsekwencja podczas ożywienia i rozszerzania organoidów HCC pochodzących od pacjenta jest kluczowa, ponieważ różnice gęstości nasiew, składu matrycy błony podstawnej oraz czasu hodowli mogą wpływać na morfologię, wzrost oraz reakcje na leczenie w dalszej fazieleczenia 13,14. Ponadto wysoka żyw...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają żadnych konfliktów interesów do ujawnienia.

Podziękowania

Badania te były wspierane przez Narodową Fundację Nauk Przyrodniczych Chin (82303022; 82122048; 82372714; 82203380), Fundację Badań Podstawowych i Stosowanych Guangdong (2023A1515011416) oraz Fundację Badań Podstawowych i Stosowanych w Kantonie (2024A04J6575). Niektóre elementy schematu zostały stworzone przy użyciu Home for Researchers (https://www.home-for-researchers.com) i zostały zaadaptowane przez autorów. Schematyczne ilustracje zostały stworzone przy użyciu Figdraw (https://www.figdraw.com) i zaadaptowane przez autorów.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
[Leu15]-gastrin I ludzkiMerckG9145
Mikrorurki 1,5 mLMerckAXYMCT150LC
Bufor lizy 1X RBCThermo Fisher Scientific00-4333-57
2,0 ml fiolki kriogeniczne z nitem wewnętrznymGniazdo607001
A8301 (inhibitor TGFb)Tocris Bioscience2939
Przeciwciało poliklonalne AFPProteintech14550-1-AP
Przeciwciało antyalbuminowe [ALB/2144]abcamab236492
Przeciwciało anty-HNF-4-alfa [EPR16885] - Klasa ChIPabcamab181604
Przeciwciało anty-prealbuminowe [EPR3219]abcamab92469
Przeciwciało przeciw SOX9 [EPR14335-78]abcamab185966
Suplement B27 (503), minus witamina AThermo Fisher Scientific12587010
Roztwór do odzyskiwania komórek, 100 mLCorning354253Odczynnik używany do rozpuszczania matrycy błony podstawowej i odzyskiwania organoidów przed ponownym powlekiem lub dalszym przetwarzaniem
CellTiter-Glo®   Analiza żywotności komórek 3DPromegaG9681
CHIR99021MerckSML1046
Chromium Next GEM Single Cell 3' GEM, Biblioteka & Biblioteka & Zestaw Gel Bead v3.110x GenomicsCG000227
Sitnik komórek Corning, 40 & mu; m, Niebieski, S, IND, 1/50Corning431750
Costar 24-dołkowy przezroczysty płaski dno Ultra-niskie mocowanie Wielodołkowe płytki, indywidualnie owinięte, sterylneCorning3473
Cultrex Obniżony Czynnik Wzrostu BME, Typ 2 PathClear (BME)Merck3533-005-02Macierz zewnątrzkomórkowa wykorzystywana do wspierania trójwymiarowej hodowli organoidów i tworzenia kopuły
DMSOMerckC6164Rozpuszczalnik używany do przygotowywania roztworów zapasowych leków i kontroli pojazdów
Zmodyfikowany Eagle Medium firmy Dulbecco/F-12 HamThermo Fisher Scientific12634028Zaawansowany DMEM/F-12
E7080 (Lenvatinib)SelleckS1164Inhibitor kinazy tyrozyny stosowany do leczenia organoidów i terapeutycznej perturbacji
Wartość płodowej surowicy bydłej FBSGibcoA5256701
ForskolinTocris Bioscience1099
Suplement GlutaMAXThermo Fisher Scientific35050061
Zestaw do barwienia hematoksyliny i eozynyBeyotimeC0105S
HEPES, 1 MThermo Fisher Scientific15630080
Mikroskop zmotoryzowany Leica DM6 B FluorescencjiLeicaNie ma
Suplement N2 (1003)Thermo Fisher Scientific17502048
N-acetylocysteinaMerckA0737-5MG
NikotynamidMerckN0636
Nunc 15 mL stożkowe rurki do wirówki z polipropylenemThermo Fisher Scientific339651
Penicylina/streptomycyna (10 000 U/mL)Thermo Fisher Scientific15140122
Sól fizjologiczna z buforem fosforanowymBIOGRAFIA GENOMUGNM20012Bufor używany do płukania organoidów i przygotowania próbek do dalszego przetwarzania
Rekombinowany ludzki EGFPeprotechAF-100-15
Rekombinowany ludzki FGF10Peprotech100-26
Rekombinowany ludzki HGFPeprotech100-39
Rekombinowany ludzki NogginPeprotech120-10°C
Inhibitor kinazy Rho Y-27632 dichlorekMerckY0503Inhibitor ROCK stosowany w celu zwiększenia przeżywalności organoidów po rozmrażeniu lub przechodzeniu
Medium warunkowane R-spodin1(Broutier i in.)Nie maWydzielanie linii komórkowych
Trypan Blue Stain, 0,4% filtrowany błonowo, przygotowany w 0,85% soli fizjologicznejGibco15250061
Enzym TrypLE Express (1x), bez fenolu czerwonegoThermo Fisher Scientific12604013Substytut trypsyny
Medium kondycjonowane Wnt-3a(Broutier i in.)Nie maWydzielanie linii komórkowych

Bibliografia

  1. Villanueva, A. Hepatocellular carcinoma. N Engl J Med. 380 (15), 1450-1462 (2019).
  2. Bray, F., et al. Global cancer statistics 2018: GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries. CA Cancer J Clin. 68 (6), 394-424 (2018).
  3. Sung, H., et al. Global cancer statistics 2020: GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries. CA Cancer J Clin. 71 (3), 209-249 (2021).
  4. Safri, F., et al. Heterogeneity of hepatocellular carcinoma: from mechanisms to clinical implications. Cancer Gene Ther. 31 (8), 1105-1112 (2024).
  5. Zhang, X. F., et al. Targeting cell-state plasticity driven by FOXM1/CEBPB axis disrupts developmental heterogeneity and therapeutic resistance in hepatocellular carcinoma. J Hepatol. 84 (2), 370-384 (2026).
  6. Thorel, L., et al. Patient-derived tumor organoids: a new avenue for preclinical research and precision medicine in oncology. Exp Mol Med. 56 (7), 1531-1551 (2024).
  7. Liu, Y., et al. A decade of liver organoids: advances in disease modeling. Clin Mol Hepatol. 29 (3), 643-669 (2023).
  8. Li, L., et al. Human primary liver cancer organoids reveal intratumor and interpatient drug response heterogeneity. JCI Insight. 4 (2), e121490 (2019).
  9. Yang, H., et al. Pharmacogenomic profiling of intra-tumor heterogeneity using a large organoid biobank of liver cancer. Cancer Cell. 42 (4), 535-551.e8 (2024).
  10. Xing, L., et al. RNA-based therapies in hepatocellular carcinoma: state of the art and clinical perspectives. Hepatoma Res. 10, 24 (2024).
  11. Aissa, A. F., et al. Single-cell transcriptional changes associated with drug tolerance and response to combination therapies in cancer. Nat Commun. 12 (1), 1628 (2021).
  12. Zhang, C. Y., et al. Development and optimization of a human hepatocellular carcinoma patient-derived organoid model for potential target identification and drug discovery. J Vis Exp. (198), e65785 (2023).
  13. Wang, Q., et al. Breakthroughs and challenges of organoid models for assessing cancer immunotherapy: a cutting-edge tool for advancing personalised treatments. Cell Death Discov. 11 (1), 222 (2025).
  14. Yang, C., et al. Modeling methods of different tumor organoids and their application in tumor drug resistance research. Cancer Drug Resist. 8, 32 (2025).
  15. Denisenko, E., et al. Systematic assessment of tissue dissociation and storage biases in single-cell and single-nucleus RNA-seq workflows. Genome Biol. 21 (1), 130 (2020).
  16. Yip, S., et al. Give them vasculature and immune cells: how to fill the gap of organoids. Cells Tissues Organs. 212 (5), 369-382 (2023).
  17. Zhou, C., et al. Standardization of organoid culture in cancer research. Cancer Med. 12 (13), 14375-14386 (2023).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Sekwencjonowanie RNA pojedynczych komórekodpowiedź na leczenie lekamiprzesiewowe badanie leków na organoidachdysocjacja organoidówtest żywotności komórekanaliza morfologii organoidówprofilowanie ekspresji genówheterogeniczność guzaanaliza wzbogacenia szlaków sygnałowych
Generowanie i analiza transkryptomiczna pojedynczokomórkowych raków trzębowokomórkowych po leczeniu farmakologicznym
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.