Model myszy raka piersi z przerzutami do mózgu do badania komórek odpornościowych i stromy w oponach mózgowo-rdzeniowych i żarłaczu

Podsumowanie

Protokół ustanawia przerzuty raka piersi do mózgu poprzez szczepienie wewnątrkształtowe i charakteryzuje za pomocą cytometrii przepływowej kluczowe podzbiory limfocytów i komórek odpornościowych, które regulują odporność mózgu. Analizy te zapewniają wgląd w dynamikę komórek odpornościowych i stromalnych, które kształtują mikrośrodowisko mózgu, informując o rozwoju nowych strategii terapeutycznych.

Streszczenie

Ośrodkowy układ nerwowy (OUN) jest otoczony przez specjalistyczne interfejsy odpornościowe, w tym oponę mózgowo-rdzeñ i cebulkę węchową, które mogą służyć zarówno jako przepuszczalne szlaki dla metastatycznej kolonizacji, jak i jako punkty wejścia dla przeciwnowotworowych odpowiedzi odpornościowych. Zrozumienie, jak ewoluuje dynamika komórek odpornościowych w obrębie tych struktur podczas postępu przerzutów, jest istotne dla zidentyfikowania mechanizmów, które albo wspierają, albo ograniczają wzrost guza w mózgu. Ten protokół opisuje utworzenie modelu mysiego przerzutów do mózgu z raka piersi (BCBM) poprzez wkłucie doczaszkowe komórek raka piersi E0771 do myszy C57BL/6. Po rozwoju guza, opony i cebulka węchowa są starannie sekcjonowane, strawiane enzymatycznie i przetwarzane na pojedyncze zawiesiny komórkowe. Następnie te populacje są analizowane za pomocą wieloparametrycznej spektralnej cytometrii przepływowej, aby kompleksowo scharakteryzować podzbiory komórek limfoidalnych, myeloidalnych i stromalnych w obrębie nisz odpornościowych związanych z OUN. Ten przebieg umożliwia porównawczą analizę między kontrolami z guzem i bez guza, identyfikując zmiany w interfejsach odpornościowych OUN, które mogą leżeć u podstaw uniknięcia przez guz odpowiedzi odpornościowej i reprezentować potencjalne cele terapeutyczne. Ogólnie rzecz biorąc, protokół zapewnia powtarzalne podejście do badania BCBM i badania regulacji odporności na granicach między OUN a obwodowym układem odpornościowym. Może być dostosowany dla dodatkowych linii komórek nowotworowych, immunoterapii lub genetycznych modeli mysich w celu zbadania mechanizmów oporu immunologicznego i reakcji terapeutycznej w mikrośrodowisku mózgu.

Wprowadzenie

Przerzuty do mózgu są najczęstszymi złośliwymi nowotworami wpływającymi na ośrodkowy układ nerwowy (OUN), występującymi częściej niż pierwotne guzy mózgu. Rak płuc, rak piersi i czerniak są pierwotnymi rakiem, które najczęściej przerzucane są do mózgu¹. Wśród nich przerzuty raka piersi do mózgu (BCBM) stanowią poważne wyzwanie kliniczne, dotyczące 10%–30% pacjentów z chorobą przerzutową i wykazujące wzrost zachorowań z powodu ulepszonych terapii ogólnoustrojowych i postępu w neuroobrazowaniu². Rokowanie dla pacjentów z BCBM nadal jest niekorzystne, ponieważ dostępne terapie – w tym chirurgia, radioterapia i chemioterapia – są w dużej mierze paliatywne, a objawy neurologiczne poważnie wpływają na jakość życia³. Chociaż terapia ukierunkowana i immunoterapia są badane jako uzupełniające strategie, kliniczne korzyści z immunoterapii w przerzutach do mózgu pozostają ograniczone^4,5,6.

Ostatnie prace wyraźnie ukształtowały nasze rozumienie odporności mózgu i odnowiły zainteresowanie funkcjonalnymi szlakami limfatycznymi związanymi z OUN, w tym naczyniami limfatycznymi w oponowymi⁷ i śluzówce nosa⁸. Struktury te tworzą ciągłą sieć limfatyczną otaczającą mózg i rozciągającą się obok wzgórka węchowego i płyty sitowate, kończącą się na szyjnych węzłach limfatycznych. System ten odgrywa kluczowe role w homeostazie płynów, nadzorze immunologicznym i transporcie komórek odpornościowych między OUN a obwodowymi narządami limfatycznymi⁹. Wraz ze wzrostem zainteresowania podejściami immunoterapeutycznymi do nowotworów i przerzutów mózgu, te limfatyczno-immunologiczne interfejsy pojawiają się jako obiecujące, ale jeszcze niedostatecznie badane, szlaki, przez które ogólnoustrojowa odporność może komunikować się z wzmożonymi zmianami wewnątrkczaszkowej. Ponadto mechanizmy rządzące rekrutacja komórek odpornościowych do mikrośrodowiska guza mózgu i sposób, w jaki te komórki współpracują w tym unikalnym środowisku, pozostają słabo zrozumiane. Wszystkie te luki podkreślają potrzebę modeli przedklinicznych i procedur, które umożliwią kompleksową analizę interakcji guz-odpowiedzi odpornościowa i wesprze rozwój strategii poprawy odporności przeciwnowotworowej przeciwko przerzutom do mózgu.

Tutaj opisujemy protokół, który łączy tworzenie reprodukowalnego, immunokompetentnego modelu mysiego BCBM poprzez stereotaktyczne wszczepienie komórek E0771 do czaszki z izolacją i dysocjacją opon mózgowo-rdzeniowych i wzgórka węchowego w celu immunofenotypowaniu za pomocą spektralnej cytometrii przepływowej. To podejście umożliwia kontrolowane modelowanie BCBM w celu oceny bezpieczeństwa i skuteczności interwencji terapeutycznych i pozwala na dogłębne zcharakteryzowanie populacji immunologicznych i stromalnych na interfejsie limfatyczno-immunologicznym mózgu, zapewniając wgląd w komórkowe graczy, którzy kształtują mikrośrodowisko guza mózgu i wpływają na reakcje na leczenie.

Modele zwierzęce pozostają niezbędne do badania przerzutów do mózgu, ponieważ wiele kluczowych aspektów postępu przerzutowego nie można odtworzyć in vitro. Opracowano kilka modeli mysich in vivo w celu wywołania przerzutów do mózgu, każdy z określonymi zaletami i ograniczeniami¹⁰. Modele przerzutów spontanicznych, w tym implantacja ortotopowa lub genetycznie zmodyfikowane modele myszy, bardziej dokładnie naśladują przebieg choroby klinicznej, ale rzadko generują zmiany wewnątrkczaszkowe, wymagają długich czasów eksperymentów i często dają wysoką zmienność z powodu rozpowszechnionej choroby pozaczaszkowej. Podejścia ogólnoustrojowe, w tym iniekcje do śródserca, do tętnicy szyjnej lub do żyły ogonowej, wprowadzają komórki nowotworowe do krążenia i lepiej naśladują rozsiewanie hematogeniczne, ekstrawazję bariery krew-mózg i kolonizację. Jednak te modele nie odzwierciedlają wczesnych etapów inwazji guza pierwotnego i często wytwarzają rozległe i zmienne przerzuty pozaczaszkowe, szczególnie do płuc. Wśród modeli ogólnoustrojowych iniekcja do tętnicy szyjnej ma najniższą zmienność, ale wymaga zaawansowanej znajomości chirurgii. Alternatywnie, wszczepienie do czaszki oferuje kilka zalet, w tym precyzyjną kontrolę nad lokalizacją guza, szybki i powtarzalny rozwój guza oraz zmniejszoną zmienność między eksperymentami. To podejście może być również uzupełnione przez ortotopowe wszczepienie pierwotnego guza, po którym następuje chirurgiczna resekcja, aby bardziej dokładnie naśladować przebieg przerzutów. Chociaż wszczepienie do czaszki nie odzwierciedla pełnego kaskadu przerzutowego i nie nadaje się do badania wczesnej inwazji i rozsiewania, zapewnia solidny model do oceny skuteczności terapeutycznej wobec ustanowionych zmian i do badania interakcji w mikrośrodowisku mózgu. Znanym ograniczeniem jest to,

Protokół

Wszystkie procedury dotyczące zwierząt były przeprowadzane zgodnie z wytycznymi Wydziału Farmacji Uniwersytetu w Lizbonie. Protokoły zostały przejrzane i zatwierdzone przez portugalski organ właściwy ds. ochrony zwierząt, Direção-Geral de Alimentação e Veterinária (Referencja 0421/000/000/2021).

1. Przygotowanie komórek E0771 do implantacji in vivo

1. W sterylnej kapturze, hoduj komórki E0771 w kolbie T75 używając Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) uzupełnionego o 10% (v/v) surowicy płodowej bydlęcej (FBS) i 1% (v/v) penicyliny i streptomycyny (PEST).
   1. Upewnij się, że komórki zostały uwierzytelnione przez profilowanie STR po otrzymaniu od dostawcy i potwierdzone jako wolne od mykoplazm poprzez rutynowe testy. Hoduj komórki nowotworowe przez co najmniej 2-8 przelewów po rozmrożeniu przed implantacją do mózgu.
2. W dniu implantacji upewnij się, że komórki są zdrowe i 80-90% konfluencyjne. Usuń medium i przepłucz komórki fosforanowym buforem sólnym (PBS).
3. Dodaj trypsynę do kolby i inkubauj przez 5 min. przy 37 °C. Następnie dodaj trzy razy więcej objętości uzupełnionego medium (DMEM z 10% v/v FBS i 1% v/v PEST) aby zneutralizować trypsynę i oddzielić komórki.
4. Przenieś komórki do probówki i wyśrodkuj przez 5 min. przy 300 x g w temperaturze pokojowej (RT). Odetnij nadstan i ponownie zawieś pellet w PBS do liczenia komórek.
5. Wyśrodkuj ponownie (300 x g przez 5 min.), odłóż nadstan i ponownie zawieś komórki w PBS w stężeniu 1 x 10⁵ komórek E0771 w 2 μL na zwierzę. Trzymaj zawiesinę komórek na lodzie do momentu inokulum tumorow. Przygotuj zawiesinę komórek bezpośrednio przed wstrzyknięciem.

2. Intrakranialne wszczepienie nowotworu za pomocą aparatu stereotaksyjnego

1. Uzyskaj samice myszy C57BL/6 (w wieku 6-8 tygodni) i przystosuj je do warunków hodowli przez co najmniej 7 dni przed operacją. Trzymaj myszy laboratoryjne w kontrolowanych warunkach z 12-godzinnym cyklem światło/ciemność i dostarczaj im żywności i wody ad libitum.
   UWAGA: Zaleca się minimum pięć zwierząt na grupę eksperymentalną, aby zapewnić wystarczającą moc statystyczną na sensowną porównawczą analizę immunologiczną między warunkami z nowotworem a kontrolnymi.
2. Przygotuj pole operacyjne i wszystkie potrzebne materiały przed rozpoczęciem zabiegu:
   1. Instrumenty chirurgiczne: klingi skalpeli, nożyczki, kleszcze, uchwyty do igieł, drut szwujący.
   2. Wyposażenie i inne: instrument stereotaksyjny, szklana strzykawka, wiertarki, goliarki, waciki, podgrzewana podkładka.
   3. Znieczulenie: Przygotuj ketaminą-ksylazyną (K-X) (25 mg/mL i 2 mg/mL, odpowiednio) w PBS w 15 mL probówce.
   4. Bezbolesność: Przygotuj buprenorfinę w stężeniu 15 μg/mL w PBS w 15 mL probówce.
   5. Inne roztwory: jododyna, nadtlenek wodoru 3% v/v (H₂O₂), maść okulistyczna.
      UWAGA: H₂O₂ jest szkodliwe w przypadku połknięcia i może powodować podrażnienie skóry.
3. Znieczulić mysz za pomocą iniekcji dootrzewnowej (i.p.) K-X (100 μL na 10 g masy ciała). Potwierdź odpowiednie znieczulenie brakiem reakcji na ściśnięcie palca.
4. Nałóż maść okulistyczną na oba oczy, aby zapobiec odwodnieniu i ułóż mysz na podgrzanej podkładce przez cały czas trwania zabiegu.
5. Ogolić skórę głowy i zdezynfekować obszar operacyjny jododyną. Wykonaj 1 cm podłużny nacięcie wzdłuż linii środkowej, aby odsłonić czaszkę.
6. Oczyść odsłoniętą czaszkę nadtlenkiem wodoru za pomocą wacika w ruchach okrężnych, aby uwidocznić bregmę. Jeśli wystąpi nadmierny piasek, usuń go suchym wacikiem.
7. Umieść mysz w ramie stereotaksyjnej. Ustaw bregmę jako punkt odniesienia (0.0) i zmierz 2.5 mm bocznie i 0.5 mm przed bregmą. Zaznacz miejsce wstrzyknięcia.
8. Zdejmij mysz i wywierć małe dziurki w zaznaczonych koordynatach. Unikaj zbyt głębokiego wiercenia, aby zapobiec uszkodzeniu mózgu.
9. Załóż strzykawkę na wstrzykiwaczu. Ponownie zawieś komórki i napełnij szklaną strzykawkę odpowiednią objętością na dwa wstrzyknięcia (4-5 μL). Nie przygotowywaj więcej niż dwóch wstrzyknięć na raz, aby uniknąć osiadania komórek.
10. Pozycjonuj ponownie mysz w urządzeniu stereotaksyjnym, wyrównuj igłę z dziurką i powoli opuść ją na głębokość 3.0 mm do parenchymy mózgu. Wstrzyknij komórki (lub sterylny PBS jako kontrola szamowa) z prędkością 1 μL/

Wyniki

Po wstrzyknięciu do czaszki komórek E0771 u myszy rozwijała się zlokalizowany guz piersi w miejscu docelowych współrzędnych stereotaktycznych. Współrzędne stereotaktyczne ukierunkowane na miąższ zwojów czepnych (2,5 mm bocznie, 0,5 mm przed bregmą i 3,0 mm brzusznie od bremy) zostały wybrane na podstawie standardowych atlasów mózgu myszy i wcześniej opisywanych podejść do implantacji doczaszkowej^15,16. Ta część jest szeroko stosowana do implantacji guzów doczaszk...

Dyskusja

Poprzez łączenie implantacji guzów czaszkowych z izolacją, dysocjacją i charakterystyką immunologiczną opon mózgowo-rdzeniowych i żarłacza, ten protokół umożliwia szczegółowe badanie dynamicznej interakcji między mikrośrodowiskiem guza mózgu a immunitarnymi interfejsami związanymi z OUN. Metoda zapewnia reproduktywalne tworzenie guzów czaszkowych, wysokiej jakości zawiesin komórkowych i solidne rozdzielczość podzbiorów immunologicznych. Jednak implantacja doczaszkowa omija wczesne etapy kaskady przerzutowej i nie w pełni...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Alexa Fluor 594 anti-mouse CD45R/B220 antibody (clone RA3-6B2)	BioLegend	103254	used at 1:300 dilution
Alexa Fluor 700 anti-mouse CD8 antibody (clone 53-6.7)	BioLegend	100730	used at 1:50 dilution
APC anti-mouse P2RY12 antibody (clone S16007D)	BioLegend	848006	used at 1:80 dilution
Betadine	Selleck Biotechnology GmbH	S4678-100mg	Povidone-iodine
Bovine Serum Albumin (BSA), lyophilized powder, ≥96% (agarose gel electrophoresis)	Sigma-Aldrich	A2153	To prepare FACS Buffer
Brilliant Violet 421 anti-mouse Podoplanin antibody (clone 8.1.1)	BioLegend	127423	used at 1:80 dilution
Brilliant Violet 510 anti-mouse CD11b antibody (clone M1/70)	BioLegend	101263	used at 1:30 dilution
Brilliant Violet 570 anti-mouse NK1.1 antibody (clone PK136)	BioLegend	108733	used at 1:40 dilution
Brilliant Violet 650 anti-mouse CD19 antibody (clone 6D5)	BioLegend	115541	used at 1:50 dilution
Brilliant Violet 711 anti-mouse CD44 antibody (clone IM7)	BioLegend	103057	used at 1:80 dilution
Brilliant Violet 785 anti-mouse F4/80 antibody (clone BM8)	BioLegend	123141	used at 1:40 dilution
Bupaq 3 mg/mL	Bio5	1002241	Buprenorphine
Cell strainer 40-μm	Avantor	732-2757
Cell strainer 70-μm	Avantor	732-2758
Centrifuge 5910 Ri	Eppendorf	5943000011
Collagenase type II	Worthington Biochemical Corporation	LS004176
Corning Matrigel Growth Factor Reduced Basement Membrane Matrix	Corning	356231
Cytek Aurora Spectral Flow Cytometer	Cytek Biosciences
Dnase I	Worthington Biochemical Corporation	LS002006
Drill	Stoelting Europe	51630
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), high-guclose, pyruvate	Gibco	41966029
E0771 cell line	ATCC	CRL-3436
Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate (EDTA)	Merck	E4884	To prepare FACS Buffer
FCS Express Flow Cytometry Software	De Novo Software
Fetal Bovine Serum (FBS)	Gibco	A5256801
FITC anti-mouse CD3 (clone 17A2)	BioLegend	100204	used at 1:50 dilution
Ghost Dye Red 780	Cytek Biosciences	13-0865-T500	Viability dye (used at 1:5000 dilution)
HBSS, calcium, magnesium, no phenol red	Gibco	14025092
Heating Pad	MOBICLINIC
Hydrogen Peroxide 34.5 to 37% (H2O2)	ACROS	10002780
Ketamax 100 mg/mL	Bio3	1009495	Ketamine
Lubrithal Eye Gel	Bio4	1731329
N-2-hydroxyethylpiperazine-N-2-ethane sulfonic acid (HEPES) 1M	Gibco	15630080
Paraformaldehyde (PFA) 16 %	Avantor	43368	To prepare Fixation Buffer
Pacific Blue anti-mouse Ly-6G antibody (clone 1A8)	BioLegend	127612	used at 1:50 dilution
PE anti-mouse Ly-6C antibody (clone HK1.4)	BioLegend	128008	used at 1:300 dilution
PE anti-mouse P2RY12 antibody (clone S16007D)	BioLegend	848004	used at 1:80 dilution
PE/Cyanine5 anti-mouse CD11c antibody (clone N418)	BioLegend	117316	used at 1:80 dilution
PE/Cyanine7 anti-mouse CD80 antibody (clone 16-10A1)	BioLegend	104734	used at 1:100 dilution
PE-eFluor 610 anti-mouse CD31 antibody (clone 390)	eBioscience	61-0311-82	used at 1:160 dilution
PE/Fire 810 anti-mouse I-A/I-E (clone M5/114.15.2)	BioLegend	107667	used at 1:300 dilution
Penicillin-Streptomycin (PEST), 10 000 U/mL	Gibco	15140-122
PerCP/Cyanine5.5 anti-mouse CD45 antibody (clone 30-F11)	BioLegend	103132	used at 1:80 dilution
Phosphate-buffered saline (PBS) 10X, pH 7.4	Gibco	70011044
Prism (version 10)	GraphPad
RN Needle (27/51/3)S	Hamilton Company	7762-01
RPMI 1640 Medium, GlutaMAX Supplement	Gibco	61870044
Scalpel Blades, carbon steel	B Braun	BB510
Sedaxylan 20 mg/mL	Bio2	1112384	Xylazine
Spark Blue 574 anti-mouse CD4 antibody (clone GK1.5)	BioLegend	100490	used at 1:50 dilution
Stereotaxic Instrument	Stoelting Europe	51730D
Suture wire Silkam black 5/0 10x45 cm	B Braun	C0266639	non-absorbable
S