Method Article

Podejście techniczne do analizy strukturalnej nieznaego związku w płynie doustnym Huoxiang Zhengqi na podstawie liniowej spektrometrii mas z pułapką jonów

DOI:

10.3791/70672

⸱

April 3rd, 2026

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1General Surgery, Chongqing Traditional Chinese Medicine Hospital, The First Affiliated Hospital of Chongqing College of Traditional Chinese Medicine, 2Department of Cardiology, Chongqing Traditional Chinese Medicine Hospital, The First Affiliated Hospital of Chongqing College of Traditional Chinese Medicine, 3Chongqing Taiji Industry, 4Chongqing Clinical Research Center for Dermatology, Department of Dermatology, Chongqing Traditional Chinese Medicine Hospital, The First Affiliated Hospital of Chongqing College of Traditional Chinese Medicine

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tu przedstawiamy standardowy protokół, który łączy wieloetapowe drzewa spektrometrii masowej z procesem fragmentacji opartym na peroralnym płynie Huoxiang Zhengqi.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Chińskie związki ziołowe (CHC) odgrywają niezastąpioną rolę w medycynie chińskiej, a identyfikowanie ich złożonych składników było istotnym punktem badań w ostatnich latach. Huoxiang Zhengqi oral liquid to klasyczny chiński patentowy lek, którego skład chemiczny wymaga dalszego zbadania na poziomie molekularnym. Tradycyjne spektrometry mas, takie jak spektrometry czasu przelotu i Orbitrap, zazwyczaj dostarczają tylko informacji o sekundarnym rozkładzie. Na podstawie liniowego spektrometru mas z pułapką jonów, związki mogą być rozkładane bardziej dokładnie, co pozwala na uzyskanie głębszych informacji o fragmentach. W niniejszym artykule opracowano technikę strukturalnego badania nieznanych związków w CHC, obejmującą przygotowanie próbki, przygotowanie chromatografii w ultra-wydajnych kolumnach ciekłych, przygotowanie do spektrometrii mas, badanie pełnego spektrum, badanie spektrometrii mas wtórnej, badanie spektrometrii mas wielopoziomowej oraz analizę wyników. Przedstawione wyniki reprezentatywne demonstrują proces pochodzenia struktury związków. Omówiono czynniki wpływające na technikę eksperymentalną, takie jak izomery, związki wielohydroksylowe oraz rozdzielczość urządzenia. Na podstawie pochodzenia mikroskopijnej struktury molekularnej nieznanych związków poprzez wieloetapowe fragmentowanie spektrometrii mas, ustalona metoda eksperymentalna jest wszechstronna i może być stosowana do charakterystyki strukturalnej małych cząsteczek o działaniu biologicznym w tradycyjnej medycynie chińskiej i ich powiązania z mechanizmami farmakologicznymi.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ziołowe składniki leków chińskich (CHC), jako nieocenione aktywa tradycyjnej medycyny chińskiej (TCM), zgromadziły tysiąclecia potwierdzonego doświadczenia klinicznego1. Pełnią niezastąpioną rolę w zapobieganiu chorobom, interwencji terapeutycznej i rehabilitacji2. Dzięki synergii wielu ziół, CHC leczy ludzkie ciało w sposób holistyczny, stosując zasady działania holizmu i terapii opartej na różnicowaniu zespołów objawów3. W ramach współczesnych systemów medycznych, CHC zyskują globalne uznanie dzięki swoim polifarmakologicznym mechanizmom, które angażują wielotargetowe ścieżki4, z szerokim zastosowaniem obejmującym zaburzenia trawienne, infekcje układu oddechowego i immunomodulację5. Płyn doustny Huoxiang Zhengqi (HXZQ) jest przykładem klasycznej formuły CHC6. Jego skład obejmuje wiele leczniczych ziół, takich jak paczula, liść gulętnika, anżelika chińska, bieleń pięciolistna, żagwinka i suszona skórka pomarańczy. Sławę zyskał dzięki swojej zdolności do przekazywania właściwości rozgrzewających, odkażających, wilgoćrozpraszających i wzmacniających śledzionę i żołądek7. HXZQ jest klinicznie stosowany przeciwko objawom podobnym do grypy spowodowanym wilgocią, obrzękowi brzucha, wymiotom i biegunce8. Postępy technologiczne przeniosły badania CHC z fenomenologicznej obserwacji do badań molekularnych, mechanistycznych i badań na poziomie związków chemicznych9, takich jak wykorzystanie proteomiki i metabolomiki do identyfikacji aktywnych składników, tym samym stwarzanych naukowych fundamentów dla globalizacji TCM. W rezultacie, rygorystyczna analiza składu chemicznego i farmakodynamiki HXZQ nie tylko przyczynia się do standaryzacji CHC, ale również katalizuje innowacyjne odkrycia leków10.

HXZQ to wieloziołowa formuła, której wrodzona złożoność chemiczna wynika z jej składników roślinnych11. Charakteryzuje się różnorodnością klas fitochemikaliów – w tym olejkami lotnymi, kumarinami, lignanami, polisacharydami i alkaloidami – HXZQ zawiera zarówno dobrze scharakteryzowane aktywne związki chemiczne, jak i znaczny zbior strukturalnie niedokumentowanych składników12. Dynamiczne wahania kluczowych składników (np. olejki lotne, flawonoidy, alkaloidy) mogą wystąpić z powodu różnic w protokołach ekstrakcji i warunkach przechowywania, co podkreśla krytyczną potrzebę systematycznego profilowania chemicznego6. W ramach unowocześnienia tradycyjnej medycyny chińskiej (TCM), głęboka analiza składu klasycznych formuł, takich jak HXZQ, nie tylko wyjaśnia podstawę materialną leczniczego działania, ale również dostarcza empirycznego wsparcia dla kontroli jakości, standaryzowanej produkcji i monitorowania zdarzeń niepożądanych10. Podczas gdy wysoko występujące związki w HXZQ zostały dobrze udokumentowane, znaczna część jego składników chemicznych pozostaje niezidentyfikowana13. Strukturalna różnorodność składników, w połączeniu z niską obfitością wielu potencjalnie aktywnych cząsteczek, stanowi trudne wyzwanie dla kompleksowej identyfikacji za pomocą konwencjonalnych technik analitycznych, takich jak chromatografia i spektroskopia14. Warto zauważyć, że izomeria występuje powszechnie w wielu klasach fitochemikaliów w HXZQ, w tym w kumarinach, lignanach i polisacharydach, co dodatkowo komplikuje różnicowanie strukturalne15. Dodatkowe bariery dla dokładnej analizy składu obejmują niską obfitość analitów i efekty interferencji matrycowej. Łącznie, czynniki te podkreślają kluczowy obszar badań nad HXZQ: rozwój solidnych strategii analitycznych w celu osiągnięcia precyzyjnej, pełnej identyfikacji jego pełnego składu chemicznego.

Współczesne platformy spektrometrii mas (MS) napotykają na nieodzowne ograniczenia podczas charakteryzacji złożonych matryc, w tym artefaktów spoliczkowania jonów i niekompletnej pokrycie bazy danych spektralnych16. W tym kontekście, tandemowa spektrometria mas (MS/MS) i wielostopniowa spektrometria mas (MSn) stały się niezastąpionymi strategiami analitycznymi dla de novo wyjaśnienia struktury nieznanych związków17. Podczas gdy konwencjonalne systemy MS o wysokiej rozdzielczości, takie jak MS z kwadrypolem i czasem przelotu (Q-TOF) MS i MS Orbitrap, generują wysokiej jakości dane fragmentów MS/MS, ich użyteczność jest ograniczona do jednostopniowych zdarzeń fragmentacji. Mimo tej ograniczenia, platformy te dostarczają bogate informacje strukturalne z wyjątkową czułością i rozdzielczością, szczególnie podczas analizy złożonych mieszanin18. Natomiast liniowa pułapka jonowa (LIT) MS stosuje tryb wielostopniowego rozpadu indukowanego kolizją (CID), który umożliwia sekwencyjną, iteracyjną fragmentację jonów molekularnych. Ta unikalna zdolność pozwala na stopniowe sekcjonowanie szkieletów związków i grup funkcyjnych, ułatwiając

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Preprocessing próbki

  1. Otwierz opakowanie komercyjnego HXZQ. Dokładnie przelej 0,1 mL HXZQ do 2 mL butelki z próbką, następnie dodaj 0,9 mL wody. Wstrząśnij roztworem, aż dokładnie się wymiesza.
  2. Przygotuj strzykawkę do wstrzykiwań (1 mL) i mikroporowaty filtr membranowy (0,22 μm). Przefiltruj roztwór do nowej 2 mL butelki z próbką.
    UWAGA: Podczas procedur eksperymentalnych zastosuj odpowiednie środki ostrożności.

2. Przygotowanie do ultra-wydajnej chromatografii cieczowej (UPLC)

  1. Kliknij dwukrotnie na oprogramowanie Xcalibur. Kliknij Gotowy do pobrania, a następnie kliknij przycisk Kontrola bezpośrednia. Kliknij na kolumnie Moduł pompy w wyskakującym oknie, ustaw %B na 50, %C na 0 i %D na 0 (Rysunek 1).
  2. Kliknij na przycisk Silnik, aby przełączyć go na stan Włączone. Kliknij na przycisk Więcej opcji, ustaw Przepływ na 5 [mL/min] i Czas na 180 [s] w wyskakującym oknie. Kliknij na przycisk Oczyść, a następnie kliknij na przycisk OK w wyskakującym oknie.
    UWAGA: Faza ruchoma jest stała na poziomie 0,3 mL/min z 50% A (0,1% roztwór kwasu mrówkowego) i 50% B (acetonitryl) bez temperatury kolumny w przypadku braku kolumny chromatograficznej. Domyślna objętość wstrzyknięcia wynosi zwykle 1 μL.

3. Przygotowanie MS

  1. Wróć do głównego okna oprogramowania, kliknij na przycisk Widok konfiguracji sekwencji. Kliknij na przycisk Otwórz, aby zaimportować już edytowany szablon i kliknij prawym przyciskiem myszy na Nazwa metody, a następnie kliknij na przycisk Otwórz plik, aby otworzyć plik metody.
  2. W wyskakującym oknie Konfiguracja instrumentu ustaw Pierwsza masa (m/z) na 100, a Ostatnia masa (m/z) na 1200. Kliknij na przycisk Zapisz, aby zapisać metodę.
    UWAGA: Domyślne warunki MS obejmują temperaturę źródła jonów na poziomie 350 °C, początkowy zakres MS w zakresie 80 – 1200 Da, tryb zderzeń na dysocjację indukowaną zderzeniem (CID), a energię zderzeń na 35.

4. Test pełnego MS

  1. Kliknij na przycisk Uruchom sekwencję, a następnie kliknij na przycisk OK w wyskakującym oknie. Poczekaj na zakończenie wstrzyknięcia próbki (Rysunek 2).
    UWAGA: Przed testem umieść butelkę z próbką 2 mL na tacy próbkowej urządzenia.
  2. Kliknij na przycisk Widok Mapa i kliknij na ikonę Przeglądarka Qual, aby otworzyć okno Przeglądarki Qual. Kliknij na przycisk Otwórz, wybierz Plik danych z formatem.raw w folderze i kliknij dwukrotnie, aby otworzyć plik.
  3. Kliknij prawym przyciskiem myszy na Oknie chromatogramu, a następnie kliknij na przycisk Zakresy. W sekcji filtru skanowania wybierz ESI Full MS. W sekcji rodzaju wykresu wybierz TIC. Kliknij na przycisk OK, a następnie okno wyświetli całkowity chromatogram jonów próbki.
  4. Kliknij na przycisk Pin w prawym górnym rogu okna widma mas.
  5. W oknie chromatogramu kliknij i przesuń, aby wybrać Obszar czasowy o największej relacji obfitości. Okno widma mas wyświetli odpowiednie jony widma mas. Zapisz wartości m/z na następnym poziomie spektrometrii mas.

5. Test MS/MS

  1. Wróć do okna Konfiguracja instrumentu. W kolumnie Masa rodzica wiersza n=2 wprowadź wartość m/z związku zarejestrowanego w poprzednim kroku. Kliknij na przycisk Zapisz, aby zapisać metodę.
  2. Wróć do okna oprogramowania. Kliknij na przycisk Widok konfiguracji sekwencji, zmodyfikuj nazwę pliku, a następnie kliknij na przycisk Zapisz, aby zapisać sekwencję.
  3. Kliknij na przycisk Uruchom sekwencję, a następnie kliknij na przycisk OK w wyskakującym oknie. Poczekaj na zakończenie wstrzyknięcia próbki.
  4. Wróć do okna Przeglądarki Qual. Kliknij na przycisk Otwórz, wybierz Plik danych z formatem .raw w folderze i kliknij dwukrotnie, aby otworzyć plik.
  5. Kliknij prawym przyciskiem myszy na Oknie chromatogramu, a następnie kliknij na przycisk Zakresy. W sekcji filtru skanowania wybierz ESI Full MS. W sekcji rodzaju wykresu wybierz TIC. Kliknij na przycisk OK, a następnie okno wyświet

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zasugerowaliśmy, aby wszystkie informacje o wartości m/z potrzebne do zestawienia były najpierw zebrane, a następnie obliczono wartość różnicy masy między izotopem rodzicielskim a izotopem fragmentu. Znaleziono związek, który został zgłoszony w bazie danych lub literaturze, a następnie odwrotnie wywnioskowano strukturę nieznanego związku na podstawie tej znanej struktury.

Wszystkie wykryte związki i ich odpowiednie jony fragmentów zostały przedstawione przez wartości m/z. Podzbiór tych jonów f...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kombinacja LIT-MS i jej technologii fragmentacji MSn zapewnia metodę identyfikacji nieznanych związków w CHC. W przeciwieństwie do tradycyjnych trybów tandem MS w Orbitrap i Q-TOF MS, pułapka liniowa może specyficznie wychwytywać jony docelowe, skutecznie unikając interferencji ze współelujących jonów23. Ta metoda osiąga precyzję na poziomie molekularnym, dostarczając stosunkowo dokładnych informacji o strukturze chemicznej, częściowo rozwiązując tym samym wyzwanie związane z kwalifikac...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy deklarują, że nie mają żadnych rywalizujących interesów finansowych.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Praca ta była finansowana przez specjalny projekt na zachętę do wydajności i wskazówki Instytutu Badań Naukowych Chongqing (cstc2022jxjl120005). Projekt badań naukowych i technologicznych Komitetu Edukacji Miejskiej Chongqing (KJZD-K202315102). Projekt Badań Naukowych Medycznych Chongqing (Wspólny projekt Komisji Zdrowia Chongqing i Biura Nauki i Technologii (2022DBXM007). Specjalny Szpital Uczonych Xinglin Uniwersytetu Tradycyjnej Medycyny Chin w Chengdu (YYZX202160).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
AcetonitrileThermo ScientificCAS 75-05-8Stan cieczy
Kwas mrówkowyThermo ScientificCAS 64-18-6Stan cieczy
Huoxiang Zhengqi Oral LiquidChongqing Taiji Industry (Group) Co., Ltd.State Drug Standard Code Z50020409Obiekt badań
Masa spektrometru z liniowym pułapem jonowymThermo ScientificLTQ XLPrzyrząd IT-MS
Chromatograf cieczowyThermo ScientificU3000Przyrząd UPLC
XcaliburThermo Scientificwersja 2.0Oprogramowanie operacyjne UPLC-IT-MS

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Chao, J., et al. Major achievements of evidence-based traditional Chinese medicine in treating major diseases. Biochem Pharmacol. 139, 94-104 (2017).
  2. Zou, Q., et al. The role and mechanism of TCM in the prevention and treatment of infectious diseases. Front Microbiol. 14, 1286364(2023).
  3. Zhou, X., et al. Synergistic effects of Chinese herbal medicine: a comprehensive review of methodology and current research. Front Pharmacol. 7, 201(2016).
  4. Li, X., et al. Advancing traditional Chinese medicine research through network pharmacology: strategies for target identification, mechanism elucidation, and innovative therapeutic applications. Am J Chinese Med. 53 (07), 2021-2042 (2025).
  5. Li, B. H., Li, Z. Y., Liu, M. M., Tian, J. Z., Cui, Q. H. Progress in traditional Chinese medicine against respiratory viruses: a review. Front Pharmacol. 12, 743623(2021).
  6. Xu, Q., et al. An evaluation strategy of high-quality traditional Chinese patent medicines with consistency as the core: A case study of Huoxiang Zhengqi Shui. Arabian J Chem. 18, 1302024(2025).
  7. Li, L., et al. Huoxiang Zhengqi dropping pills alleviate exertional heat stroke–induced multiple organ injury through sustaining intestinal homeostasis via regulating MAPK/NF-κB pathway and gut microbiota in rats. Front Pharmacol. 15, 1534713(2025).
  8. Wu, Y., et al. Unlocking the therapeutic potential of Huoxiang Zhengqi San in cold and high humidity-induced diarrhea: Insights into intestinal microbiota modulation and digestive enzyme activity. Heliyon. 10 (12), e32789(2024).
  9. Hua, H., et al. From traditional medicine to modern medicine: the importance of TCM regulatory science (TCMRS) as an emerging discipline. Chinese Med. 20 (1), 92(2025).
  10. Zhang, C., et al. Multi-component Chinese medicine formulas for drug discovery: state of the art and future perspectives. Acta Mater Med. 2 (1), 106-125 (2023).
  11. Li, X., et al. Integration of non-targeted multicomponent profiling, targeted characteristic chromatograms and quantitative to accomplish systematic quality evaluation strategy of Huo-Xiang-Zheng-Qi oral liquid. J Pharma Biomed Anal. 236, 115715(2023).
  12. Chen, Y., et al. Identification and quality control of isomers in Huo-Xiang-Zheng-Qi Mixture using ultra-high performance liquid chromatography-quadrupole time-of-flight mass spectrometry and inductive effects analysis. J Pharma Biomed Anal. 255, 116646(2025).
  13. Guo, H., Pang, X., Zhang, W., Jiang, W., Pang, X. Dissolution determination of five components in Huoxiang Zhengqi tablets using partitioned dispersive liquid-liquid microextraction combined with HPLC-UV. Anal Meth. 5 (11), 2674-2678 (2013).
  14. Bhadange, Y. A., Carpenter, J., Saharan, V. K. A comprehensive review on advanced extraction techniques for retrieving bioactive components from natural sources. ACS Omega. 9 (29), 31274-31297 (2024).
  15. Silva, A. S., et al. Evaluation of the status quo of polyphenols analysis: Part I—phytochemistry, bioactivity, interactions, and industrial uses. Comp Rev Food Sc Food Safety. 19 (6), 3191-3218 (2020).
  16. Kaufmann, A., Teale, P. Capabilities and Limitations of High-Resolution Mass Spectrometry (HRMS): Time-of-flight and Orbitrap. Chem Anal Non-antimicrob Vet Drug Resid Food. , 93-139 (2016).
  17. Vaniya, A., Fiehn, O. Using fragmentation trees and mass spectral trees for identifying unknown compounds in metabolomics. TrAC Trends Anal Chem. 69, 52-61 (2015).
  18. Belov, M. E., et al. From protein complexes to subunit backbone fragments: a multi-stage approach to native mass spectrometry. Anal Chem. 85 (23), 11163-11173 (2013).
  19. Ma, X. Recent advances in mass spectrometry-based structural elucidation techniques. Molecules. 27 (19), 6466(2022).
  20. Ridder, L., et al. Substructure-based annotation of high-resolution multistage MSn spectral trees. Rapid Comm Mass Spectr. 26 (20), 2461-2471 (2012).
  21. Tao, Y., et al. Abelmoschus manihot (L.) medik. seeds alleviate rheumatoid arthritis by modulating JAK2/STAT3 signaling pathway. J Ethnopharmacol. 325, 117641(2024).
  22. Liu, J., et al. Qi-Sai-Er-Sang-Dang-Song decoction inhibits pyroptosis and inflammation in THP-1 cells and alleviates rheumatoid arthritis by inhibiting the NLRP3-pyroptosis signaling pathway. Phytomedicine. 148, 157481(2025).
  23. Jian, W. Modern liquid chromatography and mass spectrometry for targeted biomarker quantitation. Target Biomarker Quantitat LC–MS. , 45-63 (2017).
  24. Zeng, P., Li, J., Chen, Y., Zhang, L. The structures and biological functions of polysaccharides from traditional Chinese herbs. Progr Mol Biol Transl Sci. 163, 423-444 (2019).
  25. Abdel Tawab, M., et al. Electrospray mass spectrometry with consecutive fragmentation steps (ESI-MSn) as a tool for rapid and sensitive analysis of ginsenosides and their galactosyl derivatives. Helvetica Chim Acta. 83 (4), 739-747 (2000).
  26. Zhang, A., Sun, H., Yan, G., Wang, X. Recent developments and emerging trends of mass spectrometry for herbal ingredients analysis. TrAC Trends Anal Chem. 94, 70-76 (2017).
  27. Vukics, V., Guttman, A. Structural characterization of flavonoid glycosides by multi-stage mass spectrometry. Mass Spectr Rev. 29 (1), 1-16 (2010).
  28. Cortese, M., Gigliobianco, M. R., Magnoni, F., Censi, R., Di Martino, P. Compensate for or minimize matrix effects? Strategies for overcoming matrix effects in liquid chromatography-mass spectrometry technique: a tutorial review. Molecules. 25 (13), 3047(2020).
  29. Gerothanassis, I. P., Troganis, A., Exarchou, V., Barbarossou, K. Nuclear magnetic resonance (NMR) spectroscopy: basic principles and phenomena, and their applications to chemistry, biology and medicine. Che Edu Res Pract. 3 (2), 229-252 (2002).
  30. Kumar, N., Jaitak, V. Recent advancement in NMR based plant metabolomics: techniques, tools, and analytical approaches. Crit Rev Anal Chem. 56 (1), 1-25 (2026).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Linear Ion TrapMass SpectrometryStructural AnalysisUnknown CompoundChinese Herbal CompoundsHuoxiang ZhengqiUltra Performance Liquid ChromatographyMultistage FragmentationMolecular Structure DerivationBioactive Small Molecules

Related Articles