Łączenie zastrzyków kolagenazy z mechanicznym przeciążeniem wywołanym wysiłkiem: model myszy symulujący przeciążenie związane z przeciążeniem Urazem zwyrodnieniowym stawów kolana

Podsumowanie

Protokół ten opisuje ustanowienie mysiego modelu osteoartrozy kolana wywołanego przeciążeniem wywołanego stresem poprzez połączenie intrastawowych zastrzyków kolagenazy z nadmiernym wysiłkiem wywołanym wysiłkiem, zapewniając minimalnie inwazyjną platformę do badania patogenezy zwyrodnieniowej.

Streszczenie

Choroba zwyrodnieniowa stawów kolana (KOA) to wieloczynnikowa choroba zwyrodnieniowa, wywołana złożonym współdziałaniem biologicznej degradacji tkanek oraz długotrwałego przeciążenia mechanicznego. konwencjonalne chirurgiczne modele zwierzęce często wywołują wyzwalające zniszczenia stawów pourazowych, które nie są w stanie dokładnie odwzorować stopniowej i kumulacyjnej patogenezy ludzkiego zwyrodnieniowego KOA. Aby zniwelować tę lukę translacyjną, niniejsze badanie ustanawia nowy i powtarzalny model myszy symulujący KOA wywołany przeciążeniem wywołanym stresem poprzez synergizację łagodnej enzymatycznej degradacji chrząstki z utrzymującym się obciążeniem mechanicznym. Konkretnie, standaryzowane intraartykularne zastrzyki kolagenazy typu II łączono z codziennym mechanicznym przeciążeniem za pomocą ściśle skalibrowanego aparatu zmęczenia rotatorowego przez cztery tygodnie. Skuteczność tej interwencji dwuczynnikowej została zweryfikowana za pomocą kompleksowych analiz behawioralnych, histologicznych i molekularnych. Zautomatyzowana analiza chodu wykazała poważne deficyty lokomotoryczne w grupie połączonej. Charakteryzowały się one znacznym skróceniem długości kroku, szerokości kroku oraz powierzchni łapy w maksymalnym postawie. Oceny histomorfologiczne z użyciem zielonego barwienia safranin O-fast potwierdziły te deficyty funkcjonalne, wykazując postępujące uszkodzenia chrząstki, defekty powierzchni oraz znacząco podwyższone wyniki Osteoarthritis Research Society International (OARSI), które wiernie odzwierciedlają patologiczne cechy wczesnego i średniego stadium KOA u człowieka. Ponadto oceny immunohistochemiczne wykazały wyraźną zwiększowy-wyregulowaną zdolność kanału mechanosensulnego Transient Receptor Vanilloid (TRPV4) oraz jednoczesne zmniejszenie kluczowego białka macierzowego kolagenu typu II Alpha 1 (COL2A1) w chondrocytach stawowych. Poprzez integrację miejscowej niestabilności stawów z kontrolowanym obciążeniem mechanicznym, ta minimalnie inwazyjna strategia unika ostrych urazów związanych z modelami chirurgicznymi. Protokół ten ustanawia klinicznie istotną platformę eksperymentalną do śledzenia dynamicznych mechanizmów molekularnych, oceny fenotypów przewlekłego bólu oraz testowania długoterminowych interwencji terapeutycznych w leczeniu wczesnego stadium choroby zwyrodnieniowej stawów.

Wprowadzenie

Choroba zwyrodnieniowa stawów (OA) to wieloczynnikowa choroba zwyrodnieniowa charakteryzująca się bólem, obrzękiem, sztywnością i upośledzeniem funkcji, wynikającą z takich czynników jak otyłość, obciążenie mechaniczne oraz uraz¹. Choroba zwyrodnieniowa stawów kolana (KOA) jest bardzo powszechna i coraz częstsza wraz z wiekiem, jednak badania kliniczne często mają ograniczony zakres ze względu na różnorodne objawy kliniczne. Dlatego opracowanie skutecznych terapii wymaga odpowiednich modeli zwierzęcych². Biorąc pod uwagę wewnętrzną heterogeniczność OA, nie istnieje powszechnie akceptowany model "złotego standardu", który wymaga od badaczy identyfikacji konkretnych modeli zgodnych z ich badaniami naukowymi.

KOA jest obecnie w medycynie współczesnej charakteryzowane jako stan polegający na współdziałaniu czynników mechanicznych i biologicznych na chrząstkę stawową i tkankę okołokołościenną. Konsekwencją tej złożonej interakcji jest przede wszystkim postępujące pogorszenie się chrząstki stawowej i otaczającej jej matrycy³. Mechaniczne naprężenia stanowią kluczowy sygnał transdukcji sterujący różnymi procesami fizjologicznymi i patologicznymi w komórkach i tkankach stawów⁴. Utrzymanie chrząstki stawowej w stanie zdrowym wymagało odpowiedniego obciążenia mechanicznego w zakresie fizjologicznym. Natomiast nadmierne przeciążenie często prowadzi do degeneracji chrząstki i późniejszego wystąpienia^{KOA 5}. Modele spontaniczne są utrudnione przez znaczne nakłady czasowe i ekonomiczne⁶, podczas gdy modele indukowane chirurgicznie stosują podejście destrukcyjne, które przede wszystkim reprezentuje KOA w średnim i późnym stadium, odbiegając od naturalnej progresji degeneracyjnej ^7,8. Natomiast modele chemicznie indukowane celują w matrycę kolagenową, ale nie rejestrują kompleksowych zmian ludzkiego zwyrodnieniowego OA przy użyciu bez obciążenia mechanicznego⁹. Połączenie degradacji enzymatycznej z mechanicznym przeciążeniem wypełnia te luki, wierniej odtwarzając stopniową patogenezę urazu przeciążenia. Celem tego badania jest ustanowienie i potwierdzenie nowego modelu KOA na myszy poprzez połączenie intrastawowych iniekcji kolagenazy typu II z nadmiernym wysiłkiem przy użyciu aparatu zmęczenia z obrotowym kołem.

Protokół

Wszystkie eksperymenty na zwierzętach przeprowadzano zgodnie z protokołami zatwierdzonymi przez Komitet ds. Opieki i Wykorzystania Zwierząt Uniwersytetu Tradycyjnych Chińskich Uniwersytetu w Szanghaju. Eksperymenty były przeprowadzane na podstawie licencji projektowej (nr PZSHUTCM201016022) przyznanej przez Experimental Animal Center Uniwersytetu Etyki Tradycyjnej Medycyny Chińskiej Uniwersytetu w Szanghaju, zgodnie z Komitetem Narodowej Rady Badawczej (USA) ds. aktualizacji Przewodnika po opiece i użyciu zwierząt laboratoryjnych.

1. Protokół produkcji modeli zwierzęcych

1. Losowo przydziel 32 10-tygodniowe myszy C57BL/6 do czterech grup: kontrola, kolagenaza, nadmierna aktywność fizyczna oraz kolagenaza + nadmierna aktywność fizyczna.
   1. Wszystkie myszy przyzwyczaj przez tydzień w standardowych warunkach karmienia i trzymania przed rozpoczęciem procedur modelowania.
2. Indukować modele zwierzęce przez okres 4 tygodni zgodnie z przypisanymi grupami eksperymentalnymi.
   1. Podawaj kolagenazę typu II w formie wstrzyknięcia wewnątrzstawowej myszom z grupy kolagenazy.
   2. Poddaj myszy w grupie z nadmiernym wysiłkiem treningowi ćwiczeniowemu z użyciem urządzenia z obrotowym kołem.
   3. Stosuj zarówno zastrzyk kolagenazy wewnątrzstawowej, jak i trening z ćwiczeniami z obrotowym kołem do myszy w grupie kolagenazy + nadmiernej aktywności fizycznej.
   4. Utrzymuj dokładnie tę samą częstotliwość i czas trwania treningów we wszystkich odpowiednich grupach ćwiczeń.

2. Protokół iniekcji z kolagenazą typu II wewnątrzstawową

1. Znieczulenie
   1. Indukuj znieczulenie za pomocą izofluranu podanego za pomocą skalibrowanego gazowego aparatu do znieczulenia gazowego. Wykonaj szybką indukcję przy stężeniu izofluranu 2%–3%.
   2. Utrzymuj znieczulenie na poziomie 1,5%–2% izofluranu. Zapewnij prawidłowe działanie systemu usuwania znieczulających, aby zapobiec narażeniu zawodowemu.
   3. Monitoruj częstość oddechu i odruch myszy przez cały czas trwania zabiegu.
2. Przygotowanie skóry
   1. Nałóż krem do depilacji w okolicach lewego stawu kolana. Usuń włosy całkowicie za pomocą skrobaka.
   2. Dokładnie wyczyść odsłoniętą skórę. Utrzymuj warunki aseptyczne przez cały czas przygotowania.
3. Przygotowanie kolagenazy typu II
   1. Wyrównaj proszek kolagenazy typu II do temperatury pokojowej na 30 minut w sterylnej szafce do zabezpieczeń biologicznych. Stosuj sól fizjologiczną z buforem fosforanowym (PBS, pH 7,2–7,4) jako wyłączny rozpuszczalnik i bufor do procesu rozpuszczania.
   2. Precyzyjnie zważ wymaganą masę proszku kolagenazowego za pomocą wagi analitycznej. Powoli dodaj bezpłodny PBS do proszku, aby uzyskać końcowe stężenie robocze 0,04 U/μL.
   3. Delikatnie mieszaj roztwór, pipetując mieszankę w górę i w dół, aż będzie przezroczysta i wolna od widocznych cząstek. Unikaj gwałtownego wirowania podczas tego etapu, aby zapobiec utracie aktywności enzymatycznej.
   4. Wiruj przygotowany roztwór 0,04 U/μL z prędkością 1000 obr./min przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Usuwa to nierozpuszczone mikrocząstki i zapobiega zablokowaniu igły podczas kolejnego zastrzyku.
   5. Zassysaj supernatant do sterylnych rurek i przechowuj w kąpieli lodowej o temperaturze 4 °C do natychmiastowego użycia. Przygotuj roztwór świeżo na każdą sesję, aby zapewnić maksymalną aktywność enzymatyczną.
4. Zastrzyk śródstawowy
   1. Chwyć grzbietową skórę myszy kciukiem i palcem wskazującym niedominującej dłoni. Zabezpiecz obie kończyny dolne palcem serdecznym i małym palcem, aby naturalnie wyprostować stawy kolanowe i całkowicie odsłonić obszar wstrzyku.
   2. Trzymaj mikrostrzykawkę 10 μL wyposażoną w igłę 30 G. Włóż igłę równolegle do powierzchni skóry w powierzchniową warstwę skóry na około 0,2 cm w punkcie wejścia.
   3. Gdy opór tkanek maleje, powoli dostosowuj kierunek igły do pozycji prostopadłej względem skóry.
   4. Kontynuuj przesuwanie igły przez około 0,3–0,5 cm, aż utrata oporu oznacza wejście do jamy stawowej. Powoli wyjmij tłok strzykawki, aby potwierdzić brak refluksu krwi.
   5. Wstrzyknąć 5 μL roztworu kolagenazy typu II (stężenie: 0,04 U/μL) do jamy stawowej ze stałą prędkością¹⁰.
   6. Utrzymuj pozycję igły bezpośrednio po wstrzyknięciu. Delikatnie dociskaj skórę otaczającą miejsce wkłucia przez 10–15 sekund.
   7. Wyjmij igłę powoli. Delikatnie naciskaj punkt wejścia sterylną gazą przez 30 sekund, aby zapobiec wyciekowi leków.
   8. Umieść mysz w ciepłej i suchej klatce domowej. Pozwól zwierzęciu naturalnie dojść do siebie po znieczuleniu, które zazwyczaj trwa 5–10 minut.
   9. Po całkowitym wyzdrowieniu myszy przywróć do standardowych warunków w opiece i karmieniu.
   10. Wykonuj te iniekcje wewnątrzstawowe dwa razy w tygodniu z odstępem 3–4 dni między iniekcjami, wyłącznie w okresie modelowania 4 tygodni (po początkowej tygodniowej aklimatyzacji).
   11. Wszystkie ostre przedmioty natychmiast utylizuj do zatwierdzonych pojemników na zagrożenia biologiczne.
       UWAGA: Upewnij się, że wszystkie zastrzyki wykonuje wykwalifikowany personel, aby zminimalizować urazy stawów i zmienność eksperymentalną.

3. Protokół przeciążenia wywołanego przez koło obrotowe

1. Przygotowanie sprzętu i kontrola bezpieczeństwa
   1. Ustaw prędkość aparatu zmęczenia typu rotatorowego na 12 obr./min (równowartość około 0,063 m/s) i czas trwania na 2 godziny na sesję.
   2. Włącz moduł stymulacji elektrycznej. Sprawdź, czy aktualne wyjście mieści się w ustawionym bezpiecznym zakresie 0,1–0,3 mA. Nie zwiększaj natężenia prądu ręcznie.
      UWAGA: Używaj modułu stymulacji elektrycznej wyłącznie do kierowania myszy z powrotem do koła, a nie jako bodziec karny. Sprawdź okablowanie urządzenia pod kątem uszkodzeń i upewnij się o dobry kontakt elektrody przed uruchomieniem, aby zapobiec zwarciom i porażkom elektrycznym.
2. Szkolenie aklimatyzacyjne
   1. Upewnij się, że komory obrotowych kół aparatu zmęczeniowego są czyste, suche i wolne od zanieczyszczeń. Dezaktywuj elektrody stymulujące elektryczne przy wejściu koła, aby wyeliminować potencjalne naprężenia związane ze stymulacją.
   2. Delikatnie trzymaj każdą mysz u podstawy ogona lub wycisaj je sterylną tkanką miękką. Umieść myszy poszczególnie w centralnej części powierzchni obrotowego koła.
   3. Ustaw mysz w naturalnej, czworonożnej pozycji stojącej na poziomej powierzchni biegowej. Ustawić nadwozie równolegle do centralnej osi obrotu koła, z przednimi łapami do przodu, a tylnymi lekko do tyłu.
   4. Użyj tymczasowej, nieograniczającej miękkiej bariery, aby zapobiec wejściu myszy do wąskiej strefy elektrody w ciągu pierwszych 2 minut. Po tym czasie usuń barierę, aby mysz mogła swobodnie eksplorować całą komorę.
   5. Przez pierwsze 3 dni zostawiaj myszy w urządzeniu stacjonarnym przez 10 minut dziennie. Nie rozpoczynaj obrotu kół ani nie inicjuj żadnej stymulacji elektrycznej w tym okresie.
   6. Obserwuj mysz pod kątem oznak silnego stresu, takich jak uporczywe zamarzanie lub nadmierne wychowanie. Jeśli zachowuje się nieprawidłowo, delikatnie przesuń mysz na środkowe koło, aby przywrócić naturalną postawę.
   7. Uruchom kierownicę z prędkością 5 obr./min przez 30 minut czwartego dnia. Ten krok przyzwyczaja myszy do rytmu ruchu aparatu bez użycia sygnałów elektrycznych.
   8. Kieruj myszy ręcznie z powrotem do środka koła, jeśli spadną lub zatrzymają się podczas fazy adaptacji rytmicznej. Upewnij się, że stymulacja elektryczna pozostaje wyłączona przez cały 4-dniowy okres aklimatyzacji.
      UWAGA: Unikaj stosowania stymulacji elektrycznej podczas fazy aklimatyzacji, aby zapobiec reakcjom stresowym wywołanym strachem i zapewnić przyszłe przestrzeganie treningów.
3. Wykonanie ćwiczeń formalnych
   1. Formalne szkolenie odbywa się o określonej porze każdego dnia (np. 9:00–11:00). Noś izolowane rękawice, aby umieścić myszy w mechanizmie zmęczenia typu rotatorowego.
   2. Zamknij drzwi aparatu. Rozpocznij ustawienie parametrów 12 obr./min (~0,063 m/s) na maksymalny czas trwania 2 godzin na sesję (patrz Rysunek 1).
      UWAGA: Obserwuj myszy nieprzerwanie podczas treningu. Zatrzymaj trening na 5 minut, jeśli mysz upada ciągle (więcej niż 3 razy w ciągu 1 minuty), aby zapobiec silnemu wyczerpaniu i urazom wywołanym stresem.
4. Określenie i stymulacja punktów końcowych zmęczenia
   1. Stale obserwuj myszy, aby ocenić ich stan zmęczenia. Zakończ sesję treningową wcześniej, nie wymuszając pełnego 2-godzinnego trwania, jeśli mysz spełnia co najmniej dwa z czterech konkretnych kryteriów zmęczenia, aby uniknąć nadmiernego obciążenia.
   2. Zdefiniuj kryterium 1 jako niemożność pozostania na kole biegowym dłużej niż 5 sekund przed upadkiem. Zdefiniuj kryterium 2 jako znacząco zwiększoną częstotliwość spadków 3 lub więcej razy w ciągu 1 minuty.
   3. Zdefiniuj kryterium 3 jako brak dobrowolnej intencji powrotu do koła, gdzie mysz pozostaje nieruchoma lub porusza się tylko krótko mimo stymulacji elektrycznej.
   4. Zdefiniuj kryterium 4 jako objawienie nieprawidłowych pozycji lokomotorycznych. Zwracaj uwagę na oczywiste oznaki, takie jak przeciąganie kończyn czy chwiejny chód.
   5. Pozwól urządzeniu automatycznie wywołać delikatną stymulację elektryczną, gdy mysz spadnie do wejścia wirującego. Upewnij się, że stymulacja elektryczna natychmiast ustanie, gdy mysz wróci do koła¹¹.
      UWAGA: Natychmiast przerwać trening, jeśli mysz wykazuje nieprawidłowe schorzenia, takie jak drgawki lub duszność. Usuń mysz z aparatu i w razie potrzeby podaj leczenie objawowe.
5. Przetwarzanie po szkoleniu i częstotliwość
   1. Wyłącz zasilanie aparatu po zakończeniu treningu. Noś ocieplone rękawice, aby usunąć myszy i oddać je do domowych klatek.
   2. Zapewnij myszom odpowiednią ilość wody pitnej. Obserwuj zwierzęta pod kątem nieprawidłowej aktywności, stanu psychicznego lub problemów z kończynami (np. klaudykacji lub drżenia mięśni).
   3. Dokumentuj wszelkie nieprawidłowości i zapewniaj terminowe leczenie.
   4. Utrzymuj tę częstotliwość treningów raz dziennie, 2 godziny na sesję, przez 4 kolejne tygodnie. Utrzymuj regularne parametry treningowe i monitorowanie bezpieczeństwa przez cały okres.
      UWAGA: Przed każdą codzienną sesją treningową sprawdź, czy aparat zmęczenia i moduł stymulacji elektrycznej działają prawidłowo, aby zapewnić stałą intensywność stymulacji.

4. Analiza chodu

1. Przegląd systemu
   1. Wykonaj akwizycję i analizę chodu za pomocą zautomatyzowanego systemu obrazowania chodu.
   2. Po upływie 4-tygodniowego okresu modelowania wykonaj wszystkie procedury chodzenia na 32 10-tygodniowych myszach C57BL/6.
   3. Umieść kamerę o dużej prędkości pod przezroczystym pasem bieżni, aby uchwycić obrazy brzuszne podczas ruchu.
2. Aklimatyzacja i przygotowanie
   1. Przyzwyczaj wszystkie myszy do aparatu bieżni przed formalnym zbieraniem danych, aby zminimalizować stres.
   2. Ustaw prędkość bieżni na 20 cm/s, aby dopasować się do fizjologicznego tempa chodzenia myszy.
   3. Zapisz trzy niezależne, ważne próby na mysz z 2-minutową przerwą między próbami.
3. Nagranie próbne i wybór kroków
   1. Pozwól myszy chodzić nieprzerwanie przez 60-sekundowy okres przyswajania podczas każdej próby.
   2. Wykonaj próbę wymienną, jeśli nagranie jest nieprawidłowe z powodu "zamrożenia", skakania lub obracania.
   3. Rozpocznij zbieranie danych dopiero po osiągnięciu stabilnej, stałej ruchy przez co najmniej 10 sekund.
   4. Wybierz co najmniej 4 kolejne pełne kroki z każdego 60-sekundowego badania do analizy.
   5. Upewnij się, że dwóch niezależnych, zaślepionych obserwatorów wykona wybór kroku, aby wyeliminować subiektywne uprzedzenia.
   6. Upewnij się, że mysz utrzymuje naturalną czworonożną postawę bez podskakujących lub gwałtownych wahań prędkości.
   7. Sprawdź, czy krok obejmuje zarówno fazę pozycji nośnej, jak i fazę ruchu do przodu.
   8. Sprawdź przezroczyste zdjęcia kontaktów z taśmą łapy bez śladu, rozmycia czy zanieczyszczenia.
4. Przetwarzanie obrazu i ekstrakcja parametrów
   1. Wykorzystaj wbudowane algorytmy oprogramowania systemowego do digitalizacji przechwyconych obrazów i wykrywania punktów styku z taśmą łapy.
   2. Oblicz stosunek zamachu do postawy jako stosunek czasu trwania fazy zamachu do czasu trwania fazy postawy.
   3. Mierz długość kroku (cm) jako liniową odległość pokonaną podczas jednego pełnego kroku.
   4. Zmierz szerokość kroku (cm) jako poziomą odległość między przyśrodkowymi krawędziami przeciwległych tylnych łap w pozycji szczytowej.
   5. Określ powierzchnię łapy w szczytowej pozycji (^{cm 2}), co oznacza całkowitą powierzchnię styku przy maksymalnym obciążeniu.
   6. Oblicz zmienność powierzchni łapy (^{cm 2}) jako współczynnik zmienności powierzchni styku w kolejnych krokach.
   7. Oblicz średnią wartość 3 ważnych prób dla każdej pojedynczej myszy i wyeksportuj ostateczne zbiory danych.
      UWAGA: Wyklucz z analizy próby z nieregularnym zatrzymywaniem, skakaniem lub obracaniem się z analizy.

5. Histologia

1. Pobieranie i utrwalanie tkanek
   1. Uśpienie wszystkich myszy w sposób humanitarny przez zwichnięcie szyjki po 4-tygodniowym okresie indukcji. Ostrożnie przeciąż lewy staw kolanowy i usuń otaczającą ją tkankę miękką.
   2. Natychmiast zanurz próbkę w wstępnie schłodzonym 4% paradehydu (PFA) utrwalającym (w/v). Upewnij się, że objętość utrwalająca jest 10–15 razy większa niż objętość próbki, aby całkowicie zanurzyć tkankę.
   3. Utrwal tkankę w temperaturze pokojowej przez 48 godzin. Delikatnie mieszaj pojemnik utrwalający co 8 godzin, aby zapewnić odpowiednie penetrowanie utrwalające.
2. Dewapnifikacja tkanek
   1. Przepłucz ustalony preparat powoli płynącą wodą przez 10 minut. Powtórz ten proces płukania trzy razy, aby usunąć pozostałości PFA.
   2. Przełóż próbkę do roztworu dewapnifikacyjnego o stężeniu 0,5 mol/l (EDTA) (pH 7,2–7,4). Utrzymuj objętość roztworu dewapniującego na poziomie 20 razy większej niż objętość próbki i przechowuj ją w temperaturze 4 °C.
   3. Dewapnij tkankę przez 14–21 dni. Wymień stary płyn na świeży roztwór odwapniający EDTA co 3 dni.
   4. Sprawdź punkt odwapnienia, delikatnie przekłuwając kość podchrząsną sterylną igłą. Proces odwapniania zakończ, gdy igła przechodzi gładko bez oporu.
   5. Przemyj całkowicie odwapnioną próbkę pod bieżącą wodą przez 2 godziny, aby usunąć pozostałości EDTA. Następnie przepłucz próbkę fosforanową solą fizjologiczną (PBS) trzy razy przez 5 minut każdy.
3. Osadzanie i sekcjonowanie
   1. Stopniowo odwodnić zdewapnifikowany preparat za pomocą serii etanolu stopniowego (70%, 80% i 90% przez 2 godziny każda; 95% przez 1 godzinę; etanol absolutny dwukrotnie przez 1 godzinę każdy).
   2. Dwukrotnie oczyść odwodnioną tkankę ksylenem przez 10 minut każdy. Umieść wyczyszczoną tkankę w parafinie.
   3. Pociąć tkankę osadzoną w parafinie na ciągłe przekroje strzałkowe o grubości 5 μm za pomocą mikrotomu. Zamontuj sekcje na szkiełkach pokrytych poli-L-lizyną i piecz je na wysuwaku, susząc w temperaturze 60 °C przez 2 godziny.
4. Ocena histomorfologiczna
   1. Przekroje pofarbuj safraniną O-fast na zielono, aby ocenić histomorfologię chrząstki stawowej.
   2. Ocena zwyrodnienia chrząstki za pomocą systemu punktacji Osteoartarty Research Society International (OARSI) w warunkach podwójnie ślepych¹².
5. Podstawowy workflow immunohistochemii (IHC)
   1. Odparafinuj sekcje w ksylenie dwa razy przez 10 minut każdy. Sekcje nawadniaj sekwencyjnie przez serię stopniowego etanolu do wody dejonizowanej.
   2. Zanurz przekroje w buforze cytrynianowym o pojemności 0,01 mol/l (pH 6,0) w celu pobrania epitopów indukowanych przez mikrofale. Podgrzej bufor do wrzenia na wysokiej mocy, a następnie utrzymuj delikatne gotowanie na średniej mocy przez 15 minut.
   3. Naturalnie schładz fragmenty do temperatury pokojowej. Myj slajdy PBS trzy razy przez 5 minut
   4. Inkubuj fragmenty w roztworze metanolu nadtlenku wodoru (H2O2) o zawartości 3% przez 20 minut w temperaturze pokojowej, aby zablokować aktywność endogennej nadoksydazy. Myj slajdy PBS trzy razy po 5 minut każdy.
   5. Nałóż 5% środek blokujący surowicę kozą na te fragmenty. Inkubuj przez 60 minut w temperaturze pokojowej, aby zablokować niespecyficzne miejsca wiązania.
   6. Wyrzuć roztwór blokujący bez mycia. Należy zastosować specyficzny pierwotny roztwór roboczy przeciwciał (Transient Receptor Potential Vanilloid 4 (TRPV4) w 1:100, Caspase-3 w 1:200 lub Collagen Type II Alpha 1 (COL2A1) w rozcieńczeniu 1:150).
   7. Inkubuj fragmenty z pierwotnym przeciwciałem w nawilżonej komorze w 4 °C przez noc przez 12–16 godzin.
   8. Wyrównaj sekcje do temperatury pokojowej na 30 minut następnego dnia, a następnie myj PBS trzy razy przez 5 minut każdy. Zastosuj przeciwciało przeciw IgG przeciw królikom lub mysim przeciwciało przeciw kozie z nadoksydazą chrzanu (HRP) (rozcieńczenie 1:500).
   9. Inkubuj przekroje z przeciwciałem wtórnym przez 60 minut w temperaturze pokojowej. Myj slajdy PBS trzy razy po 5 minut każdy.
   10. Należy nałożyć roztwór chromogenu 3,3'-diaminobenzydyny (DAB) i inkubować w ciemności przez 3–5 minut w temperaturze pokojowej. Natychmiast zatrzymaj reakcję za pomocą wody dejonizowanej, gdy pod mikroskopem pojawi się wyraźny brązowy sygnał.
   11. Preparat kontrbarwi roztworem hematoksyliny przez 5 minut. Przepłucz pod bieżącą wodą przez 10 minut, aby plama zmieniła kolor na niebieski.
   12. Rozróżnij sekcje za pomocą 1% roztworu alkoholu kwasowego przez 30 sekund. Płucz szkiełka pod bieżącą wodą przez 5 minut.
   13. Szybko odwodnij fragmenty przez serię stopniowego etanolu i dwukrotnie oczyszczaj tkankę w ksylenie przez 10 minut każdy.
   14. Zamontuj slajdy za pomocą neutralnego balsamu i przykryj je optycznymi powłokami z żywicy optycznej. Pozwól zamontowanym zamkom wyschnąć w temperaturze pokojowej.
6. Sterowanie IHC i analiza obrazów
   1. Ustalić negatywną kontrolę, zastępując pierwotne przeciwciało PBS podczas procesu barwienia. Uwzględnić znany pozytywny przekrój tkanki chrząstki jako pozytywną kontrolę potwierdzającą skuteczność przeciwciał.
   2. Zdobędź zdjęcia barwionych przekrojów za pomocą skanera całej slajdowej przy powiększeniach 40× i 100×.
      UWAGA: Wszystkie oceny histologiczne należy przeprowadzić niezależnie przez co najmniej dwóch zaślepionych obserwatorów, aby zmniejszyć subiektywne uprzedzenia.

6. Analiza statystyczna

1. Obsługa danych i ogólne testowanie
   1. Przeprowadzaj zbieranie i analizę danych w warunkach zaślepienia, aby zminimalizować błędy eksperymentalne.
   2. Przeanalizuj zmienne ciągłe w czterech grupach eksperymentalnych za pomocą jednokierunkowej analizy wariancji (ANOVA), aby sprawdzić ogólne różnice.
   3. Zastosuj test Kruskala-Wallisa H do wszelkich zmiennych, które nie spełniają niezbędnych założeń parametrycznych.
2. Testy post hoc i progi istotności
   1. Wykonaj porównania parowe po hoc za pomocą testu Tukey, aby zidentyfikować konkretne różnice grupowe, jeśli początkowa ANOVA wskazuje na istotność statystyczną.
   2. Polegaj wyłącznie na teście Tukey'ego, aby kontrolować wskaźnik błędów rodzinnych. Nie łącz tego z żadnymi dodatkowymi metodami korekcji wielokrotnych porównań.
   3. Zdefiniuj istotność statystyczną jednolicie jako p < 0,05

Wyniki

Analiza chodu
Parametry cyklu chodzenia: Stosunek huśtawki do postawy — zdefiniowany jako stosunek czasu trwania fazy wahania bez obciążenia do fazy pozycji nośnej pojedynczego kroku — został oceniony jako odzwierciedlenie równowagi między obciążeniem a napędem. W porównaniu z grupą kontrolną (2,10 ± 0,06), myszy, które otrzymały intraartykularny zastrzyk kolagenazy (1,45 ± 0,05) lub przeszły nadmierną aktywność fizyczną (1,68 ± 0,05), wykazały istotnie niższy stosunek huśtawki do postawy. Warto zau...

Dyskusja

W tym badaniu opracowaliśmy nowy model myszy KOA, który naśladuje działanie nadmiernego obciążenia stawu poprzez połączenie intraartykularnego wstrzyku kolagenazy z treningiem zmęczenia na kołach. Te odkrycia ponownie potwierdzają, że KOA powstaje w wyniku współdziałania czynników biologicznych i mechanicznych. Zrozumienie i identyfikacja tych czynników daje nadzieję na opracowanie indywidualnych planów leczenia i strategii profilaktycznych, które łagodzą objawy i poprawiają jakość życia osób cierpiących na chorobę zwyro...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
4% utrwalacz paraformalnego dehydu	Beyotime	P0099
Kwas octowy	Sinopharm	631-61-8
System obrazowania DigiGait dla myszy	Nauki o życiu z napędem na tylne koła	MSI-DIG-MS
Roztwór EDTA	Procell	PB180320
Osadzanie kasety	Leica	IP C
Etanol	Sinopharm	64-17-5
Szybka zielona bejca	Leyan	1085995
Krem do usuwania owłosienia	Veet	G20161330
Hematoksylyna	Adamas	61753A
Wysokoobrotowa chłodnicza wirówka	Hermle	Z366K
Inkubator	TAITEC	M-210FN
Aparat do inhalacji	Ranger	RZ-Viking
Izofluran	Webio	W100
Mikrotom	Ted Pella	10180-220
Urządzenie zmęczenia typu rotatora myszy	Pekin Zhishu Duobao Technologia Biologiczna	YLS-10B
Balsam neutralny	Sinopharm	96949-21-2
Safranin O plain	Bioss	S0062
Półautomatyczne centrum osadzania tkanek	Thermo Fisher	HistoStar
Płyta grzewcza do suszenia na wysuwkach	Nauki o mikroskopii elektronowej	XH-2002
Kąpiel wodna z flotacją tkanek	BIOBAZA	BT-I
Kolagenaza typu II	Sigma-Aldrich	C4-22-1G
Skaner całej szkiełki	Leica	Aperio VERSA
Ksylen	Sinopharm	1330-20-7