Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł badawczy
* These authors contributed equally
Badanie polegało na podaniu metyl-nitrozomocznika myszom C57BL/6 w celu wywołania uszkodzenia siatkówki, po którym następowało leczenie aktywatorами ALDH2 i inhibitorami wraz z modulatorami SIRT1 i stresu siateczki endoplazmatycznej (ERS). Protokół miał na celu zbadanie efektów ochronnych tych terapii na degenerację siatkówki oraz ich wpływ na metabolizm aldehydów.
Niniejsze badanie zbadano ochronne działanie aktywacji dehydrogenazy aldehydowej 2 (ALDH2) (za pośrednictwem Alda-1), hamowania ALDH2 (za pośrednictwem Daidzin) oraz modulacja syrutyny 1 (SIRT1) i stresu siateczki endoplazmatycznej (ERS) na uszkodzenia siatkówki wywołane przez metylonitrozomocznik (MNU) u myszy C57BL/6. Siedemdziesiąt dwie myszy zostały losowo przydzielone do ośmiu grup, w tym grupy kontrolnej, grupy MNU-samej i różnych grup leczenia kombinacyjnego. Myszom podawano dootrzewnowo agonisty i inhibitory ukierunkowane na oś ALDH2-SIRT1-ERS. Wagę ciała, grubość warstw siatkówki i biomarkery metabolizmu aldehydów oceniono w drugi i czwarty dzień po leczeniu. Podawanie MNU wywołało zwyrodnienie siatkówki, co skutkowało znaczną utratą masy ciała we wszystkich grupach z wyjątkiem kontrolnej. Leczenie Alda-1 zmniejszyło uszkodzenie siatkówki, podczas gdy Daidzin je zaostrzył. Farmakologiczne hamowanie SIRT1 (za pośrednictwem EX-527) zmniejszyło efekty ochronne Alda-1, a indukcja ERS (za pośrednictwem TUN) prawie całkowicie zniosła jej korzyści. Z kolei aktywowanie SIRT1 (za pośrednictwem SRT1720) złagodziło niekorzystne działanie Daidzin, podczas gdy hamowanie ERS (za pośrednictwem 4-PBA) częściowo złagodziło wpływ Daidzin. Co więcej, MNU zwiększyło poziomy markerów metabolizmu aldehydów (malonodialdejd [MDA] i 4-hydroksy-2-nonenal [4-HNE]), przy czym Alda-1 obniżył, a Daidzin podniósł te poziomy. Ponadto farmakologiczna modulacja szlaków SIRT1/ERS interweniowała w regulacyjne działania Alda-1 i Daidzin na metabolizm aldehydów. Ogólnie rzecz biorąc, aktywowanie ALDH2 chroniło strukturę siatkówki i regulowało metabolizm aldehydów, podkreślając kluczową rolę osi sygnałowej ALDH2-SIRT1/ERS w łagodzeniu zwyrodnienia siatkówki.
Zwyrodnienie siatkówki, jedna z głównych przyczyn ślepoty na świecie, obejmuje schorzenia takie jak siatkówczak (RP), zwyrodnienie plamki żółtej związane z wiekiem (AMD) i retinopatia cukrzycowa (DR), które razem dotykają miliony osób i nakładają znaczne obciążenia społeczno-ekonomiczne1,2,3. Jednakże obecnie brak jest wysoce skutecznych terapii farmakologicznych, które zatrzymałyby postępy tych chorób ślepoty siatkówki w praktyce klinicznej. Patogeneza zwyrodnienia siatkówki jest wieloczynnikowa i obejmuje stres oksydacyjny, przewlekłą odpowiedź zapalną oraz stres siateczki śródplazmatycznej (ERS), który zakłóca homeostazę komórek siatkówki. Te czynniki stresowe są często wyzwalane przez wewnętrzne zaburzenia metaboliczne (np. dysfunkcję mitochondria), ostatecznie prowadząc do apoptozy i nieodwracalnych uszkodzeń siatkówki4. Metylo-nitrozomocznik (MNU), silny czynnik alkylujący DNA, stał się szeroko stosowanym chemicznym induktorem do modelowania zwyrodnienia siatkówki5. Model choroby siatkówki indukowanej MNU służy jako cenne narzędzie do badania mechanizmów chorobowych i oceny potencjalnych interwencji terapeutycznych. Mechanizm działania MNU polega na wywoływaniu stresu oksydacyjnego poprzez generowanie reaktywnych form tlenu (ROS) i zakłócanie równowagi redoks, powodując w ten sposób uszkodzenia błon i organelli fotoreceptorów. Może to również wpłynąć na metabolizm aldehydów, upośledzając detoksykację peroksydacji lipidów. Następczą akumulację toksycznych aldehydów można zaostrzać uszkodzenia oksydacyjne, wzmacniając apoptozę fotoreceptorów6.
Aldehyd dehydrogenaza 2 (ALDH2), mitochondrialny enzym zależny od NAD+, odgrywa krytyczną rolę w detoksykacji toksycznych aldehydów takich jak 4-hydroksy-2-nonenal (4-HNE) i malondialdehyd (MDA) poprzez przekształcanie ich w mniej reaktywne kwasy karboksylowe, zapobiegając w ten sposób uszkodzeniom oksydacyjnym7. Mocna aktywność ALDH2 jest niezbędna do utrzymania równowagi redoks, a upośledzona funkcja ALDH2 została powiązana z przyspieszonym starzeniem się i neurodegeneracyjnymi patologiami8. Farmakologiczne aktywowanie ALDH2, szczególnie poprzez małe cząsteczki agonistyczne Alda-1, wykazano, że wywierają efekty cytoprotekcyjne w różnych modelach9,10. Sirtuina 1 (SIRT1), nikotynamidowa adenozynowa dinukleotyd + (NAD+)-zależna deacetylaza, reguluje reakcje na stres i metabolizm energetyczny poprzez modyfikowanie czynników transkrypcyjnych, w tym p53 i czynnika nuklearnego kappa B (NF-κB)11. Aktywacja SIRT1 wskazuje na promocję funkcji mitochondrialnej i przeżycia komórki, a badania łączą jej nadregulację ze zmniejszonym uszkodzeniem oksydacyjnym i zapaleniem w zwyrodnieniu siatkówki12. Stres siateczki śródplazmatycznej (ERS), wywołany akumulacją nieprawidłowo sfałdowanych białek, aktywuje niedojrzałą odpowiedź białkową (UPR), która może stać się kaskadą pro-apoptotyczną pod chronicznym stresem. ERS zostało powiązane ze zwyrodnieniem siatkówki, przyczyniając się do apoptozy fotoreceptorów13. Mimo tych ustaleń, szczególna współpraca pomiędzy ALDH2, SIRT1 i ERS w kontekście modelu zwyrodnienia siatkówki indukowanego MNU pozostaje słabo zrozumiana. Ponadto, zharmonizowane role tych powiązanych ścieżek wymagają dalszego systematycznego dochodzenia.
Dlatego obecne badanie miało na celu zbadanie wpływu kluczowych komponentów osi ALDH2-SIRT1-ERS—ALDH2 (poprzez Alda-1 lub Daidzin), SIRT1 (poprzez SRT1720 lub EX527) oraz ERS (poprzez 4-PBA lub TUN)—na uszkodzenia siatkówki indukowane MNU u myszy C57BL/6. Za pomocą analizy histopatologicznej i biochemicznej, zbadaliśmy, jak docelowanie tej osi wpłynęło na przeżycie fotoreceptorów i metabolizm aldehydów. Złożyliśmy hipotezę, że skoordynowana aktywność ALDH2, wzmocnienie SIRT1 i supresja ERS będą synergicznie łagodzić zwyrodnienie siatkówki indukowane MNU, dostarczając tym samym uzasadnienia dla docelowania tej osi w chorobach zwyrodnieniowych siatkówki.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenie etyczne
Wszystkie protokoły eksperymentalne zostały przeglądnięte i zatwierdzone przez Komitet ds. Opieki nad Zwierzętami Eksperymentalnymi i ich Użytkowania Uniwersytetu Medycznego w Fujian oraz przeprowadzone z należytą starannością zgodnie z Oświadczeniem Stowarzyszenia Badań nad Wizją i Okulistyką (ARVO) w sprawie stosowania zwierząt w badaniach okulistycznych i wizualnych.
Zwierzęta i przydział do grup
Łącznie 72 samców myszy C57BL/6 (w wieku 8–10 tygodni, waga ciała 20–25 g) uzyskane zostały od certyfikowanego dostawcy, zgodnie z krajowymi standardami hodowli zwierząt laboratoryjnych. Myszy były umieszczone w klatach z indywidualną wentylacją, w znormalizowanych warunkach środowiskowych, w tym 12-godzinnym cyklu światło/ciemność, kontrolowanej temperaturze (22 ± 2 °C) i wilgotności względnej (50 ± 10%), z dostępem do żywności i wody ad libitum. Aby zbadać modulacyjne efekty szlaków ALDH2, SIRT1 i ERS na uszkodzenia siatkówki wywołane przez MNU, myszy zostały losowo przydzielone do ośmiu grup eksperymentalnych (n = 9 na grupę; n = 5 dla grupy z drugiego dnia; n = 4 dla grupy z czwartego dnia) z wykorzystaniem sekwencji losowania wygenerowanej komputerowo w celu zminimalizowania błędu wyboru. Graficzny abstrakt badania został przedstawiony na Rysunku 1.
Przygotowanie reagentów i schematy leczenia
Reagenty eksperymentalne użyte w tym badaniu zostały wymienione w Tabeli Materiałów, z szczegółowymi informacjami dotyczącymi przygotowania i dawkowania, jak poniżej. (1) MNU (50 mg/kg): 100 mg MNU zostało rozpuszczone w 2 ml fizjologicznego roztworu soli, aby przygotować roztwór 50 mg/ml. Następnie 1,4 ml tego roztworu zostało rozcieńczone 5,6 ml fizjologicznego roztworu soli do stężenia końcowego 10 mg/ml do podawaniu zwierzętom. (2) Alda-1 (10 mg/kg): 50 mg proszku Alda-1 zostało rozpuszczone w 1 ml dimetylosulfonu (DMSO), aby przygotować roztwór 50 mg/ml, który został następnie rozcieńczony 24 ml fizjologicznego roztworu soli do stężenia końcowego 2 mg/ml. (3) Daidzin (10 mg/kg): 50 mg proszku Daidzin zostało rozpuszczone w 1 ml DMSO, aby przygotować roztwór 50 mg/ml, który następnie został rozcieńczony 24 ml fizjologicznego roztworu soli do stężenia końcowego 2 mg/ml. (4) EX-527 (10 mg/kg): 5 mg proszku EX-527 zostało rozpuszczone w 0,1 ml DMSO, aby przygotować roztwór 50 mg/ml, który został następnie rozcieńczony 2,4 ml fizjologicznego roztworu soli do stężenia końcowego 2 mg/ml. (5) SRT1720 (10 mg/kg): 5 mg proszku SRT1720 zostało rozpuszczone w 0,1 ml DMSO i dobrze wymieszane. Następnie dodano 400 μL PEG300, 50 μL Tween-80 i 450 μL fizjologicznego roztworu soli, aby przygotować roztwór roboczy o stężeniu 2 mg/ml. (6) TUN (10 mg/kg): 5 mg proszku TUN zostało rozpuszczone w 0,1 ml DMSO, aby przygotować roztwór 50 mg/ml, który następnie został rozcieńczony 2,4 ml fizjologicznego roztworu soli do stężenia końcowego 2 mg/ml. (7) 4-fenylobursztyn (4-PBA; 10 mg/kg): 2 mg proszku 4-PBA zostało rozpuszczone w 1 ml fizjologicznego roztworu soli, aby przygotować roztwór 2 mg/ml. Wszystkie powyższe objętości podawane były w 5 × M mililitrach (gdzie M = waga ciała zwierzęcia w kg). Następnie myszy zostały podzielone na osiem grup z następującymi protokołami leczenia:
Grupa kontrolna: Jednorazowe dootrzewnowe wstrzyknięcie fizjologicznego roztworu soli.
Grupa MNU: Jednorazowe dootrzewnowe wstrzyknięcie MNU.
Grupa MNU + Alda-1: Dootrzewnowe wstrzyknięcie Alda-1, następnie jednorazowe podanie MNU 2 godziny później. Alda-1 był następnie podawany dootrzewnowo raz dziennie.
Grupa MNU + Daidzin: Dootrzewnowe wstrzyknięcie Daidzin, następnie jednorazowe podanie MNU 2 godziny później. Daidzin był następnie podawany dootrzewnowo raz dziennie.
Grupa MNU + Alda-1 + EX-527: Dootrzewnowe wstrzyknięcie Alda-1, następnie wstrzyknięcie EX-527 1 godzinę później i wstrzyknięcie MNU 1 godzinę później (jednorazowe podanie). Alda-1 był następnie podawany dootrzewnowo raz dziennie.
Grupa MNU + Alda-1 + TUN: Dootrzewnowe wstrzyknięcie Alda-1, następnie wstrzyknięcie TUN 1 godzinę później i wstrzyknięcie MNU 1 godzinę później. Alda-1 był następnie podawany dootrzewnowo raz dziennie.
Grupa MNU + Daidzin + SRT1720: Dootrzewnowe wstrzyknięcie Daidzin, następnie wstrzyknięcie SRT1720 1 godzinę później i wstrzyknięcie MNU 1 godzinę później. Daidzin był następnie podawany dootrzewnowo raz dziennie.
Grupa MNU + Daidzin + 4-PBA: Dootrzewnowe wstrzyknięcie Daidzin, następnie wstrzyknięcie 4-PBA 1 godzinę później i wstrzyknięcie MNU 1 godzinę później. Daidzin był następnie podawany dootrzewnowo raz dziennie.
Monitorowanie
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Zmiany masy ciała
Przed rozpoczęciem eksperymentu nie stwierdzono istotnych różnic w masie ciała pomiędzy grupami. W drugim dniu po rozpoczęciu eksperymentu, z wyjątkiem grupy kontrolnej, w której odnotowano wzrost masy ciała z 17,0 ± 0,5 g do 17,4 ± 0,4 g, masa ciała myszy we wszystkich pozostałych grupach uległa istotnemu zmniejszeniu. W szczególności w grupie MNU masa ciała spadła z 17,4 ± 0,3 g do 16,2 ± 0,2 g, w grupie MNU + Alda-1 z 17,3 ± 0,3 g do 16,7 ± 0,4 g, w grupie MNU + Daidzin z 17,3 ...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Poprzednie badania sugerowały, że agonisty ALDH2 mogą zapewnić efekt ochronny przed wywołaną MNU degeneracją siatkówki14. Jednak efekty interwencyjne jej inhibitora, wraz z potencjalnymi ścieżkami zależnymi, takimi jak SIRT1 i ERS, nie zostały jeszcze szczegółowo zbadane. Istnieją badania wskazujące na udział SIRT1 i ERS w modelach degeneracji siatkówki, w tym w degeneracji siatkówki wywołanej światłem i u myszy genetycznie zmodyfikowanych z degeneracją siatkówki15,
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Autorzy zadeklarowali brak potencjalnych konfliktów interesów dotyczących badań, autorstwa lub publikacji tego artykułu.
Praca ta była wspierana przez granty Narodowej Fundacji Nauk Przyrodniczych Chin (nr 82301245), Wspólne Fundusze na rzecz innowacji w dziedzinie nauki i technologii, prowincji Fujian (nr 2024Y9653), Fundacji Nauk Przyrodniczych Prowincji Fujian w Chinach (nr 2024J011148) oraz Fundacji Nauk Doktoranckich Szpitala Generalnego w Fuzhou (numer grantu: 48678).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| 4HNE Kit | Elabscience,China | E-EL-0128 | Do pomiaru poziomów 4HNE w surowicy |
| 4-Phenylbutyric acid (4-PBA) | MCE, US | HY-A0281 | Czynnik do hamowania ERS |
| Alda-1 | MCE, US | HY-18936 | Aktywator ALDH2 do badań |
| Daidzin | MCE, US | HY-N0018 | Inhibitor ALDH2 do badań |
| Fluorescein sodium | Guangzhou | N/A | Stosowane do uzyskiwane za pomocą układu angiografii fluoresceinowej. Obrazy angiograficzne były analizowane pod kątem obecności jakiegokolwiek wycieku, nienaczynionych obszarów lub zmian w morfologii naczyń siatkówki. |
| ImageJ software | National Institutes of Health, USA | Wersja 1.53t | |
| MDA Kit | Beyotime, China | S0131S | Do pomiaru poziomów MDA w surowicy |
| N-Nitroso-N-methylurea (MNU) | MCE, US | HY-34758 | Środek alkylujący DNA do indukowania zwyrodnienia siatkówki |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich, US | 30525-89-4 | Stosowany do sekcji tkanki siatkówki |
| Precision digital scale | Electronic scale, China | SF-400 | POJEMNOŚĆ: 5000 g & acute; 1 g/177ozX0.10z, używany do rejestracji masy ciała każdego myszy |
| Prism | GraphPad | Wersja 5.01 | Oprogramowanie do analizy statystycznej |
| Rotary microtome | LEICA, Germany | RM2016 | Stosowany do przygotowania sekcji siatkówki |
| Selisistat (EX-527) | MCE, US | HY-15452 | Inhibitor SIRT1 do badań |
| Sodium Pentobarbital | Sigma-Aldrich, US | 1.93248 | Stosowany do znieczulenia na potrzeby późniejszych badań poprzez wstrzyknięcie dootrzewnowe (IP) |
| SRT1720 | MCE, US | HY-10532 | Aktywator SIRT1 do badań |
| Sumianxin | Jilin Shengda Animal Pharmaceutical Co | N/A | Stosowany do znieczulenia na potrzeby późniejszych badań poprzez wstrzyknięcie dootrzewnowe (IP) |
| Tunicamycin (TUN) | MCE, US | HY-A0098 | Czynnik do indukcji ERS |
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Ten artykuł został opublikowany
Film wkrótce dostępny