Farmakologiczna Modulacja Ośsi ALDH2-SIRT1-Stres Retikulum Endoplazmatycznego w Degeneracji Siatkówki Wywołanej MNU u Myszy C57BL/6: Badanie In Vivo

Podsumowanie

Badanie polegało na podaniu metyl-nitrozomocznika myszom C57BL/6 w celu wywołania uszkodzenia siatkówki, po którym następowało leczenie aktywatorами ALDH2 i inhibitorami wraz z modulatorami SIRT1 i stresu siateczki endoplazmatycznej (ERS). Protokół miał na celu zbadanie efektów ochronnych tych terapii na degenerację siatkówki oraz ich wpływ na metabolizm aldehydów.

Streszczenie

Niniejsze badanie zbadano ochronne działanie aktywacji dehydrogenazy aldehydowej 2 (ALDH2) (za pośrednictwem Alda-1), hamowania ALDH2 (za pośrednictwem Daidzin) oraz modulacja syrutyny 1 (SIRT1) i stresu siateczki endoplazmatycznej (ERS) na uszkodzenia siatkówki wywołane przez metylonitrozomocznik (MNU) u myszy C57BL/6. Siedemdziesiąt dwie myszy zostały losowo przydzielone do ośmiu grup, w tym grupy kontrolnej, grupy MNU-samej i różnych grup leczenia kombinacyjnego. Myszom podawano dootrzewnowo agonisty i inhibitory ukierunkowane na oś ALDH2-SIRT1-ERS. Wagę ciała, grubość warstw siatkówki i biomarkery metabolizmu aldehydów oceniono w drugi i czwarty dzień po leczeniu. Podawanie MNU wywołało zwyrodnienie siatkówki, co skutkowało znaczną utratą masy ciała we wszystkich grupach z wyjątkiem kontrolnej. Leczenie Alda-1 zmniejszyło uszkodzenie siatkówki, podczas gdy Daidzin je zaostrzył. Farmakologiczne hamowanie SIRT1 (za pośrednictwem EX-527) zmniejszyło efekty ochronne Alda-1, a indukcja ERS (za pośrednictwem TUN) prawie całkowicie zniosła jej korzyści. Z kolei aktywowanie SIRT1 (za pośrednictwem SRT1720) złagodziło niekorzystne działanie Daidzin, podczas gdy hamowanie ERS (za pośrednictwem 4-PBA) częściowo złagodziło wpływ Daidzin. Co więcej, MNU zwiększyło poziomy markerów metabolizmu aldehydów (malonodialdejd [MDA] i 4-hydroksy-2-nonenal [4-HNE]), przy czym Alda-1 obniżył, a Daidzin podniósł te poziomy. Ponadto farmakologiczna modulacja szlaków SIRT1/ERS interweniowała w regulacyjne działania Alda-1 i Daidzin na metabolizm aldehydów. Ogólnie rzecz biorąc, aktywowanie ALDH2 chroniło strukturę siatkówki i regulowało metabolizm aldehydów, podkreślając kluczową rolę osi sygnałowej ALDH2-SIRT1/ERS w łagodzeniu zwyrodnienia siatkówki.

Wprowadzenie

Zwyrodnienie siatkówki, jedna z głównych przyczyn ślepoty na świecie, obejmuje schorzenia takie jak siatkówczak (RP), zwyrodnienie plamki żółtej związane z wiekiem (AMD) i retinopatia cukrzycowa (DR), które razem dotykają miliony osób i nakładają znaczne obciążenia społeczno-ekonomiczne^1,2,3. Jednakże obecnie brak jest wysoce skutecznych terapii farmakologicznych, które zatrzymałyby postępy tych chorób ślepoty siatkówki w praktyce klinicznej. Patogeneza zwyrodnienia siatkówki jest wieloczynnikowa i obejmuje stres oksydacyjny, przewlekłą odpowiedź zapalną oraz stres siateczki śródplazmatycznej (ERS), który zakłóca homeostazę komórek siatkówki. Te czynniki stresowe są często wyzwalane przez wewnętrzne zaburzenia metaboliczne (np. dysfunkcję mitochondria), ostatecznie prowadząc do apoptozy i nieodwracalnych uszkodzeń siatkówki⁴. Metylo-nitrozomocznik (MNU), silny czynnik alkylujący DNA, stał się szeroko stosowanym chemicznym induktorem do modelowania zwyrodnienia siatkówki⁵. Model choroby siatkówki indukowanej MNU służy jako cenne narzędzie do badania mechanizmów chorobowych i oceny potencjalnych interwencji terapeutycznych. Mechanizm działania MNU polega na wywoływaniu stresu oksydacyjnego poprzez generowanie reaktywnych form tlenu (ROS) i zakłócanie równowagi redoks, powodując w ten sposób uszkodzenia błon i organelli fotoreceptorów. Może to również wpłynąć na metabolizm aldehydów, upośledzając detoksykację peroksydacji lipidów. Następczą akumulację toksycznych aldehydów można zaostrzać uszkodzenia oksydacyjne, wzmacniając apoptozę fotoreceptorów⁶.

Aldehyd dehydrogenaza 2 (ALDH2), mitochondrialny enzym zależny od NAD⁺, odgrywa krytyczną rolę w detoksykacji toksycznych aldehydów takich jak 4-hydroksy-2-nonenal (4-HNE) i malondialdehyd (MDA) poprzez przekształcanie ich w mniej reaktywne kwasy karboksylowe, zapobiegając w ten sposób uszkodzeniom oksydacyjnym⁷. Mocna aktywność ALDH2 jest niezbędna do utrzymania równowagi redoks, a upośledzona funkcja ALDH2 została powiązana z przyspieszonym starzeniem się i neurodegeneracyjnymi patologiami⁸. Farmakologiczne aktywowanie ALDH2, szczególnie poprzez małe cząsteczki agonistyczne Alda-1, wykazano, że wywierają efekty cytoprotekcyjne w różnych modelach^9,10. Sirtuina 1 (SIRT1), nikotynamidowa adenozynowa dinukleotyd + (NAD+)-zależna deacetylaza, reguluje reakcje na stres i metabolizm energetyczny poprzez modyfikowanie czynników transkrypcyjnych, w tym p53 i czynnika nuklearnego kappa B (NF-κB)¹¹. Aktywacja SIRT1 wskazuje na promocję funkcji mitochondrialnej i przeżycia komórki, a badania łączą jej nadregulację ze zmniejszonym uszkodzeniem oksydacyjnym i zapaleniem w zwyrodnieniu siatkówki¹². Stres siateczki śródplazmatycznej (ERS), wywołany akumulacją nieprawidłowo sfałdowanych białek, aktywuje niedojrzałą odpowiedź białkową (UPR), która może stać się kaskadą pro-apoptotyczną pod chronicznym stresem. ERS zostało powiązane ze zwyrodnieniem siatkówki, przyczyniając się do apoptozy fotoreceptorów¹³. Mimo tych ustaleń, szczególna współpraca pomiędzy ALDH2, SIRT1 i ERS w kontekście modelu zwyrodnienia siatkówki indukowanego MNU pozostaje słabo zrozumiana. Ponadto, zharmonizowane role tych powiązanych ścieżek wymagają dalszego systematycznego dochodzenia.

Dlatego obecne badanie miało na celu zbadanie wpływu kluczowych komponentów osi ALDH2-SIRT1-ERS—ALDH2 (poprzez Alda-1 lub Daidzin), SIRT1 (poprzez SRT1720 lub EX527) oraz ERS (poprzez 4-PBA lub TUN)—na uszkodzenia siatkówki indukowane MNU u myszy C57BL/6. Za pomocą analizy histopatologicznej i biochemicznej, zbadaliśmy, jak docelowanie tej osi wpłynęło na przeżycie fotoreceptorów i metabolizm aldehydów. Złożyliśmy hipotezę, że skoordynowana aktywność ALDH2, wzmocnienie SIRT1 i supresja ERS będą synergicznie łagodzić zwyrodnienie siatkówki indukowane MNU, dostarczając tym samym uzasadnienia dla docelowania tej osi w chorobach zwyrodnieniowych siatkówki.

Protokół

Oświadczenie etyczne
Wszystkie protokoły eksperymentalne zostały przeglądnięte i zatwierdzone przez Komitet ds. Opieki nad Zwierzętami Eksperymentalnymi i ich Użytkowania Uniwersytetu Medycznego w Fujian oraz przeprowadzone z należytą starannością zgodnie z Oświadczeniem Stowarzyszenia Badań nad Wizją i Okulistyką (ARVO) w sprawie stosowania zwierząt w badaniach okulistycznych i wizualnych.

Zwierzęta i przydział do grup
Łącznie 72 samców myszy C57BL/6 (w wieku 8–10 tygodni, waga ciała 20–25 g) uzyskane zostały od certyfikowanego dostawcy, zgodnie z krajowymi standardami hodowli zwierząt laboratoryjnych. Myszy były umieszczone w klatach z indywidualną wentylacją, w znormalizowanych warunkach środowiskowych, w tym 12-godzinnym cyklu światło/ciemność, kontrolowanej temperaturze (22 ± 2 °C) i wilgotności względnej (50 ± 10%), z dostępem do żywności i wody ad libitum. Aby zbadać modulacyjne efekty szlaków ALDH2, SIRT1 i ERS na uszkodzenia siatkówki wywołane przez MNU, myszy zostały losowo przydzielone do ośmiu grup eksperymentalnych (n = 9 na grupę; n = 5 dla grupy z drugiego dnia; n = 4 dla grupy z czwartego dnia) z wykorzystaniem sekwencji losowania wygenerowanej komputerowo w celu zminimalizowania błędu wyboru. Graficzny abstrakt badania został przedstawiony na Rysunku 1.

Przygotowanie reagentów i schematy leczenia
Reagenty eksperymentalne użyte w tym badaniu zostały wymienione w Tabeli Materiałów, z szczegółowymi informacjami dotyczącymi przygotowania i dawkowania, jak poniżej. (1) MNU (50 mg/kg): 100 mg MNU zostało rozpuszczone w 2 ml fizjologicznego roztworu soli, aby przygotować roztwór 50 mg/ml. Następnie 1,4 ml tego roztworu zostało rozcieńczone 5,6 ml fizjologicznego roztworu soli do stężenia końcowego 10 mg/ml do podawaniu zwierzętom. (2) Alda-1 (10 mg/kg): 50 mg proszku Alda-1 zostało rozpuszczone w 1 ml dimetylosulfonu (DMSO), aby przygotować roztwór 50 mg/ml, który został następnie rozcieńczony 24 ml fizjologicznego roztworu soli do stężenia końcowego 2 mg/ml. (3) Daidzin (10 mg/kg): 50 mg proszku Daidzin zostało rozpuszczone w 1 ml DMSO, aby przygotować roztwór 50 mg/ml, który następnie został rozcieńczony 24 ml fizjologicznego roztworu soli do stężenia końcowego 2 mg/ml. (4) EX-527 (10 mg/kg): 5 mg proszku EX-527 zostało rozpuszczone w 0,1 ml DMSO, aby przygotować roztwór 50 mg/ml, który został następnie rozcieńczony 2,4 ml fizjologicznego roztworu soli do stężenia końcowego 2 mg/ml. (5) SRT1720 (10 mg/kg): 5 mg proszku SRT1720 zostało rozpuszczone w 0,1 ml DMSO i dobrze wymieszane. Następnie dodano 400 μL PEG300, 50 μL Tween-80 i 450 μL fizjologicznego roztworu soli, aby przygotować roztwór roboczy o stężeniu 2 mg/ml. (6) TUN (10 mg/kg): 5 mg proszku TUN zostało rozpuszczone w 0,1 ml DMSO, aby przygotować roztwór 50 mg/ml, który następnie został rozcieńczony 2,4 ml fizjologicznego roztworu soli do stężenia końcowego 2 mg/ml. (7) 4-fenylobursztyn (4-PBA; 10 mg/kg): 2 mg proszku 4-PBA zostało rozpuszczone w 1 ml fizjologicznego roztworu soli, aby przygotować roztwór 2 mg/ml. Wszystkie powyższe objętości podawane były w 5 × M mililitrach (gdzie M = waga ciała zwierzęcia w kg). Następnie myszy zostały podzielone na osiem grup z następującymi protokołami leczenia:

Grupa kontrolna: Jednorazowe dootrzewnowe wstrzyknięcie fizjologicznego roztworu soli.
Grupa MNU: Jednorazowe dootrzewnowe wstrzyknięcie MNU.
Grupa MNU + Alda-1: Dootrzewnowe wstrzyknięcie Alda-1, następnie jednorazowe podanie MNU 2 godziny później. Alda-1 był następnie podawany dootrzewnowo raz dziennie.
Grupa MNU + Daidzin: Dootrzewnowe wstrzyknięcie Daidzin, następnie jednorazowe podanie MNU 2 godziny później. Daidzin był następnie podawany dootrzewnowo raz dziennie.
Grupa MNU + Alda-1 + EX-527: Dootrzewnowe wstrzyknięcie Alda-1, następnie wstrzyknięcie EX-527 1 godzinę później i wstrzyknięcie MNU 1 godzinę później (jednorazowe podanie). Alda-1 był następnie podawany dootrzewnowo raz dziennie.
Grupa MNU + Alda-1 + TUN: Dootrzewnowe wstrzyknięcie Alda-1, następnie wstrzyknięcie TUN 1 godzinę później i wstrzyknięcie MNU 1 godzinę później. Alda-1 był następnie podawany dootrzewnowo raz dziennie.
Grupa MNU + Daidzin + SRT1720: Dootrzewnowe wstrzyknięcie Daidzin, następnie wstrzyknięcie SRT1720 1 godzinę później i wstrzyknięcie MNU 1 godzinę później. Daidzin był następnie podawany dootrzewnowo raz dziennie.
Grupa MNU + Daidzin + 4-PBA: Dootrzewnowe wstrzyknięcie Daidzin, następnie wstrzyknięcie 4-PBA 1 godzinę później i wstrzyknięcie MNU 1 godzinę później. Daidzin był następnie podawany dootrzewnowo raz dziennie.

Monitorowanie

Wyniki

Zmiany masy ciała
Przed eksperymentem nie stwierdzono istotnych różnic w masie ciała między grupami. W drugi dzień po eksperymencie, z wyjątkiem grupy kontrolnej, która wykazała wzrost masy ciała z 17,0 ± 0,5 g do 17,4 ± 0,4 g, masa ciała myszy we wszystkich pozostałych grupach znacząco spadła. Konkretnie, masa ciała myszy w grupie MNU spadła z 17,4 ± 0,3 g do 16,2 ± 0,2 g, w grupie MNU + Alda-1 z 17,3 ± 0,3 g do 16,7 ± 0,4 g, w grupie MNU + Daidzin z 17,3 ± 0,3 g do 16,2 ± 0,3 g, w grupie MNU + Al...

Dyskusja

Poprzednie badania sugerowały, że agonisty ALDH2 mogą zapewnić efekt ochronny przed wywołaną MNU degeneracją siatkówki¹⁴. Jednak efekty interwencyjne jej inhibitora, wraz z potencjalnymi ścieżkami zależnymi, takimi jak SIRT1 i ERS, nie zostały jeszcze szczegółowo zbadane. Istnieją badania wskazujące na udział SIRT1 i ERS w modelach degeneracji siatkówki, w tym w degeneracji siatkówki wywołanej światłem i u myszy genetycznie zmodyfikowanych z degeneracją siatkówki^15,

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
4HNE Kit	Elabscience,China	E-EL-0128	Do pomiaru poziomów 4HNE w surowicy
4-Phenylbutyric acid (4-PBA)	MCE, US	HY-A0281	Czynnik do hamowania ERS
Alda-1	MCE, US	HY-18936	Aktywator ALDH2 do badań
Daidzin	MCE, US	HY-N0018	Inhibitor ALDH2 do badań
Fluorescein sodium	Guangzhou	N/A	Stosowane do  uzyskiwane za pomocą układu angiografii fluoresceinowej. Obrazy angiograficzne były analizowane pod kątem obecności jakiegokolwiek wycieku, nienaczynionych obszarów lub zmian w morfologii naczyń siatkówki.
ImageJ software	National Institutes of Health, USA	Wersja 1.53t
MDA Kit	Beyotime, China	S0131S	Do pomiaru poziomów MDA w surowicy
N-Nitroso-N-methylurea (MNU)	MCE, US	HY-34758	Środek alkylujący DNA do indukowania zwyrodnienia siatkówki
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich, US	30525-89-4	Stosowany do sekcji tkanki siatkówki
Precision digital scale	Electronic scale, China	SF-400	POJEMNOŚĆ: 5000 g & acute; 1 g/177ozX0.10z, używany do rejestracji masy ciała każdego myszy
Prism	GraphPad	Wersja 5.01	Oprogramowanie do analizy statystycznej
Rotary microtome	LEICA, Germany	RM2016	Stosowany do przygotowania sekcji siatkówki
Selisistat (EX-527)	MCE, US	HY-15452	Inhibitor SIRT1 do badań
Sodium Pentobarbital	Sigma-Aldrich, US	1.93248	Stosowany do znieczulenia na potrzeby późniejszych badań poprzez wstrzyknięcie dootrzewnowe (IP)
SRT1720	MCE, US	HY-10532	Aktywator SIRT1 do badań
Sumianxin	Jilin Shengda Animal Pharmaceutical Co	N/A	Stosowany do znieczulenia na potrzeby późniejszych badań poprzez wstrzyknięcie dootrzewnowe (IP)
Tunicamycin (TUN)	MCE, US	HY-A0098	Czynnik do indukcji ERS