Oczyszczanie DNA z kolumn o średnim przepływie za pomocą 24-otworowanych stojaków

Podsumowanie

Ten protokół opisuje opłacalną metodę przyspieszenia ekstrakcji DNA plazmidowego. Wykorzystując niestandardowe, drukowane 3D stojaki kompatybilne ze standardowymi wirującymi stojakami do płytek, naukowcy mogą przetwarzać jednocześnie do 48 kolumn wirujących z kołkami lub do 116 kolumn wirujących bez kołków, co znacznie skraca czas obsługi w porównaniu z ręcznymi metodami mikrowirówkowych.

Streszczenie

Ekstrakcja kolumnowa z membraną krzemionkową jest standardem w przypadku wysokiej jakości oczyszczania DNA, ale jest pracochłonna i trudna do skalowania manualnie poza małe partie. Istniejące zautomatyzowane roboty do manipulacji płynami są często nadal zbyt drogie dla małych i średnich laboratoriów. W niniejszym artykule przedstawiono ujednolicony, półautomatyczny podchód z wykorzystaniem niestandardowo zaprojektowanych, drukowanych w technologii 3D stojaków, które pasują do standardowych rotorów płyt wirowań.

Sugerowany system pozwala na równoległe przetwarzanie do 116 standardowych komercyjnych kolumn wirowych. Konstrukcja stojaka dostosowuje się do konfiguracji "zagnieżdżonej", umożliwiając jednoczesne klarowanie lizatu (za pomocą kolumn filtracyjnych) i wiązanie DNA (za pomocą kolumn krzemionkowych) w jednym etapie wirowania. Co więcej, projekt obejmuje wspólny zbiornik na odpady, eliminując potrzebę wyrzucania przepływu z pojedynczych probówek podczas etapów płukania.

Ta metoda osiąga wydajność i czystość DNA porównywalną ze standardowymi protokołami manualnymi, ale zmniejsza łączny czas przetwarzania o około 50–70% dla partii próbek większych niż 24 (60–90 min zamiast 120–180 min). Łączny czas potrzebny na etapy, w tym filtrację lizatu, płukanie i wyrzucanie odpadów, jest zmniejszany o 5–10 min niezależnie od liczby przetworzonych próbek. Ten open-source'owy podchód sprzętowy zapełnia lukę między manualnymi miniprepami a drogą automatyzacją.

Wprowadzenie

Izolacja kwasów nukleinowych za pomocą matryc krzemionkowych została po raz pierwszy opisana w 1979 roku przez Vogelstein i Gillespie, którzy ustalili zasadniczą zasadę adsorbcji fragmentów DNA na proszku szklanym w obecności wysokich stężeń soli chaotropicznych, szczególnie jodkowy sodu¹. To przełomowe odkrycie zaoferowało bezpieczniejszą, bardziej efektywną alternatywę dla toksycznej ekstrakcji fenol-chloroformowej i pracochłonnej ultrawirowania gradientowego z chlorkiem cezu, które dominowały w tamtej epoce. Następnie, Boom i jego współautorzy znacząco zoptymalizowali tę metodę, wprowadzając tiocyjanek guanidyny (GuSCN) jako główny czynnik chaotropiczny². Ta innowacja była kluczowa, ponieważ GuSCN działa jednocześnie jako potężny środek denaturujący białka do liza komórek oraz silny inhibitor RNazek i DNAzek, zachowując w ten sposób integralność kwasów nukleinowych podczas wstępnych faz ekstrakcji.

Od początku istnienia ta technologia ekstrakcji na fazie stałej – powszechnie nazywana „metodą Booma” – przeszła znaczną rewolucję. Została przystosowana do izolacji kwasów nukleinowych z coraz bardziej złożonych matryc biologicznych, od bakterii plasmid³ i DNA genomowego⁴ do mitochondrialnego DNA eukariotycznego⁵ i DNA genomowego o wysokiej masie cząsteczkowej. Ponadto, technologia została skalowana dla zastosowań klinicznych i sądowych, w tym izolację wolnego od komórek krążącego DNA z osocza⁶, ekstrakcję uporczywego DNA roślinnego i RNA bogatego w polifenole⁷ oraz oczyszczanie kwasów nukleinowych wirusowych⁸. Dostępne są również wiele komercyjnych zestawów z kolumnami wirującymi.

Mechanizm fizykochemiczny leżący u podstaw tego procesu opiera się na destrukcji struktury wody przez jony chaotropiczne. W obecności wysokiej sile jonowej i niskiego pH, warstwy hydratacyjne otaczające zarówno fosforanowy szkielet kwasów nukleinowych, jak i powierzchnię krzemionki są usuwane (dehydratacja). Umożliwia to tworzenie mostów kationowych – zazwyczaj pośredniczonych przez Na⁺ lub chaotropiczne kationy – między ujemnie naładowanymi grupami silanolowymi na powierzchni krzemionki a grupami fosforanowymi kwasów nukleinowych. Selektywność w odniesieniu do rodzaju kwasu nukleinowego (DNA vs. RNA) i długości fragmentu osiągana jest poprzez precyzyjne modulowanie chemii buforu. Na przykład, określone stężenia soli i poziomy pH mogą sprzyjać wiązaniu długich nici genomowych nad krótkimi oligonukleotydami, lub różnicować między RNA a DNA. Dodatkowo, współczesne wersje tej technologii często zawierają zmodyfikowane powierzchnie krzemionkowe, aby zwiększyć różnicowe izotermy adsorpcji określonych gatunków kwasów nukleinowych.

Kanoniczny przepływ pracy do czyszczenia kwasów nukleinowych na bazie krzemionki przebiega przez cztery odrębne fazy: (1) Lizys, gdzie biologiczny materiał początkowy jest homogenizowany, a struktury komórkowe są rozkładane, często za pomocą warunków zasadowych lub detergentów (SDS/Triton); (2) Wyjaśnienie, gdzie odpady komórkowe, wytrącone białka i polisacharydy są usuwane, aby zapobiec zatykaniu kolumny; (3) Wiązanie, gdzie nadstan jest dostosowywany za pomocą soli chaotropicznych i etanolu, aby promować adsorpcję na membranie krzemionkowej; i (4) Płukanie, gdzie związane na membranie kwasy nukleinowe są spłukiwane buforami alkoholowymi, aby usunąć resztkowe sole i inhibitory przed elucją w buforze o niskiej sile jonowej.

Mimo że chemia tego procesu jest solidna, mechaniczna obsługa pojedynczych kolumn wirujących pozostaje znaczącą przeszkodą dla przepływu pracy o średnim przepustowości (24-100 próbek), tworząc lukę między manualną obróbką a drogimi zautomatyzowanymi systemami obsługi płynów. Istniejące podejścia do upraszczania manualnej ekstrakcji kwasów nukleinowych na kolumnach obejmują tryby próżniowe i robotyczne stanowiska do zautomatyzowanej czyszczenia^9,10,11,12.

Tryby próżniowe są zazwyczaj dostępne albo w konfiguracji swobodnego dostępu wyposażonej w 20-24 adaptery Luer do kolumn wirujących, albo w projektach przeznaczonych do użytku z 96-dołkowymi płytkami. Tryby próżniowe skonfigurowane na 20-24 próbki przyspieszają krok płukania kolumny podczas czyszczenia DNA w porównaniu z wirowaniem, ponieważ eliminują konieczność usuwania kolumn z wirówki. Chociaż ta metoda jest wygodna, może dojść do zanieczyszczenia krzyżowego, ponieważ końcówka spustowa kolumny styka się z otworem Luer trybu próżniowego. Jeśli DNA z kolumny wejdzie do otworu Luer, może zostać przeniesione do innej kolumny próbkowej podczas kolejnego użycia trybu. Aby zapobiec zanieczyszczeniu, producenci zalecają dodatkowe akcesoria^10,13; jednakże, te komplikują montaż zestawu ekstrakcyjnego i są często pomijane.

Tryby próżniowe

Protokół

1. Preparation of 3D-printed equipment

1. Drukuj stojak za pomocą drukarki 3D z wlewaną włókną plastikowym włóknem z dyszą 0,4 mm. Użyj uniwersalnego filamentu PLA, PETG lub ABS z 100% wypełnieniem. Ustaw wysokość warstwy na 0,1 mm i włącz wygładzanie powierzchni. Dostosuj ustawienia druku, aby zapewnić szczelność wodoszczelną i stabilność mechaniczną.
   UWAGA: Pliki STL dla komponentów stojaka są dostarczane w Dodatkowym pliku 1. Przestrzegaj określonych parametrów druku dla podstawowego zbiornika. Przed użyciem przetestuj zbiornik, wypełniając go 70% alkoholem etylowym i wirując w coraz dłuższych odstępach czasu (1, 2, 5, 10 i 30 min), aby potwierdzić brak wycieku lub uszkodzenia strukturalnego.
2. Sklej komponenty podstawowego zbiornika, aby utworzyć uszczelnioną jednostkę.

2. Hodowla bakterii i lizys

1. Zaszczep transformanty E. coli do 3–5 ml pożywki LB zawierającej odpowiednie antybiotyki. Inkubuj przez noc (12–16 h) w temperaturze 37 °C z mieszaniem.
2. Odsiewaj komórki wirowaniem w wirówce przy 2 000 x g przez 10 min. Odsuń nadstan.
   UWAGA: Pellety komórek można przechowywać w temperaturze -20 °C przed przetworzeniem.
3. Dodaj 250 μL buforu do zawiesiny (bufor P1 z RNase A) do pelletu. Całkowicie resuspenduj przez wirowanie lub pipetowanie.
4. Dodaj 250 μL buforu lizys (bufor P2). Mieszaj delikatnie odwracając tubę 4–6 razy.
   UWAGA: Unikaj intensywnego mieszania, aby zapobiec rozdrobnieniu genomowej DNA.
5. Dodaj 350 μL buforu neutralizacji (bufor N3). Natychmiast dokładnie wymieszaj odwracając.
   UWAGA: Powinien powstać biały osad, co wskazuje na pomyślną neutralizację.

3. Montaż jednostki filtracyjnej

1. Umieść kolumny wiązania DNA na warstwie uchwytu kolumny stojaka.
2. Umieść pokrywy kolumn w wyznaczonych gniazdach, aby zabezpieczyć je podczas wirowania.
3. Umieść kolumny klaryfikacyjne/filtrujące na warstwie kolumn filtrujących bezpośrednio nad kolumnami wiązania.
   UWAGA: Jeśli kolumny filtrujące nie są dostępne, wiruj lizat w mikroprobówkach i przenieś nadstan do kolumn wiązania.

4. Wyczyszczenie lizatu i wiązanie DNA

1. Przenieś zneutralizowany lizat z kroku 2.5 do kolumn filtracyjnych.
2. Umieść złożony stojak w wirówce z koszykiem obrotowym.
   UWAGA: Upewnij się o odpowiednim zbilansowaniu, używając koszyka z przeciwwagami o równej masie i identycznej konfiguracji.
3. Wiruj przy 2 000 x g przez 1 min. w temperaturze pokojowej.
4. Wyjmij stojak z wirówki.
5. Zdejmij i wyrzuć warstwę kolumny filtrującej.

5. Płukanie

1. Wyrzuć flowthrough z zbiornika do pojemnika na odpady. Ponownie złóż stojak z kolumnami wiązania.
2. Dodaj 500–700 μL buforu płukającego do każdej kolumny wiązania za pomocą wieloczaszczowej pipety.
3. Wiruj przy 2 000 x g przez 1 min.
4. Wyrzuć flowthrough z zbiornika.
5. Powtórz płukanie, dodając bufor płukający do każdej kolumny i wirując przy 2 000 x g przez 1 min.
   UWAGA: Kolumny mogą być przechowywane w temperaturze pokojowej lub 4 °C po płukaniu.

6. Suszenie i elucja

1. Wyjmij kolumny wiązania ze stojaka i przenieś je do 2-mL probówek do zbierania.
2. Wiruj przy >10 000 x g przez 1 min. aby osuszyć membranę.
3. Przenieś kolumny do czystych 1,5-mL probówek.
4. Dodaj 50 μL buforu elucyjnego lub wody bezpośrednio na membranę. Inkubuj przez 1 min. w temperaturze pokojowej.
5. Wiruj przy >10 000 x g przez 1 min. aby elucyjować DNA.

7. Opcjonalnie: Współosadzaniem z tlenkiem tytanu

1. Wymieszaj bufor lizys z proszkiem tlenku tytanu w stosunku objętości do masy 2:1.
2. Dodaj 250 μL zawiesiny tlenku tytanu do lizatu. Mieszaj odwracając.
3. Dodaj 350 μL buforu neutralizacji i dokładnie wymieszaj.
4. Wiruj przy 2 000 x g przez 1 min.
5. Zbierz nadstan bez zakłócania osadu.
6. Przenieś nadstan do kolumny wiązania.

Wyniki

Warianty statywów
Opracowaliśmy cztery wersje statywów odpowiednie dla szerokiego zakresu modeli wirówek, co pozwala na wykorzystanie zasobów dostępnych w różnych warunkach laboratoryjnych i uwzględnia preferencje użytkowników. Wszystkie statywy mają format 24 dołków, jednak w zależności od wersji zawierają dodatkowe miejsca na kolumny. Szczegółowe wymiary i informacje o kompatybilności znajdują się w Pliku uzupełniającym 2. Zdjęcie złożonego statywu w wysokiej rozdzielczości znajduje się na Rysunku uzupełniającym S1.

Podstawowa wersja statywu (Rycina 1) stanowi najbardziej wydajną konfigurację. Składa się ona z czterech części i ma wymiary 88 × 130 × 77 mm. Pozwala na jednoczesne użycie do 48 kolumn w przypadku stosowania kolumn z nakrętkami lub do 116 kolumn w przypadku stosowania kolumn bez nakrętek. Elementy statywu zostały zaprojektowane tak, aby zapewnić łatwość użytkowania i zminimalizować niepożądane efekty podczas wirowania. Kolumny wirówkowe umieszcza się w warstwie kolumn, która posiada rowki do wkładania nakrętek; w tych samych rowkach można również umieścić kolumny bez nakrętek. Warstwa kolumn spoczywa na zbiorniku. Otwór odpływowy kolumn znajduje się nad wycięciem w zbiorniku, co pomaga ograniczyć rozbryzgi między sąsiednimi kolumnami. Ciecz odpływa przez otwór na dnie wycięcia do zbiornika. Pojemność zbiornika wynosi około 100 mL, co pozwala na wykonanie dwóch etapów płukania przy dużym obciążeniu kolumn. W razie potrzeby nad warstwą kolumn można umieścić warstwę kolumn filtrujących, tak aby kolumny filtrujące znajdowały się powyżej i w kontakcie z kolumnami wiążącymi. Nakrętka uszczelnia warstwę zawierającą kolumny filtrujące lub wiążące, ograniczając przepływ powietrza podczas obrotów wirówki. Podstawowa wersja statywu jest kompatybilna z rotorami kubełkowymi A-2-DWP (np. Eppendorf 5804), rotorem 1770 (np. HETTICH Rotina 380) lub systemami równoważnymi.

Wersja mini statywu (Rysunek 2) jest odpowiednia dla szerokiego zakresu wirników z koszyczkami. Składa się z trzech części i ma minimalne wymiary 82,5 × 128 × 58 mm (z warstwą kolumn filtracyjnych). Pozwala na zastosowanie do 48 kolumn z zakrętkami lub do 90 kolumn bez zakrętek. Geometria tej wersji jest podobna do statywu podstawowego, jednak zewnętrzne rzędy pozycji kolumn zostały usunięte i zastąpione rowkami na zakrętki kolumn. Pojemność zbiornika różni się w zależności od wersji wydruku. Najmniejszy zbiornik (20 mL) pomieści jeden etap płukania dla około 30 kolumn; większe zbiorniki pozwalają na uzyskanie wyższej przepustowości. Warstwa kolumn filtracyjnych ma zaokrąglone krawędzie, aby umożliwić ruch koszyczków wirnika w mniejszych wirówkach. Wersja mini statywu jest kompatybilna z wirnikami z koszyczkami UC-124 (np. Accumax iFuge UC02) lub systemami równoważnymi. W przypadku użycia bez warstwy kolumn filtracyjnych, statyw jest kompatybilny z wirnikami z koszyczkami A-2-MTP (np. Eppendorf 5430) lub ich odpowiednikami.

Wersja bez zbiornika (otwarta) (Rycina 3) jest odpowiednia dla użytkowników z ograniczonym doświadczeniem w druku 3D, ponieważ zbiornik zastąpiono zewnętrznym pojemnikiem, takim jak pudełko na końcówki do pipet. Ta wersja składa się z trzech części i ma wymiary 79 × 115 × 61,5 mm. Umożliwia ona zastosowanie do 48 kolumn z nakrętkami lub do 78 kolumn bez nakrętek. Geometria jest podobna do poprzednich wersji, lecz brakuje w niej zintegrowanego zbiornika. Zamiast niego do zbierania odpadów wykorzystuje się odpowiedni pojemnik. Warstwy na kolumny i filtry mają mniej miejsc osadzenia, a warstwa filtrów zawiera gniazda stożkowe, aby uniknąć kolizji z ruchem rotora. Podstawa została zaprojektowana tak, aby pasowała do standardowych pojemników i może być stabilizowana za pomocą bocznych dystansów. Kompatybilność zależy od wybranego pojemnika, ale obejmuje rotory koszykowe A-2-DWP (np. Eppendorf 5804), rotor 1770 (np. HETTICH Rotina 380) oraz rotory koszykowe UC-124 (np. Accumax iFuge UC02).

Wersja ze statywem z pokrywką (Rysunek 4) to najprostsza konfiguracja, stosowana wraz z 24-dołkowymi głębokimi płytkami o objętości 5 mL lub 10 mL. Składa się z pojedynczego elementu o wymiarach 73 × 109 × 4 mm i umożliwia wykorzystanie do 48 kolumn. Ta wersja jest kompatybilna z każdym rotorem wirówki obsługującym odpowiedni format płytek.

Wydajność i czystość
Ekstrakcję DNA przeprowadzono w kulturach E. coli, stosując zarówno standardowy ręczny protokół z użyciem mikrocentryfugi, jak i metodę opartą na statywach. Analiza spektrofotometryczna wykazała, że jakość DNA wyizolowanego przy użyciu statywów była porównywalna z uzyskaną metodą standardową. Typowe stosunki A260/A280 w obu podejściach mieściły się w zakresie od 1,8 do 1,9. Całkowita wydajność plazmidu (µg) nie wykazała istotnych różnic pomiędzy metodą konwencjonalną a ekstrakcją z wykorzystaniem konfiguracji statywu (Rycina 5); surowe dane znajdują się w Pliku uzupełniającym 2). Zachowano również konformację plazmidu, z podobnym rozkładem form relaksowanych, linearyzowanych i superskręconych (Rycina 6).

Analiza zanieczyszczeń krzyżowych
W celu oceny potencjalnych zanieczyszczeń krzyżowych przeprowadzono eksperyment w układzie szachownicy. Kolumny wypełniano naprzemiennie roztworem bromku etydium o wysokim stężeniu (symulującym DNA o wysokim mianie) oraz wodą. Po wirowaniu przy 2 000 × g rozkład barwnika ograniczał się do obszaru odpadów bezpośrednio pod wypełnionymi kolumnami, a w sąsiednich dołkach lub na końcówkach sąsiednich kolumn nie wykryto widocznego sygnału (Rysunek 7). Obserwacje te wskazują, że konstrukcja statywu zmniejsza prawdopodobieństwo rozbryzgiwania i przenoszenia substancji między kolumnami w badanych warunkach.

Aby dalej ocenić stopień kontaminacji, przeprowadzono reakcję real-time PCR, wykorzystując amplikon jako czynnik zanieczyszczający (patrz Plik uzupełniający 2). Amplifikację wykryto wyłącznie w eluatach z kolumn, do których dodano amplikon (Rysunek 8). W przetestowanych warunkach nie stwierdzono kontaminacji krzyżowej; należy jednak pamiętać, że wyniki mogą się różnić w zależności od schematu pracy i rodzaju próbki.

Rysunek 1: Schemat podstawowej wersji montażu statywu. Rozbity widok CAD przedstawiający (A) pokrywkę, (B) warstwę kolumn filtrujących, (C) warstwę uchwytu kolumn oraz (D) zbiornik podstawowy. Statyw składa się z czterech części o wymiarach 88 × 130 × 77 mm i umożliwia jednoczesne użycie do 48 kolumn z pokrywkami lub do 116 kolumn bez pokrywek. Aby wyświetlić większą wersję tego rysunku, kliknij tutaj.

Rycina 2: Schemat montażu wersji mini statywu. Rozbity widok CAD przedstawiający (A) warstwę kolumn filtrujących, (B) warstwę uchwytu kolumn oraz (C) zbiornik bazowy. Ta wersja jest geometrycznie podobna do wersji podstawowej, jednak dwa boczne rzędy gniazd kolumn zostały usunięte i zastąpione rowkami na nakrętki kolumn. Składa się z trzech części, ma minimalne wymiary 82.5 × 128 × 58 mm (z warstwą kolumn filtrujących) i umożliwia zastosowanie do 48 kolumn z nakrętkami lub do 90 kolumn bez nakrętek. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Rysunek 3: Schemat montażu statywu w wersji bez zbiornika (otwartej). Rozbity widok CAD przedstawiający (A) warstwę kolumny filtrującej, (B) warstwę uchwytu kolumn, (C) podstawę oraz (D) pudełko na końcówki do pipet. W tej wersji zintegrowany zbiornik został zastąpiony zewnętrznym pojemnikiem, takim jak pudełko na końcówki do pipet. Konstrukcja składa się z trzech części, ma wymiary 79 × 115 × 61,5 mm i pozwala na zastosowanie do 48 kolumn z nakrętkami lub do 78 kolumn bez nakrętek. Aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku, kliknij tutaj.

Rysunek 4: Wersja zakrętka statiwów 24-dołkowych. Widok z góry (lewo) i widok z dołu (prawo). Jest to najprostsza wersja statiwu, stosowana wraz z 24-dołkowymi płytkami głębokodnoznymi o pojemności 5 mL lub 10 mL. Składa się z jednej części o wymiarach 73 × 109 × 4 mm i umożliwia użycie do 48 kolumn z nakrętkami lub bez nich. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Rycina 5: Porównanie wydajności i czystości DNA. Analiza spektrofotometryczna wydajności plazmidów (µg/mL). Nie zaobserwowano statystycznie istotnych różnic w całkowitej wydajności plazmidów pomiędzy metodą konwencjonalną a ekstrakcją z wykorzystaniem konfiguracji statywów. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Rysunek 6: Porównanie jakości DNA. Formy DNA zwizualizowano za pomocą elektroforezy w żelu agarozowym. Formy rozluźniona, linearyzowana i superzwinięta DNA są zbliżone w przypadku standardowej ekstrakcji ręcznej oraz ekstrakcji na statywie. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Rysunek 7: Ocena zanieczyszczeń krzyżowych. Widok zbiornika na odpady po wirowaniu, pokazujący oddzielne pule odpadów bez nakładania się na siebie. Kolumny napełniono roztworem bromku etydyny o wysokim stężeniu (symulującym wysoką miano DNA) oraz wodą. Po wirowaniu w sąsiednich dołkach z „wodą” ani na końcówkach sąsiednich kolumn nie zaobserwowano barwnika, co wskazuje na zmniejszenie rozpryskiwania i transferu między kolumnami w testowanych warunkach. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Rysunek 8: Analiza kontaminacji krzyżowej za pomocą ilościowego PCR. Krzywe amplifikacji dla próbek zawierających czynnik kontaminujący przedstawiono na czerwono, natomiast próbki zawierające tylko wodę przedstawiono na zielono. Amplifikację wykryto wyłącznie w próbkach zawierających czynnik kontaminujący. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Plik uzupełniający 1: Pliki modeli 3D dla projektów statywów. Ten zestaw plików zawiera pliki STL dla wszystkich konfiguracji statywów, w tym podstawowej wersji statywu, wersji mini statywu (z wieloma wariantami wysokości zbiornika), wersji bez zbiornika oraz wersji statywu na nakrętki. Poszczególne komponenty (np. zbiornik podstawowy, warstwa uchwytu kolumny, warstwa kolumny filtrującej i nakrętka) są dostarczone do druku 3D.Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Plik uzupełniający 2: Dane i metody wspierające. Ten zestaw plików zawiera tabelę kompatybilności wirówek, szczegółową procedurę testu zanieczyszczeń krzyżowych, zestawy danych surowej wydajności DNA oraz pliki wyjściowe z urządzenia do PCR powiązane z analizą zanieczyszczeń.Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Rycina uzupełniająca S1: Podstawowa wersja stelaża (całkowicie złożona). Wysokorozdzielczy obraz w pełni złożonej podstawowej konfiguracji stelaża, ilustrujący ogólną strukturę i rozmieszczenie komponentów.Prosimy kliknąć tutaj, aby pobrać ten plik.

Dyskusja

Protokół ten dotyczy "luki w przepustowości" w wielu laboratoriach biologii molekularnej. Chociaż płytki filtracyjne 96-dołkowe są szybsze, mogą wykazywać niższą pojemność wiązania lub niższe ostateczne stężenia w porównaniu z pojedynczymi kolumnami filtracyjnymi¹⁴. Adaptując standardowe kolumny filtracyjne do formatu płytki-rotora, ta metoda łączy wysoki wydajność kolumn z szybkością przepływów opartych na płytkach.

Stojak jest najbardziej korzystny przy przetwarzaniu więcej niż 12 próbek. Główną innowacją protokołu jest użycie stojaków 24-dołkowych, które upraszczają i przyspieszają ekstrakcję kwasów nukleinowych opartych na kolumnach, stosując wspólny zbiornik do usuwania nadstanów i roztworów płuczkowych. Przy użyciu stojaków czas potrzebny na wykonanie tych kroków dla 14-116 próbek jest porównywalny z czasem potrzebnym na 2-12 próbek. Ponadto wysiłek operatora jest zmniejszony, ponieważ minimalizowane są powtarzające się kroki, takie jak usuwanie pojedynczych probówek, przenoszenie kolumn, wyrzucanie roztworów płuczkowych i otwieranie nakrętek. Ponieważ oryginalne komponenty zestawu (roztwory i kolumny filtracyjne) pozostają niezmienione, oczekuje się porównywalnej jakości DNA, co jest potwierdzone przez przedstawione wyniki.

Drukowanie 3D stojaków 24-dołkowych jest możliwe za pomocą standardowego sprzętu, ale może wymagać doświadczenia w przypadku wersji podstawowych i mini. Wersje bez zbiornika i z nakrętkami są prostsze i mogą być wyprodukowane z minimalnym doświadczeniem w druku. Kluczowym zagadnieniem w modelowaniu depozycji stopionego tworzywa jest tworzenie mikroszczelin między warstwami, co może naruszyć szczelność wodoszczelną podczas wirowania. Testy wykazały, że 100% wypełnienie, grubość ściany zbiornika 7 mm i wysokość warstwy 0,1 mm zapewniają wystarczającą szczelność wodoszczelną. Ogrzewanie łożyska drukującego i zastosowanie gładzenia powierzchni dodatkowo poprawiło wydajność uszczelniania. Natomiast podejścia do uszczelniania po druku z wykorzystaniem żywic epoksydowych lub rozpuszczalników organicznych nie były skuteczne, ponieważ odkształcenie podczas wirowania prowadziło do pękania i wycieku. Niewystarczająca grubość ściany może również prowadzić do uszkodzenia strukturalnego i utraty szczelności wodoszczelnej, co może prowadzić do braku równowagi wirówki. Dlatego zaleca się przed użyciem testowanie wydrukowań.

Cztery wersje stojaków są odpowiednie dla szerokiej gamy wirówek z wirnikami beczułkowymi, pozwalając użytkownikom wybrać konfigurację, która najlepiej pasuje do ich sprzętu i wymagań dotyczących przepustowości. Podstawowa wersja stojaka zapewnia najwyższą przepustowość, ale wymaga większych wirówek i wyższej jakości druku. Wersja mini zmniejsza wymagania dotyczące wielkości wirówki, ale również zmniejsza przepustowość. Wersja bez zbiornika upraszcza produkcję i jest kompatybilna z powszechnie dostępnymi pojemnikami, takimi jak pudełka na końcówki pipet, chociaż kompatybilność zależy od geometrii pojemnika. Wersja z nakrętkami jest najprostszą konfiguracją, ale nie może być używana z kolumnami filtracyjnymi.

Kolumny filtracyjne, które nie wiążą kwasów nukleinowych, mogą być mniej dostępne niż standardowe kolumny wiążące⁹. W ich braku może być wymagane dodatkowe kroki klarowania, co zwiększa ogólny czas przetwarzania. Alternatywnie można zastosować filtrujące końcówki pipet (1000 μL) lub protokół z dwutlenkiem tytanu.

Stojak ekstrakcyjny działa jako mechaniczny dodatek do standardowych przepływów ekstrakcji DNA⁹ i nie zmienia składu buforu ani chemii kolumny (z wyjątkiem wariantu z dwutlenkiem tytanu). Zgodnie z tym nie oczekuje się znaczącego wpływu na jakość DNA, co jest zgodne z wynikami elektroforezy na żelu agarozowym i porównaniami wydajności, które pokazują podobne formy i ilości plazmidów w porównaniu z metodą standardową.

Mimo że użycie wspólnego zbiornika odpadów wprowadza potencjalne ryzyko współzakażenia, nie obserwowano tego w badanych warunkach. Kluczowa cecha projektu to "kominowa" geometria wylotów kolumn, która utrzymuje separację między końcówkami kolumn a powierzchnią płynu odpadowego. Aby zachować tę separację, zbiornik nie powinien być przepełniony, a zaleca się opróżnienie go po każdym całkowitym przepływie.

Jedną z ograniczeń metody jest maksymalna prędkość wirowania wirówek beczułkowych (zazwyczaj 2000 x g). Chociaż jest to wystarczające dla kroków wiązania i płukania, ta prędkość nie jest wystarczająca do całkowitego osuszania membrany. Dlatego wymagany jest ostatni krok wysokoprędkowego wirowania w mikrowirówce kątowej. Pomimo tego dodatkowego kroku, ogólne oszczędności czasu pozostają znaczne dla partii przekraczających 24 próbki.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
3D Printer Filament	NIT, Russia	-	Zalecane PETG lub PLA
Buffer N3	Qiagen, Netherlands	19064
Buffer P1	Qiagen, Netherlands	19051
Buffer P2	Qiagen, Netherlands	19052
Creality Ender-3 S1 Pro	Creality, China
Elution Buffer	Qiagen, Netherlands	19086
Eppendorf Centrifuge 5702	Eppendorf, Germany	22626001	Obrotowy rotor kątowy
Eppendorf Centrifuge 5804 R	Eppendorf, Germany	22625080	Obrotowy rotor talerzykowy
Ethidium Bromide	Biolabmix, Russia	EtBr-10
Frit of 1000 μL Filter Pipette Tip	GenFollower, China	E-FTB1000	Część kolumn filtracyjnych
Miniprep Without Filter Barrier Spin Column	JVLAB, China	-	Część kolumn filtracyjnych
Phenol Red	Lenreactiv, Russia	200125
PrusaSlicer	Prusa Research, Czech Republic
QIAprep 2.0 Spin Miniprep Columns	Qiagen, Netherlands	27115
RNase A	Qiagen, Netherlands	19101
Wash Buffer	Qiagen, Netherlands	19065