Cyfrowa platforma mikrofluidycznej elektroporacji do edycji genomu CRISPR z niską ilością wejściową i transfekcji mRNA w zawiesinach limfocytów T oraz modelach 3D komórek

Summary

Ten protokół opisuje zminiaturyzowaną edycję genomu CRISPR–Cas9 receptora TCRα/β w pierwotnych ludzkich komórkach T z wykorzystaniem ‘DMF-ection’, platformy elektroporacji cyfrowych mikrofluidów (DMF). Metoda umożliwia równoległą edycję genów z niskim nakładem pracy i wysoką żywotność, a ponadto jest dostosowywana do dostarczania mRNA do wielokomórkowych 3D kulek.

Abstract

Cyfrowa mikrofluidyka (DMF) umożliwia precyzyjną, małoobjętowo genetyczną manipulację komórek ssaczych, minimalizując jednocześnie wpływ na komórki nawet do 100x i zachowując ich żywotność. To badanie przedstawia wysokowydajny przepływ pracy transfekcji oparty na DMF do CRISPR-pośrednio wyłączenia lokusu TRAC w pierwotnych ludzkich zawiesinowych komórkach T oraz do transfekcji mRNA trójwymiarowych sferoidów HEK293T. Wykorzystując przestrzennie zdeponowane RNA przewodnikowe CRISPR i montaż rybonukleoprotein (RNP) na wkładce, efektywne zakłócenie lokusu TRAC zostało osiągnięte zarówno w populacjach CD4⁺ jak i CD8⁺ komórek T, używając tylko 10 000 komórek na warunek, przy czym żywotność po edycji przekraczała 85%. Charakteryzacja biofizyczna za pomocą analiz indukowanych przepływem i dyfuzji Taylora wykazała, że dodatki polimerowe stabilizują kompleksy Cas9-sgRNA w warunkach buforu elektroporacyjnego, wspierając reproduktywalne edycje w podmikrolitrowych objętościach. Przepływ pracy został dodatkowo przystosowany do zastosowań 3D poprzez dostarczenie mRNA EGFP do nietkniętych sferoidów HEK293T, co skutkowało robustną i przestrzennie jednolitą fluorescencją bez upośledzenia wzrostu czy morfologii sferoidów. Razem, wyniki te pokazują, że elektroporacja DMF umożliwia efektywne edycję genomu i dostarczanie mRNA zarówno w zawiesinowych komórkach odpornościowych jak i wielokomórkowych sferoidach. Ta platforma zapewnia skalowalne i o niskiej intensywności rozwiązanie dla zastosowań w terapii CAR-T, funkcjonalnej genomice oraz zaawansowanych 3D modelach komórkowych.

Introduction

Edycja genów w pierwotnych komórkach ludzkich staje się coraz bardziej centralna zarówno dla rozwoju terapii, jak i badań podstawowych, w tym dla zastosowań w inżynierii immunologicznej, modelowaniu rzadkich chorób i genomice funkcjonalnej¹. Chociaż elektroporacja umożliwia wysoce wydajne edycje genomu, konwencjonalne systemy oparte na kubeczkach zazwyczaj wymagają nawet milionów komórek na jedno warunku, co ogranicza ich zastosowanie do próbek pochodzących od pacjentów i rzadkich populacji immunologicznych². Ponadto systemy te są słabo przystosowane do dużej skali przesiewów z powodu ograniczeń w przepustowości, automatyzacji i zużyciu reagentów³.

Mikrofluidyczna elektroporacja stała się obiecującym podejściem do edycji genomu przy niskiej ilości wejściowej⁴. Jednak większość istniejących platform opiera się na architekturach o ciągłym przepływie, które wymagają skomplikowanych procedur zarządzania płynami, ograniczają elastyczność mieszania reagentów i wymagają stosunkowo wysokiej liczby komórek na warunek. W przeciwieństwie do tego, mikrofluidyka cyfrowa (DMF) umożliwia aktywne sterowanie dyskretnymi nanolitrowymi kroplami na płaskim słupku elektrodowym, pozwalając na precyzyjną kontrolę nad składem reakcji, czasem i lokalizacja przestrzenną. Ten format oparty na kroplkach plug-and-play jest dobrze przystosowany do przepływów o małej objętości i dużej przepustowości, gdzie konserwacja pierwotnych komórek i reagentów jest niezbędna⁵.

Ostatnie prace wykazały wykonalność dostarczania wewnątrzkomórkowego opartego na DMF przy użyciu architektur try-kropletowej elektroporacji, które generują lokalizowane, niskokomplensacyjne pola elektryczne dla wydajnego dostarczania RNP i mRNA, minimalizując przy tym stres termiczny i elektrochemiczny^6,7,8. Budując na tej podstawie, platforma elektroporacji DMF nowej generacji, nazywana ‘DMF-ection’, która obejmuje 48 niezależnie adresowalnych miejsc reakcji, pełną kompatybilność z automatyzacją i skalowalną produkcję wkładów⁹ (Rysunek 1), została opracowana. Wkład DMF składa się z dolnej płyty PCB i plastikowej górnej płyty oddzielonych uszczelką, złożonych za pomocą uchwytów ustawiających w jednej poprawnej orientacji (Rysunek 1A). Układ 48-plex jest zorganizowany w ośmiu identycznych rodzinach (Rysunek 1A-H), z których każda zawiera sześć niezależnie adresowalnych miejsc elektroporacji, obsługujących do 48 warunków edycji równolegle na jednym wkładzie (Rysunek 1B). Biblioteki RNA przewodniczących są deponowane na powierzchni podłoża za pomocą akustycznego dozownika przed montażem wkładu. Dokładność pozycyjna depozycji została potwierdzona na wszystkich 48 stanowiskach, przy czym pozycje kropel gromadziły się w odstępstwie mniejszym niż milimetrowe od środka elektrod (Rysunek 1C), co wspiera niezawodne gromadzenie RNP na wkładzie. Po załadowaniu komórki i krople elektrod płynnych są aktywowane na wkładzie, aby utworzyć geometrię try-kropletowej elektroporacji (Rysunek 1D). Po elektroporacji komórki są zdejmowane do płytek hodowlanych w celu odzyskania i dalszej analizy, w tym cytometrii przepływowej, sekwencjonowania i mikroskopii (Rysunek 1E). Ten system umożliwia wydajną edycję genomu przy użyciu do 100 razy mniej komórek niż standardowe metody oparte na kubeczkach, znacznie rozszerzając dostęp do inżynierii genomu w zastosowaniach o niskiej ilości wejściowej i dużej przepustowości.

To badanie ocenia wydajność platformy poprzez dostarczanie wielu biomolekularnych ładunków, w tym mRNA i kompleksów ribonukleoproteinowych (RNP) CRISPR-Cas9, osiągając wydajne przetoczenie i dysrupcję genu. Oprócz pierwotnych komórek T, DMF-ection zapewnia ogólną ramę dostarczania kwasów nukleinowych do złożonych struktur wielokomórkowych. Trójwymiarowe (3D) sfery i modele typu organoidalnego stanowią znaczące bariery dla przenikania reagentów ze względu na ich architekturę i delikatność, a konwencjonalne podejścia do elektroporacji często zakłócają morfologię lub generują niejednorodne dostarczanie. Aby ocenić, czy te same zasady miniaturyzacji elektroporacji użyte do edycji komórek T mają zastosowanie do zstrukturyzowanych tkanek, przepływ DMF został zastosowany do 3D sfery HEK293T. Te eksperymenty wykazały, że elektroporowanie oparte na DMF może delikatnie ustawić całe sfery w geometriach try-kropletowych i wspierać jednorodne dostarczanie mRNA, zachowując strukturę i wzrost. Chociaż wyniki te wykraczają poza opisany tutaj protokół dla komórek T, ilustrują szerszą stosowność programowalnej elektroporacji DMF dla nowych 3D systemów komórkowych istotnych dla odkrywania leków i modelowaniu chorób.

Protocol

Podstawowe ludzkie komórki T użyte w tym protokole zostały uzyskane od komercyjnych dostawców na podstawie świadomej zgody dawcy i zgodnie z obowiązującymi wytycznymi instytucjonalnymi, etycznymi i regulacyjnymi. Wszelkie manipulowanie materiałami biologicznymi pochodzenia ludzkiego przeprowadzano zgodnie z instytucjonalnymi protokołami bezpieczeństwa biologicznego. Badacze stosujący ten protokół są odpowiedzialni za zapewnienie, że ich stosowanie podstawowych ludzkich komórek jest zgodne z lokalnymi wymaganiami rady etycznej instytucji (IRB) lub komitetu etycznego, obowiązującymi przepisami bezpieczeństwa biologicznego oraz wszelkimi odpowiednimi przepisami krajowymi lub regionalnymi dotyczącymi stosowania ludzkiego materiału biologicznego. Żadne informacje identyfikujące pacjenta nie były powiązane z materiałem komórkowym użytym w tym badaniu.

1. Przygotowanie i aktywacja podstawowych ludzkich komórek T

1. Szybko rozmroź ludzkie CD3⁺ T komórki w kąpieli wodnej o temperaturze 37 °C. Przenieś komórki do podgrzanego podstawowego medium dla komórek T i wyśrodkuj przez 10 minut przy 180 × g. Odsuń nadstan i ponownie zawieś pellet w świeżym medium.
2. Wyznacz koncentrację komórek i ich żywotność za pomocą automatycznego licznika komórek.
3. Ponownie zawieś komórki w koncentracji 1 × 10⁶ komórek/mL w medium hodowlanym dla komórek T uzupełnionym o rozpuszczalne tetrameryczne przeciwciało CD3/CD28 stymulator aktywacji komórek T (zgodnie z instrukcjami dostawcy) i 200 IU/mL IL-2. Inkubuj komórki przez 72 godziny w 37 °C, 5% CO₂.
   UWAGA: Podczas aktywacji utrzymuj gęstość komórek między 0,5-2 × 10⁶ komórek/mL. Przeprowadzaj aktywację w 96-dołkowych płytkach z dnem U, aby zoptymalizować kontakt komórki z aktywatorem i efektywność aktywacji.

2. Przygotowanie plamek RNA przewodnikowego na podłożu DMF (wykańczanie akustyczne)

1. Odrodz liofilizowany sgRNA w wodzie bez nukleaz do stężenia stockowego 100 μM. W oddzielnej probówce przygotuj 100 mg/mL stock poli-L-kwasu glutaminowego (PGA, sól sodowa, masa cząsteczkowa 15 000-50 000 Da) w wodzie bez nukleaz. Połącz stockowe sgRNA i PGA w proporcji objętościowej 5:4 (sgRNA: PGA), która daje końcowe stężenie sgRNA 55,6 pmol/μL i końcowe stężenie PGA 44,4 mg/mL w wodzie bez nukleaz. Krótko zawiń w wirówce i wyśrodkuj przez 30 sekund przy 1000 × g i podziel na pojedyncze porcje jednorazowego użytku, a niezużyte porcje przechowuj w temperaturze -80 °C przez maksymalnie 6 miesięcy.
   UWAGA: Unikaj wielokrotnego zamrażania i rozmrażania.
2. Dodaj mieszaninę przewodnika-PGA do płytki źródła akustycznego o małej objętości śmierci w dołkach odpowiadających pożądanej układzie miejsca reakcji.
3. Przenieś 40 nL (równoważne 2,2 pmol sgRNA) mieszaniny przewodnika-PGA do każdego obszaru docelowego plamki na podłożu DMF za pomocą skalibrowanego akustycznego dozownika.
   UWAGA: Przy stężeniu 55,6 pmol/μL, 40 nL dostarcza 2,2 pmol sgRNA na miejsce (55,6 × 0,040 = 2,22 pmol). Suszone przewodniki są odrodzone podczas scalania kropel na karcie; pełne zawieszenie jest potwierdzone przez spójną efektywność edycji między miejscami.
4. W szafce bezpieczeństwa biologicznego pozostaw plamki, aby całkowicie osuszyły się na powietrzu w temperaturze pokojowej, aż nie zostanie żadna widoczna ciecz (około 5 minut).
   UWAGA: Nie stosuj wymuszonego przepływu powietrza ani ciepła, gdyż może to spowodować oderwanie lub degradację RNA przewodnikowego.
5. Złóż kartridż DMF.
   1. W szafce bezpieczeństwa biologicznego wyrównaj górną płytkę nad podłożem plamkowym, dopasowując asymetryczne plastikowe elementy zacięciowe z górnej płytki do wycięć na dolnej płytce. Wywierz równomierną, jednoczesną moc wzdłuż krótkich krawędzi, aż poczujesz wyraźne mechaniczne zacięcie, potwierdzające pełne zajęcie elementów zamykających.
      UWAGA: Kartridż jest zaprojektowany z jednym poprawnym ustawieniem; niewłaściwa montaż nie wyprodukuje zacięcia. Trzymaj podłoża za krawędzie zawsze, aby uniknąć skażenia lub uszkodzenia funkcjonalnych powierzchni i unikaj przesuwania podłoży ze sobą, gdyż może to zarysować powłoki powierzchniowe.
   2. Punkt kontrolny: Potwierdź poprawne złożenie poprzez mechaniczne zacięcie.
      UWAGA: Nie ma wstępnego wskaźnika elektrycznego integralności powłoki; wszelkie usterki funkcjonalne spowodowane niewłaściwym montażem są wykrywane automatycznie i zgłaszane w raporcie kontroli jakości po uruchomieniu.
      Punkt przerwy: Przechowuj nieużyte złożone kartridże w uszczelnionej paczce z suszarką (paseczki z żelem krzemionkowym) w temperaturze pokojowej przez maksymalnie 48 godzin.

Results

Oczekiwane wyniki
Elektroporacja 10 000 aktywowanych limfocytów T dla każdej warunku zazwyczaj daje ponad 85% TRAC efektywności knockoutu z ponad 95% żywotnością 72 h po transfekcji. Cytometria przepływowa ujawnia wyraźną utratę barwienia TCRα/β w warunku kierowanym na TRAC w porównaniu do kontroli bez kierowania sgRNA (NTC) i kontroli nienarażonych na żadne pola elektryczne. O ile nie zaznaczono inaczej, n reprezentuje niezależne uruchomienia DMF-ection wykonane w różnych dniach. Dane z technicznych powtórzeń z tego samego uruchomienia kartridża zostały zsumowane przed analizą statystyczną i nie wnoszą niezależnego wkładu do n. Wszystkie eksperymenty na limfocytach T zgłoszone tutaj zostały przeprowadzone przy użyciu krioprezerwowanych komórek pochodzących od jednego zdrowego dawcy. Zmienność między dawcami przy użyciu tej samej platformy jest charakteryzowana dalej⁹.

Ulepszona stabilność rybonukleoproteiny Cas9-sgRNA w warunkach elektroporacji dzięki dodatkom polimerowym o ładunku ujemnym
Kluczowym wymogiem projektowym mikrofluidyki cyfrowej jest wysoce hydrofobowa powierzchnia, która pozwala na swobodne przesuwanie kropli podczas elektrowzmaczania. Chociaż ta właściwość jest istotna dla ruchu kropel i precyzyjnego działania, tworzy wyzwania w ładowaniu reagentów. W przypadku zastosowań ekranowania szeregowego, kluczowe jest to, aby użytkownik mógł zdefiniować biblioteki ładunków, które można bezpośrednio złożyć na powierzchni kartridża. Umożliwia to dopasowanie układu reagentów do projektu biblioteki użytkownika i zapewnia, że cyfrowa mikrofluidyka może bezproblemowo realizować eksperymenty szeregowej bez dodatkowego transferu lub manualnej interwencji. Nano dyspensowanie za pomocą dyspensera akustycznego jest dobrze przystosowane do tego zadania, ponieważ może dostarczyć woluminy nanolitrów z dużą dokładnością pozycyjną na dużych siatkach na różne powierzchnie. Jednak gdy krople uderzają w hydrofobową powierzchnię kartridża, często odbijają się, perełkują lub nie rozprzestrzeniają się równomiernie, co prowadzi do niekonsekwentnego deponowania i odzyskiwania. Ta zmienność jest najbardziej widoczna przy pośrednich objętościach kropel w zakresie od 40 nL do 120 nL (Rycina 2A, n = 3 na warunek, *** p wartość < 0,01), gdzie zakłada się, że energia kinetyczna kropli jest wystarczająco duża, aby powodować odbijanie, ale przyczepność powierzchni jest niewystarczająca, aby zakotwiczać płyn. W rezultacie bezpośrednie deponowanie na kartridżu przy wyższych dawkach ładunku może być niezawodne bez dalszej modyfikacji. Aby złagodzić ten efekt, reagenty zostały uzupełnione o bezpieczny biologicznie polimer kwasu poli-L-glutaminowego (PGA). PGA jest biodegradowalnym, ujemnie naładowanym polipeptydem szeroko stosowanym jako stabilizator w formulacjach farmaceutycznych, z doskonałą kompatybilnością dla przepływów z żywymi komórkami. Zakłada się, że naładowana struktura rdzeniowa obniża kąt styku kropli i promuje bardziej jednolite rozprzestrzenianie, zmniejszając odbijanie i poprawiając przyczepność do powierzchni. W obecności PGA, zdeponowane objętości fluoresceiny skalowały liniowo z absorbancją, a wariancja była znacznie zmniejszona między kartridżami. Analiza statystyczna potwierdziła, że PGA znacząco poprawiła powtarzalność dla objętości plamowania 40, 90 i 120 nL (***p < 0,001, ****p < 0,0001), podczas gdy bardzo małe krople (10-20 nL) wykazywały niewielką różnicę, ponieważ odbijanie jest mniej wyraźne przy niskich energiach kinetycznych.

Następnie, dodatki polimerowe stosowane w przepływie DMF zostały ocenione pod kątem ich wpływu na zachowanie rybonukleoproteiny Cas9-sgRNA (RNP) w warunkach niskiego objętości buforu stosowanych do elektroporacji. W tym celu wykorzystano analizę dyspersji indukowanej przepływem (FIDA). Technologia FIDA została wybrana, ponieważ zapewnia dokładne, roztworowe pomiary promienia hydrodynamicznego i affinności wiązania, umożliwiające ilościowe określenie interakcji białko-kwas nukleinowy pod tymi samymi warunkami buforowymi, które są używane w warunkach eksperymentalnych. FIDA wykazała, że wolna sgRNA wykazywała promień hydrodynamiczny (Rh) 3,45 ± 0,26 nm, zgodny z małym, pojedynczym łańcuchem RNA. Tytulacja z Cas9 dała stabilny kompleks RNP o Rh 15,32 ± 0,46 nm i podnanomolarową affinność wiązania (KD = 0,70 ± 0,14 nM) (Rycina 2).

Aby ocenić wpływ stabilizacji polimerowej, kwas poli-L-glutaminowy (PGA) został dodany do przewodnika RNA przed utworzeniem RNP. Obecność PGA zmniejszyła pozorną affinność między Cas9 i sgRNA (K_D = 67,7 ± 9,5 nM) i zmniejszyła wielkość kompleksu do około 10 nm (Rycina 2A prawa panel). Chociaż zmniejszona affinność sugeruje mniej ściśle powiązane kompleksy, mniejszy i bardziej jednolity R_h wskazuje, że PGA zapobiega tworzeniu się nadmiernych zespołów RNP (Rycina 2B).

Discussion

Ten protokół opisuje zminiaturyzowany cyfrowy przepływ elektroporacji mikrofluidalnej, który umożliwia efektywne wprowadzanie do komórek pierwotnych ludzkich T za pomocą nanolitrowych kropel. Główną zaletą tej metody jest możliwość wykonania edycji genomu CRISPR-Cas9 używając tylko 10 000 komórek na reakcję, co znacząco zmniejsza wymagania materiałowe w porównaniu z konwencjonalną elektroporacją. Architektura oparta na kropelkach wspiera automatyzację, zapewniając reproduktywalne dostarczanie odczynników i zestawianie reakcji na wielu równoległych stanowiskach.

W poprzednich badaniach bezpośrednie porównanie platformy DMF-ection z szeroko stosowanym systemem wykazało, że konwencjonalna nukleofekcja wytwarzała mniej niż 2% komórek T dodatnich na GFP przy 10 000 komórkach na edycję, podczas gdy platforma DMF-ection osiągnęła >90% efektywności transfekcji w tych samych warunkach o niskiej liczbie komórek. W przypadku ekranowania tabliczkowego 192 warunków, platforma DMF wymagała 25 razy mniej komórek i około 50 razy mniej Cas9 na warunek niż metody konwencjonalne⁹. Te porównania podkreślają zalety materiałowe miniaturyzowanej elektroporacji DMF w zastosowaniach o niskiej liczbie komórek i ekranowania.

Kluczowe kroki i rozwiązywanie problemów
Kilka kroków jest krytycznych dla sukcesu. Dokładna kalibracja akustycznego uchwytu płynów zapewnia precyzyjne osadzanie RNA przewodzącego na podłożu wkładu, co jest istotne dla spójnego montażu RNP. Jeśli plamowanie jest niekonsekwentne lub krople nie przylegają do podłoża, zweryfikuj, czy PGA jest zawarte w mieszance RNA przewodzącego w odpowiednym stężeniu (5 mg/mL końcowym) i czy akustyczny dozownik jest skalibrowany dla konkretnej geometrii płyty źródłowej. Niekonsekwentne plamowanie w pośrednich objętościach (40–120 nL) najczęściej jest spowodowane odskakiwaniem kropli na hydrofobownej powierzchni; zwiększenie stężenia PGA lub zmniejszenie wysokości dozowania może to rozwiązać.

Utrzymanie właściwej koncentracji komórek przed załadowaniem jest ważne, ponieważ odchylenia w gęstości mogą upośledzić tworzenie kropel i zmniejszyć efektywność edycji. Jeśli efektywność edycji spada poniżej 75%, najpierw zweryfikuj, czy aktywacji komórek T było wystarczająco (potwierdź wzrost CD25 i CD69 za pomocą cytometrii przepływowej przed elektroporacją) i potwierdź, że Cas9 i sgRNA zostały połączone bezpośrednio przed załadowaniem, a nie wcześniej.

Dodatki polimerowe odgrywają ważną rolę w stabilizowaniu kompleksów Cas9-sgRNA w warunkach buforu elektroporacyjnego¹¹. Chociaż PGA zmniejsza nominalne powinowactwo wiązania, jego efekt stabilizujący poprawia reprodukowalność i zapobiega agregacji w objętościach nanolitrowych. Jest to regulowalny parametr dla badaczy adaptujących przepływ do innych kompleksów białko-RNA.

Rozwiązywanie problemów
Nieudana łączność kropel
Po każdym eksperymencie przejrzyj raport kontroli jakości po uruchomieniu. Brak wykrytego prądu wskazuje na nieudaną łączność, albo z powodu niewystarczającej liczby kropel, albo niepowodzenie w stopieniu, i jest automatycznie flagowany przez system. Dotyknięte stanowiska nie mogą być odzyskane w ramach tego samego uruchomienia. Jeśli niepowodzenia są sporadyczne (<10%), nie jest wymagana żadna akcja; rozprowadź repliki na wielu wkładach, aby zminimalizować wpływ. Jeśli niepowodzenia są systematyczne, uruchom płytę kontrolną QC i System Health Check i skontaktuj się z pomocą techniczną, jeśli problemy będą się utrzymywały.

Niekonsekwentne plamowanie sgRNA
Po dozowaniu wizualnie potwierdź, że wszystkie oczekiwane krople są obecne, wyśrodkowane w granicach elektrod i wolne od kropel satelitarnych. Włącz PGA do mieszanki RNA przewodzącego, aby zapobiec polidypersji. W przypadku brakujących kropel, sprawdź raport uruchomienia dozownika i ponownie dozuj, jeśli to konieczne. W przypadku słabego tworzenia się meniscusu, utrzymuj minimum 5 µL na dołek, krótko obracaj płytkę i delikatnie stuknij na płaskiej powierzchni. Pracuj na lodzie i uszczelniaj płytki, gdy nie są w użyciu, aby zapobiec odparowaniu.

Zmniejszona efektywność edycji
Jeśli zaobserwowano zmniejszoną efektywność edycji, rozwiązuj problemy w następującej kolejności: (1) zweryfikuj warunki dostarczania za pomocą mRNA EGFP przed przejściem do RNP; (2) potwierdź, że zmierzony prąd QC odpowiada wartościom oczekiwanym; (3) titruj gęstość komórek, RNA przewodzące i stężenie Cas9; (4) potwierdź wysoką żywotność komórek bezpośrednio przed załadowaniem; (5) zweryfikuj integralność odczynników i warunki przechowywania; (6) potwierdź, że metoda odczytu jest odpowiednia dla gęstości komórek i interesującego celu.

Adaptacja platformy do alternatywnych typów komórek i modeli
W przypadku innych pierwo

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
12 Channel VOYAGER Adjustable Tip Spacing Pipette	Integra	4732	Instrumentation
1x PBS	Gibco		Flow Buffer
96 Well Plate, Sphera Low-Attachment Surface	Thermo Fisher	174927	Spheroid protocol
96-well conical-bottom plate	Sarstedt	82.1583.001	Spheroid protocol
Alexa Fluor 647 anti-human CD4 Antibody	Biolegend	357421	1 in 200, Clone A161A1
Attune Flow Cytometer	ThermoFisher		Instrumentation
DMEM Media	Gibco	10564011	Media Supplement- Spheroid culture
DMF compatible buffer	DropGenie		Transfection
DropGenie Transfection System	DropGenie		Instrumentation
Echo Acoustic Dispenser 650 Series	Beckman Coulter Life Scienes
Echo Qualified 384-well Low Dead Volume	Beckman Coulter Life Scienes
EDTA	Invitrogen		Flow Buffer
EGFP mRNA	Trilink	L-7201
EVOS Fluorescent Microscope	ThermoFisher		Instrumentation
Fetal Bovine Serum	Gibco	16000044	Media Supplement- Spheroid culture
Fida 1 instrument and Fida Neo 480 nm detector	Fida Biosystems ApS		Instrumentation
Ghost Dye Violet 510	Cytek Biosciences	13-0870
HEK293T Cells	ATCC		Spheroid protocol
Human IL-2 Recombinant Protein,	Peprotech	200-02 50ug	T cell media supplement
Human Primary Pan CD3+ T Cells	All Cells		Peripheral Blood, Cryopreserved, pan CD3+ Helper T Cells, Negatively Selected
Immunocult CD3/CD28 Activator	StemCell Technologies	10970	T Cell Activation media
Immunocult Expansion Media	StemCell Technologies	10981	T Cell Activation media
Incucyte Live Cell Analysis System	Sartorius		Instrumentation
INTEGRA ASSIST PLUS pipetting robot	Integra	4505, 4-Position Portrait Deck (PN 4521),	Instrumentation
non targeting synthetic guide RNA	Synthego		5’ GCACTACCAGAGCTAACTCA 3'
NucleoCounter NC-202	Chemometec
PE anti-human TCR α/β Recombinant Antibody	Biolegend	380805	1 in 200, Clone QA20B12
PE-Cy 7 Anti-Human CD8	BD Pharmingen	557750	1 in 200, Clone RPA-T8
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)	Gibco	15140122	Media Supplement- Spheroid culture
Poly-L-glutamic Acid (PGA)	Sigma Aldrich	P4761-100MG	Use a at 100mg/ml
Prism version 8.0.0	GraphPad Software, Inc.		Software
sNLS-SpCas9-sNLS Nuclease	IDT	10017687
Spheroid Microplate	Corning	3830	Spheroid protocol
Surfactant F	DropGenie		Transfection- use at 1:20 in DMF compatible buffer to make compete Transfection buffer
TRAC synthetic guide RNA	Synthego		5’ AGAGTCTCTCAGCTGGTACA 3'
Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red	Gibco	25-300-062	Spheroid protocol