Podwójna transdukcja lentiwirusowa do wygenerowania mutantnych komórek macierzystych neuronów dla badań nad glejakiem

Podsumowanie

Ten protokół opisuje wytwarzanie mutantnych mysich komórek macierzystych neuronów (NSCs) do badań nad glejakiem z wykorzystaniem sekwencyjnych transdukcji lentiwirusowych. Najpierw wprowadza się mutacje onkogenne do NSC, a następnie bicistronowy lentiwirus zawierający geny reporterowe. Po dwukrotnej selekcji antybiotykowej, mutantne NSC umożliwiają obrazowanie w czasie rzeczywistym wzrostu guza i odpowiedzi na leczenie.

Streszczenie

Gliomy są najczęściej występującymi pierwotnymi nowotworami mózgu u dorosłych, a modele mysie sugerują, że mogą powstawać z onkogennych mutacji w NSC lub we wczesnych progenitorach różnicujących się. Ortotopowi modele przeszczepu pochodzące z mutantnych NSC mają zatem potencjał dostarczania cennych informacji preklinicznych na temat patogenezy, wyników i odpowiedzi na leczenie glist. Modele te wymagają wprowadzenia onkogennej mutacji do NSC, preferowane w połączeniu z reporterami, aby pomóc w określeniu wydajności transfekcji/transdukcji oraz monitorowaniu wzrostu guza in vivo. Ten protokół opisuje metodologię opartą na podwójnej transdukcji do generowania mutantnych NSC nadających się do monitorowania guza in vivo. W tej technice, izolowane NSC są najpierw transdukowane wirusami lenci zawierającymi gen interesujący (onkogenną mutację lub kontrolę białka zielonej fluorescencji [GFP]) oprócz elementu odporności na blastycydynę. Po selekcji blastycydyny, komórki są następnie transdukowane bicistronicznym wektorem wirusa lenci wytwarzającym lucyferazę i czerwoną fluorescencyjną białko (RFP), a także elementem odporności na puromycin. Po selekcji puromycinu, komórki mogą być rozmnażane do badań proliferacji, ortotopowego przeszczepu lub innych zastosowań w dalszej kolejności. To podejście podwójnej transdukcji pozwala na oszacowanie wydajności transdukcji na obu etapach infekcji, a także na monitorowanie in vivo ustabilizowania, wzrostu guza i odpowiedzi na terapię przy użyciu nieinwazyjnego obrazowania bioluminescencyjnego (BLI). System ten stanowi przydatne narzędzie do badań nad gliakami, łącząc biologiczną istotność modelowania nowotworów pochodzenia dorosłych komórek macierzystych nerwowo-glejowych z praktyczną korzyścią zdolności obrazowania w czasie rzeczywistym, ostatecznie poprawiając rozumienie biologii gliomi i rozwój nowych podejść terapeutycznych.

Wprowadzenie

Gliomy są najczęstszą postacią pierwotnych guzów mózgu u dorosłych, stanowiąc około 80% wszystkich złośliwych nowotworów mózgu w tej populacji¹. Większość z nich to wysoko złośliwe gliomaty², które są zazwyczaj bardzo inwazyjne i mają złą prognozę^3,4, mimo znacznych postępów w technikach neurochirurgicznych, radioterapii i podejściach chemioterapeutycznych⁵. Wysoka śmiertelność pacjentów dotkniętych tymi nowotworami podkreśla potrzebę ciągłych badań nad powstawaniem i rozwojem gliomat.

Gliomatogeneza w centralnym układzie nerwowym może być wywołana przez wprowadzenie onkogennych mutacji do NSC^6,7,8,9 lub ich wczesnych różnicujących potomków^10,11,12 w badaniach modelowych na myszach. Warto zauważyć, że te badania wykazały, że te same onkogenne mutacje często nie prowadzą do powstania guzów, gdy są wprowadzane do bardziej zróżnicowanych komók¹³, co ustanawia hierarchię pochodzenia komórkowego, gdzie zwiększona restrykcja linii koreluje ze zmniejszoną podatnością na transformację¹⁴. Genetycznie zmodyfikowane NSC są zatem powszechnie używane do generowania biologicznie istotnych i wszechstronnych modeli gliomat, stosując zarówno techniki transgeniczne, jak i metody transplantacji ortotopowej¹⁵. Oba podejścia pozwalają na badanie formacji de novo guzów w natywnym środowisku mózgu z nieprzekształconej komórki. Modele genetycznie zmodyfikowane pozwalają na to badanie na zwierzętach z zachowanym układem odpornościowym, często lepiej naśladując histologię i heterogeniczność komórkową obserwowaną w guzach ludzkich¹⁶. Jednak generowanie tych modeli jest pracochłonne i kosztowne, a one często wykazują długie czasy opóźnienia i niskie częstotliwości formacji guzów¹⁶. Natomiast modele ortotopowe NSC są łatwiejsze do manipulacji i bardziej opłacalne. Mutantne NSC mogą być generowane z komórek pierwotnych lub uwiecznionych zarówno z myszy, jak i ludzi, w oparciu o potrzeby eksperymentalne, i są również odpowiednie dla eksperymentacji in vitro.^16,17. Dodatkowo, te modele oferują możliwość precyzyjnej regulacji etapu rozwojowego zarówno NSC, jak i myszy biorących udział w eksperymencie, a także przestrzennej lokalizacji, z której NSC pochodzą i do której są wprowadzane. Umożliwia to badaczom zbadanie, jak wiek i określone regiony mózgu wpływają na tumorogenezę napędzaną określonymi mutacjami¹⁷.

Ten protokół opisuje metodologię generowania mutantnych mysich NSC z hodowli pierwotnej, które są odpowiednie zarówno do zastosowań eksperymentalnych in vitro, jak i in vivo (Rysunek 1). Protokół składa się z dwóch odrębnych faz transdukcji, które następują w określonej kolejności czasowej. W początkowej fazie transdukcji, izolowane mysie NSC są zakażane rekombinowanymi wirusami lentywirusowymi zawierającymi docelową konstrukcję genetyczną, albo onkogenną mutację, albo kontrolę białka zielonej fluorescencji (GFP), wraz z kasetą odporności na blastycydynę. Następnie stosuje się selekcyjną presję antybiotykową za pomocą blastycydyny, pozwalając tylko przetrwałym zainfekowanym komórkom przejść do wtórnej fazy transdukcji. Ta wtórna faza wykorzystuje bicystroniczny konstrukt lentiwirusowy, który koduje zarówno luciferase świetlikowe, jak i czerwony białko fluorescencyjny (RFP), w połączeniu z elementami odporności na puromycynę do dalszej selekcji. Po selekcji za pomocą puromycyny, powstałe populacje NSC podwójnie przeprowadzone są rozwijane in vitro przed kolejnymi eksperymentami. To sekwencyjne podejście do transdukcji oferuje kilka zalet metodologicznych: (1) umożliwia ilościową ocenę efektywności transdukcji na każdym etapie¹⁸, (2) ustanawia stabilne linie komórek reporterowych nadających się do długotrwałego śledzenia, i (3) umożliwia nieinwazyjne monitorowanie inicjacji guzów, kinetyki progresji i reakcji terapeutycznych za pomocą metodologii BLI^18,19,20. Może być również stosowany z pierwotnymi lub uwiecznionymi NSC^21,22,23.

Prezentowany tutaj protokół odpowiada na pilną potrzebę sstandardyzowanego, efektywnego i biologicznie istotnego podejścia do generowania modeli gliomat pochodzących od NSC z dorosłych zwierząt z zintegrowanymi możliwościami obrazowania. Oczekuje się, że wynikające z tego modele dostarczą wnikliwych informacji klinicznie istotnych dotyczących patogenezy gliomat, ułatwią identyfikację nowych celów terapeutycznych i stanowią solidne platformy dla przedklinicznej oce

Protokół

To badanie przeprowadzono zgodnie ze standardami etycznymi i wytycznymi regulacyjnymi ustanowionymi przez Washington University w St. Louis. W przypadku tego protokołu kora myszy dorosłych była mikrodyscypowana zgodnie z opisanymi wcześniej technikami laboratorium Brossier²⁴ i używana do izolowywania pierwotnych murynowych NSC w celu późniejszego ekspansji w nieprzylegającej kulturze zgodnie z ustanowioną procedurą^24,25,26. Wszystkie stosunkowe reagenty są dostarczane w sterylnym formacie lub przepuszczane przez membranowy filtr 0,2 μM, aby zapewnić sterylność. Reagenty i użyte sprzęty są wymienione w Tabeli Materiałów.

1. Izolacja komórek macierzystych nerwowych z mikrodyscypowanego tkanki

1.  Przygotuj medium dysocjacji (DM) i medium do trawienia trypsyną (TDM) zgodnie z recepturami przedstawionymi na Rysunku 2.
   1. Dodaj 200 μL medium do trawienia trypsyną do 1,5 mL mikrocentrifugujących probówek i trzymaj na lodzie przez co najmniej 20 minut przed użyciem. DM można pozostawić w temperaturze pokojowej na dalsze kroki w protokole.
   2. Podczas chłodzenia probówek, przygotuj bazową mieszankę środka do hodowli komórek macierzystych nerwowych (NSC; receptura przedstawiona na Rysunku 2) i umieść NSC oraz surowica wołowa (FBS) w 37 °C w łaźni wodnej lub kulkowej, aby się rozgrzeć. Umieść alikwoty suplementów (B27, N2) i czynników wzrostu (EGF, FGF) w koszulce zamrażającej, aby się powoli rozmrozić.
      UWAGA: TDM musi być przygotowywane świeże przed każdym użyciem, chociaż NSC i DM mogą być przechowywane w 4 °C między użyciami; receptury są przedstawione na Rysunku 2. Zapasy N2, B27, EGF i FGF powinny być podzielone na alikwoty i przechowywane w -20 °C aż do użycia; unikaj wielokrotnego mrożenia i rozmrażania zrekonstituowanych zapasów (patrz Tabela Materiałów dla dalszych szczegółów dotyczących przygotowania zapasów EGF i FGF).
2.  Po wystarczająco schłodzeniu probówek zawierających TDM, mikrodyscypuj tkankę zgodnie z opisanym wcześniej²⁴. Po każdej mikrodyscypacji umieść tkankę w mikroprobówce. Zwróć probówkę z powrotem na lód, aż wszystkie dyscypacje zostaną zakończone, ponieważ jakiekolwiek ogrzewanie tkanki może wcześnie rozpocząć proces enzymatycznego trawienia i prowadzić do nadmiernego trawienia.
3. Inkubować mikroprobówki przez 15 minut w 37 °C w łaźni wodnej lub kulkowej, aby rozpocząć enzymatyczne trawienie. Podczas inkubacji, przygotuj 10% FBS w NSC przez dodanie 0,5 mL FBS do 4,5 mL NSC.
   1. Po inkubacji, delikatnie pipetuj próbki 5-10 razy za pomocą 1 mL mikropipety, aby dalsze rozdzielić komórki, a następnie zneutralizuj trypsynę dodając 200 μL 10% FBS w NSC do każdej próbki. Pipetuj delikatnie w górę i w dół, aby wymieszać.
      UWAGA: Istotne jest przestrzeganie zalecanego czasu inkubacji w 37 °C. Nadmierne trawienie może prowadzić do śmierci komórek, podczas gdy niedostateczne trawienie może utrudnić rozdzielenie próbki (patrz Tabela 1, Punkty 1-2 dla tej i innych wskazówek dotyczących rozwiązywania problemów).
      UWAGA: Do inkubacji próbek można użyć kąpieli wodnej lub kulkowej; ta ostatnia może zmniejszyć ryzyko skażenia²⁷, ale może to prowadzić do ryzyka mniej efektywnego przenoszenia ciepła²⁸.
4. Odśrodkowuj izolowane pierwotne komórki z 630 x g przez 5 minut w 4 °C. Aspirat nadstanu, uważając, aby nie zakłócać komórek na dnie dołka. Przepłukuj komórki, dodając 2,5 mL DM do pelletu komórek i resuspendując przez delikatne pipetowanie w górę i w dół 3-4 razy. Odśrodkowuj ponownie przez 630 x g przez 5 minut w 4 °C i uważnie aspirat nadstanu.
5. Powtórz krok 1.3, aby wykonać drugą mycie. Podczas ostatniego mycia, dodaj B27, N2, FGF i EGF do uprzednio rozgrzanej bazowej mieszanki środka NSC, aby stworzyć pełne medium NSC (receptura przedstawiona na Rysunku 2).
6. Aspirat nadstanu. Dodaj 2 mL ciepłego pełnego medium NSC do każdego pelletu komórek, a następnie resuspenduj przez delikatne pipetowanie w górę i w dół 3-4 razy. Umieść resuspendowane komórki w jednej komórce płytki 6-dołkowej z niską przyczepnością i inkubować w 37 °C.
   UWAGA: Chociaż bazowa mieszanka środka NSC może być przechowywana w 4 °C między użyciami, suplementy i czynniki wzrostu mogą ulegać degradacji w tej temperaturze. Dlatego B27, N2, FGF i EGF powinny być dodawane do środka NSC, aby stworzyć pełne medium NSC bezpośrednio przed użyciem.

Wyniki

Domrosłe NSC były izolowane z kory dorosłych myszy C57BL/6 i hodowane w kulturze nieadherentnej³⁹, co prowadziło do powstania pierwotnych neurosfer (20 – 250 µm) w ciągu 7 do 10 dni (Rycina 1). Następnie komórki były rozmnażane in vitro. Optymalizacja selekcji blastycydyny została następnie przeprowadzona na nietransdukowanych NSC (Krok 3). Po 24 h selekcji stężenia na poziomie 1000 ng/mL (1 µg/mL) blastycydyny lub wyższe prowadziły do zmniejszenia wielkości ...

Dyskusja

Ta metoda dwuetapowej transdukcji lentywirusowej z powodzeniem wygenerowała genetycznie zmodyfikowane komórki NSC, nadające się do badań onkologicznych. Przedstawiono tu efektywną integrację onkogennej mutacji BRAF V600E (znalezionej w podgrupie wysoko złośliwych glist komórkowych u dorosłych i wykorzystanej tutaj jako dowód koncepcji) lub kontroli GFP z dwoma systemami reporterowymi do obrazowania bioluminescencyjnego (lucyferaza) i wykrywania mikroskopii fluorescencyjnej (RFP). Kolejne transdukcje przy stałym ...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
β-mercaptoethanol (BME)	Sigma	M3148-25ML	Używaj w szafce bezpieczeństwa biologicznego. Wykonaj 50 mM składników poprzez dodanie 35 mL BME do 10 mL niskoglukozy DMEM, przefiltruj sterylnie i podziel na 500 mL alikwoty do użytku w przygotowaniu medium.
Anti-mouse IgG, HRP-linked Antibody	Cell Signal Technology	7076	Używany w rozcieńczeniu 1:2000 w 1% mleka beztłuszczowego
B-27 Supplement (50X),	Gibco	17504-044	Pierwszego użycia, rozmrozi i przygotuj 1ml alikwoty do przyszłego użytku; przechowuj alikwoty w -20 °C. Trzymaj suplementy na lodzie po rozmrożeniu, aż będą gotowe do dodania do medium
Blasticidin S HCl (10 mg/mL)	Gibco	A1113903	Przygotuj alikwoty 10 mg/mL składnika; umieść w małych 200 mL probówkach i przechowuj w -20 °C aż do użycia.
Bovine Serum Albumin (BSA)	Millipore-Sigma	A1470-10G	Używany jako 10% BSA waga/objętość w 1x PBS. BSA jest lepki; upewnij się, że ważą go odpowiednio i dodają odpowiednią objętość płynu do rozcieńczania, aby uzyskać dokładny roztwór.
Cell Strainer (40 µm)	Midsci	40ICS	Wstępnie sterylne i indywidualnie zapakowane. Muszą być otwierane wewnątrz szafki bezpieczeństwa biologicznego. Nie dotykać go bezpośrednio rękami
D-Luciferin, Potassium Salt	Gold Biotechnology	eLUCK-100	Przygotuj 15 mg/mL roztwór roboczy (rozcieńczony w wodzie o czystości molekularnej) i przefiltruj sterylnie przed użyciem. Przygotuj świeży składnik za każdym razem i dodaj bezpośrednio do medium, aby osiągnąć końcową koncentrację roboczą 150 mg/mL (np. 5 mL roztworu roboczego na 500 mL hodowli)
DMEM, Low-Glucose	Gibco	11885-084	Używany do przygotowania podstawowego medium NSC
Epidermal Growth Factor (EGF)	Corning	354001	Dostarczany jako sterylny liofilizowany proszek; aby odtworzyć 1000X składnik, dodaj 4,95 mL PBS i 50 µL 10% BSA (w 1x PBS) do 100 µg liofilizowanego proszku EGF i pipetą połącz.  Przygotuj 500 µL lub mniejsze alikwoty w małych probówkach i przechowuj w -20° C aż do użycia dla kompletnego medium NSC i suplementu do karmienia NSC. Unikaj wielokrotnego zamrażania i rozmrażania.
Fibroblast Growth Factor, Basic (FGF)	R&D systems	233-FB	Dostarczany jako sterylny liofilizowany proszek; aby odtworzyć 1000X składnik, dodaj 1,24 mL PBS i 12,5  µL 10% BSA (w 1x PBS) do 25 µg liofilizowanego proszku FGF i pipetą połącz.  Przygotuj 500 µL lub mniejsze alikwoty w małych probówkach i przechowuj w -20° C aż do użycia dla kompletnego medium NSC i suplementu do karmienia NSC. Unikaj wielokrotnego zamrażania i rozmrażania.
Glucose, 45%	Corning	25-037-CI	Dostarczany jako sterylny roztwór. Nie otwieraj na zewnątrz szafki bezpieczeństwa biologicznego
HA-Tag (C29F4) Rabbit mAb	Cell Signal Technology	3724	Używany w rozcieńczeniu 1: 1000 w 3% Albumina krowie (Western blotting, do weryfikacji ekspresji tagu HA)
HBSS, 10x	Gibco	14185-052	Dostarczany jako sterylny roztwór. Nie otwieraj na zewnątrz szafki bezpieczeństwa biologicznego
HEPES, 1 M	Corning	25-060-CI	Dostarczany jako sterylny roztwór. Nie otwieraj na zewnątrz szafki bezpieczeństwa biologicznego
IVIS 50	PerkinElmer		Instrument powinien być włączony 30 minut przed użyciem, aby pozwolić kamerze ostygnąć do optymalnej temperatury. Oprogramowanie Living Image (wersja 4.3.1) jest używane do ilościowego pomiaru.
Lentivirus-Luciferase (Firefly)-2A-RFP	AMSBio	LVP324-PBS	LVP musi być podzielony na alikwoty i przechowywany w lodówce -80 °C
L-Glutamine, 200 mM	Corning	25-005-CI	Dostarczany jako sterylny roztwór. Nie otwieraj na zewnątrz szafki bezpieczeństwa biologicznego
Molecular-Grade Water	Corning	46-000-CM	Dostarczany jako sterylny roztwór. Nie otwieraj na zewnątrz szafki bezpieczeństwa biologicznego
N-2 Supplement (100x)	Gibco	17502-048	Pierwszego użycia, rozmrozi i przygotuj 1ml alikwoty do przyszłego użytku; przechowuj alikwoty w -20 °C. Trzymaj suplementy na lodzie po rozmrożeniu, aż będą gotowe do dodania do medium
Nestin (E5C7I) Rabbit mAb	Cell Signal Technology	89529	Używany w rozcieńczeniu 1: 1000 w 3% Albumina krowie (Western blotting, do weryfikacji ekspresji markera NSC)
Neurobasal Media	Gibco	21103-049	Używany do przygotowania podstawowego medium NSC
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)	Gibco	15140-122