Trójwymiarowy model kultury wspierający rozwój ludzkich mieszków włosowych od fazy wtórnej do antralnej in vitro

Podsumowanie

To badanie stworzyło trójwymiarowy (3D) model kultury, który utrzymuje rozwój ludzkiego mieszków włosowych od etapu wtórnego do antralnego in vitro. System ten umożliwia wzrost mieszków i tworzenie antrum, zachowując jednocześnie cechy molekularne komórek somatycznych, zapewniając kluczowy model do badań nad ludzkim cechem płciowym.

Streszczenie

Ludzkie folikulogeneza jajnikowa to złożony, ściśle regulowany proces, który jest trudny do badania bezpośrednio in vivo. Chociaż modele in vitro są niezbędne do badań mechanizmu, istniejące systemy pozostają nieoptymalne, ponieważ nie mogą odtworzyć przestrzenno-czasowej dynamiki rozwoju pęcherzyka. Niniejsze badanie przedstawia model 3D kultury, który wspiera ludzki rozwój pęcherzyka od etapu wtórnego do stadiowego. Model ten skutecznie odtworzył kluczowe in vivo zdarzenia morfologiczne, w tym trwały wzrost pęcherzyka, wyraźny etap ekspansji średnicy od dnia 10 i utworzenie jamy przestrzeni pęcherzykowej około dnia 20. Co ważne, ta progresja rozwojowa zakończyła się pomyślnym odzyskaniem żywotnych komórek jajowych na etapie pęcherzyka germinalnego (GV). Ponadto analiza immunofluorescencyjna ujawniła wyraźne wzorce ekspresji receptorów gonadotropin w komórkach somatycznych, zgodne z tożsamością komórek granulozowych i teca. Komórki podobne do wewnętrznej granulozy wykazywały wysoką ekspresję receptorów hormonu folikulotropowego (FSHR), podczas gdy zewnętrzne komórki podobne do teca wykazywały wysoką ekspresję receptorów hormonu luteinizującego (LHR). Ten model oferuje wartościową platformę do badania ludzkiej folikulogeneza i toksykologii rozrodczej oraz zapewnia referencję dla optymalizacji in vitro systemów kultury pęcherzyka na potrzeby rozwoju od etapu wtórnego do stadiowego.

Wprowadzenie

Fizjologiczny proces rozwoju pęcherzyka jajnikowego, od stadium pierwotnego do przedojczynnikowego, jest fundamentalny dla płodności kobiet¹. Proces ten obejmuje wysoce skoordynowaną serię zdarzeń, w tym wzrost/dojrzewanie oocytów oraz proliferację/dyferencjację komórek ziarnistej². Zakłócenia w tych złożonych mechanizmach stanowią główną przyczynę niepłodności i dysfunkcji jajników. Dlatego szczegółowe zrozumienie sieci regulacyjnych leżących u podstaw pęcherzykowcowania—obejmujących sygnalizację parakrynową, interakcje oocyt-komórki somatyczne oraz dynamikę macierzy pozakomórkowej—ma krytyczne znaczenie patofizjologiczne. Jednakże bezpośrednie badania pęcherzykowcowania człowieka in vivo są ograniczone z powodu ograniczeń etycznych i praktycznych, co powoduje potrzebę wiarygodnych modeli in vitro do wyjaśnienia tych mechanizmów. Mimo postępów, nadal brakuje długoterminowego modelu kultury, który wspiera rozwój ludzkich pęcherzyków, szczególnie od stadium wtórnego do jamowego.

Mimo że kultura pęcherzyka ludzkiego w dwuwymiarowych (2D) lub trójwymiarowych (3D) macierzach poszerzyła zrozumienie wczesnego rozwoju pęcherzykowego^3,4, takie systemy nadal są ograniczone w wspieraniu postępu do późniejszych etapów. Warto zauważyć, że osiągnięcie pęcherzykowcowania człowieka in vitro przez późniejsze etapy rozwoju jest szczególnie trudne ze względu na większą wielkość pęcherzyka i dłuższy czas dojrzewania⁵. Nawet wśród ograniczonej liczby ludzkich systemów kultury pęcherzyka in vitro, które z powodzeniem wytworzyły oocyty MII, współczynnik dojrzewania pozostaje niski (najwyżej około 20%)^6,7,8,9. Być może bardziej fundamentalnym wyzwaniem jest odtworzenie przejścia wtórnego do jamowego, krytycznej i strukturalnie złożonej fazy, która jeszcze nie została odpowiednio przemodelowana in vitro.

To badanie ustanowiło model 3D kultury, który wspiera in vitro rozwój ludzkich pęcherzyków wtórnych w pęcherzyki jamowe o wyraźnych strukturach jamowych. Model ten zapewnia fundamentową platformę do dalszych badań nad mechanizmami regulacyjnymi leżącymi u podstaw rozwoju ludzkich pęcherzyków i służy jako referencja dla przyszłej optymalizacji systemów kultury pęcherzyków ukierunkowanych na rozwój wtórny do jamowego.

Protokół

Ten protokół badań został przeanalizowany i zatwierdzony przez Komitet Etyczny Trzeciego Szpitala Uniwersytetu w Pekinie (numer zgody M2024151). Wszyscy opiekunowie prawni nieletnich uczestniczących w badaniu podpisali pisemną zgodę na udział w badaniu.

Źródło tkanki
Ludzka tkanka rdzenna jajnika użyta w tym protokole została pozyskana od czterech pacjentów dziecięcych z rozpoznaniem teratomy jajnika (w wieku 2, 6, 13 i 16 lat), którzy przekazali tkankę jajnika w celach badawczych (Tabela 1). Kora jajnika została wykorzystana do badań nad krioprezerwacją tkanki jajnika, podczas gdy pozostała tkanka rdzenna została zastosowana do in vitro hodowli folikulów w tym badaniu. Łącznie wyizolowano 33 pęcherzyki wtórne, z czego 16 pęcherzyków przypisano do grupy kontrolnej, a 17 do grupy hodowli 3D.

Przygotowanie odczynników
Środek transportowy składał się z pożywki Leibovitz's L-15 uzupełnionej o 10% surowicy zastępczej, która była przechowywana w temperaturze 4 °C. Kompletny roztwór trawienny został przygotowany poprzez uzupełnienie MEMα o 0,04 mg/mL Liberase DH, 10 IU/mL DNase I i 100 IU/mL penicyliny i streptomycyny, a następnie przechowywano w temperaturze -20 °C. Roztwór zatrzymania trawienia był DPBS uzupełniony o 10% surowicy zastępczej i przechowywany w temperaturze 4 °C. Kompletny środek wzrostowy został przygotowany poprzez uzupełnienie MEMα o 10% surowicy zastępczej, 1% insuliny‑transferryny‑selenu, 50 µg/mL kwasu L‑askorbinowego, 2 mM pirogronianu sodu i 100 IU/mL penicyliny i streptomycyny. Środek przechowywano w temperaturze 4 °C. Rekombinowane ludzkie hormony folikulotropowe (FSH) zostały dodane w końcowej koncentracji 100 mIU/mL na początku hodowli, zgodnie z opisem w poprzednim badaniu¹⁰. Po wizualnym wykryciu wczesnego formowania się antrum (około dnia 20), rekombinowane ludzkie hormony luteinizujące (LH) zostały uzupełnione do końcowej koncentracji 10 mIU/mL podczas zmian środka. Stały podłoże kultury zostało przygotowane poprzez zmieszanie 70% (v/v) podłoża bazalnej błony z 30% (v/v) lodowatego pełnego środka wzrostowego i przechowywano na lodzie podczas wszystkich etapów manipulacji.

Trawienie tkanki i izolowanie pęcherzyków wtórnych
Tkanka jajnika została umieszczona w środku transportowym i przetransportowana do laboratorium w temperaturze 4 °C. W warunkach sterylnych rdzeń jajnika został wydzielony za pomocą skalpela. Tkanka została przecięta na cienkie kawałki (~3 × 3 × 1 mm) i dalej drobno posiekana na małe fragmenty (~0.5 × 0.5 × 1 mm) za pomocą krojaka do tkanki, utrzymując wilgotność tkanki. Przecięta tkanka została przeniesiona do 35 mm naczynia, a dodawane było przegrzane kompletne rozwiązanie trawienia w ilości 2 mL na 100 mg tkanki. Inkubacja była prowadzona w temperaturze 37 °C przez 45–80 min (średnia: 60 ± 15 min), z delikatnym mieszaniem co 10 min. Trawienie było kończone, gdy badanie mikroskopowe wykazało rozluźnienie struktury stromalnej i uwolnienie pojedynczych pęcherzyków (Rysunek 1). Zdrowe pęcherzyki wtórne (średnica 100–200 µm, z co najmniej 2 warstwami komórek granulozy i widocznym oocytem) były selekcjonowane pod mikroskopem stereoskopowym za pomocą pipety kontrolowanej ustnie (średnica wewnętrzna 200 µm) i dwukrotnie przemywane przegrzanym kompletnym środkiem wzrostowym.

3D osadzanie i długotrwała kultura
Wkładka do hodowli komórek została umieszczona w 35 mm naczyniu namoczona 2 mL kompletnego środka wzrostowego i wstępnie zrównoważona w inkubatorze (37 °C, 5% CO₂) przez 2 h. Wybrane pęcherzyki wtórne zostały przeniesione do wkładki i wstępnie hodowane przez noc pod tymi samymi warunkami. Na koniec pre‑hodowli, pęcherzyki z grupy kontrolnej były hodowane bezpośrednio w wkładce (kultura 2D). Natomiast pęcherzyki przeznaczone do grupy 3D‑hodowli zostały przygotowane do osadzenia w podłożu bazalnej błony o zmniejszonej zawartości czynników wzrostowych (łączna zawartość białka 8~12 mg/mL). Podłoże zostało rozmrożone na lodzie i wymieszane z 30% (v/v) lodowatego kompletnego środka wzrostowego. Krople 40 µL mieszaniny zostały umieszczone w 35 mm naczyniu (maksymalnie sześć kropel na naczynie), aby utworzyć jednolitą warstwę żelu o wysokości około 1,5 mm. Następnie, pojedynczy pęcherzyk wtórny został przeniesiony do każdej kropli za pomocą pipety kontrolowanej ustnie, ostrożnie umieszczonej w środkowo‑górnej części

Wyniki

Rozwój modelu 3D kultury wspierającej wzrost ludzkiego mieszka włosowego do etapu pęcherzykowego
Głównym wyzwaniem w badaniach nad mieszkami jajnikowymi jest opracowanie systemu kultury in vitro, który wspiera pełny rozwój mieszka, z tworzeniem jaskini pęcherzykowej jako kluczowym punktem etapowym. Dlatego w niniejszym badaniu ustanowiono model 3D kultury ludzkich mieszków in vitro (Rysunek 2). Łącznie 33 wtórnych mieszki zostały izol...

Dyskusja

Skuteczne utrzymanie ludzkich mieszków jajnikowych in vitro przez przejście od wtórnych do pęcherzykowych reprezentuje znaczący postęp techniczny. W niniejszym badaniu, 3D system hodowli zapewniający odpowiednie wsparcie biofizyczne i wskazówki hormonalne specyficzne dla stadiów umożliwił tę progresję. Wyniki te zgadzają się z ostatnimi dowodami podkreślającymi potrzebę stosowania 3D systemów hodowli do odtworzenia fizjologii tkanki. Podczas gdy konwencjonalne 2D monowarstwy są operacyjnie proste, brakuje im prz...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Anti-FSHR	HuaBio	ER1909-08
Anti-LHR	Santa Cruz	sc-293165
Anti-mouse(secondary)	Abcam	AB150113
Anti-rabbit(secondary)	Abcam	AB205718
Basement membrane matrix for organoid culture	MCE	K6004
BSA	Sigma	A1933
Cell culture insert	Millipore	PICMORG50
Culture dish	Corning	430165
DAPI	Beyotime	C1006
DNase I	Thermo	EN0525
DPBS	Gibco	14190144
FSH	Merck	F4021
Incubator	Thermo	Heracell 3111
Insulin-Transferrin-Selenium	Gibco	41400045
L-Ascorbic acid	MCE	HY-B0166
Leibovitz's L-15 medium	Gibco	11415064
LH	Merck	L6420
Liberase DH	Roche	5401054001
McIlwain Tissue chopper	Mickle Laboratory Engineering Co. Ltd.	MP10180-220
MEMα	Gibco	41061029
Paraformaldehyde	Solarbio	P1110
PBS	Gibco	10010023
Penicillin-Streptomycin	Gibco	15140122
Serum substitute supplement	FUJiFILM Irvine	90194
Sodium pyruvate	Gibco	11360070
Stereomicroscope	Nikon	SMZ1270
The high-content imaging system	PerkinElmer	Operetta CLS
Triton X-100	Sigma	X100