Opis przypadku ropnia na czole spowodowanego przez Nocardia concava u pacjenta z AIDS

Podsumowanie

Przedstawiamy tutaj protokół dla zakażeń nokardią u pacjentów z obniżoną odpornością, który integruje hodowlę ropy i MALDI-TOF MS. To połączone podejście umożliwia szybkie i dokładne zidentyfikowanie gatunku, ułatwia ukierunkowaną terapię przeciwdrobnoustrojową i ostatecznie poprawia wyniki kliniczne w tej grupie pacjentów wysokiego ryzyka.

Streszczenie

Gatunki Nocardia to obligatoryjne aktinomycety tlenowe. Nokardioza ludzka zazwyczaj występuje u gospodarzy z obniżoną odpornością i najczęściej objawia się jako pierwotna nadokrwista infekcja płuc. Rozpuszczanie hematogenne może prowadzić do zaangażowania pozapłucnego, przy czym ośrodkowy układ nerwowy jest najczęstszym miejscem wtórnym, następnie skóra i podskórne tkanki miękkie; osierdzie, węzły chłonne i stawy są dotknięte tylko rzadko. 50-letni HIV-pozytywny mężczyzna został przyjęty z męczną historią pęcherzy z krwi doustnej i ekchymozami kończyn. Ropień prawego czoła, który powstał podczas hospitalizacji, wykazał ropę zidentyfikowaną jako Nocardia concava za pomocą laserowej desorpcji wspomaganej macierzowo/jonizacyjnej spektrometrii mas z czasem lotu (MALDI-TOF MS) i potwierdzoną sekwencjonowaniem genów 16S rRNA. Początkowe leczenie obejmowało terapię antyretrowirusową, ogólnoustrojowe glukokortykoidy oraz dożylne immunoglobuliny; Późniejsza ukierunkowana terapia przeciwdrobnoustrojowa linezolidem oraz trimetoprim-sulfametoksazolem, wprowadzona po potwierdzeniu mikrobiologicznym, przyniosła poprawę kliniczną i wyciek. Z naszej wiedzy jest to pierwszy przypadek zakażenia ropnia czoła spowodowanego przez N. concava u pacjenta z zespołem nabytego niedoboru odporności (AIDS). Zakażenia u ludzi wywołane przez ten organizm pozostają niezwykle rzadkie. Co więcej, miejscem zakażenia w tym przypadku nie był najczęściej dotknięty płuca ani ośrodkowy układ nerwowy, który zwykle uczestniczy w nocardiosis, co prowadziło do nietypowych objawów klinicznych podatnych na niezauważoną diagnozę lub błędną diagnozę. W tym przypadku precyzyjna identyfikacja etiologiczna pozwoliła na wczesną definitywną diagnozę i korzystne wyniki kliniczne. Ten przypadek podkreśla znaczenie zwiększonej czujności w przypadku rzadkich zakażeń Nocardia u pacjentów z ciężką osłabieniem odporności. W przypadku niewyjaśnionych ropni skóry i tkanek miękkich kluczowe jest wczesne badanie etiologiczne, a ukierunkowana terapia przeciwdrobnoustrojowa oparta na podatności na leki może znacząco poprawić rokowanie.

Wprowadzenie

Gatunki Nocardia to tlenowe aktinomycety szeroko rozpowszechnione w środowisku naturalnym, często zamieszkujące glebę i rozkładającą się materię organiczną. Chociaż są wszechobecne w naturze, zazwyczaj nie występują w ludzkim ciele i pełnią funkcję oportunistycznych patogenów. Większość zakażeń występuje przez wdychanie¹. Nokardioza dotyka głównie osoby immunosupresyjne, szczególnie te z osłabioną odpornością komórkową, takie jak pacjenci z nowotworami, cukrzycą, HIV/AIDS, chorobami autoimmunologicznymi, biorcami przeszczepów narządów stałych oraz osobami poddawanymi długotrwałej terapii kortykosteroidową². Niemniej jednak, infekcje mogą wystąpić także u osób bez widocznego niedoboru odporności³. Nocardia atakuje głównie przez drogi oddechowe, powodując choroby płuc, a następnie może rozprzestrzeniać się hematogennie, powodując zadziałanie narządów pozapłucnych. Mózg jest najczęstszym miejscem rozprzestrzeniania się, następnie skóra i tkanki miękkie podskórne; Rzadziej może dotyczyć osierdzia, węzłów chłonnych i stawów. Klinicznie nocardia może powodować ostre lub przewlekłe, miejscowe lub rozsiene gnojowe zapalenie ziarniniaste obejmujące płuca, skórę i ośrodkowy układ nerwowy⁴.

Do tej pory infekcje u ludzi wywołane przez N. concava były rzadko zgłaszane. Przedstawiamy tutaj pierwszy udokumentowany przypadek ropnia na czole u pacjenta HIV-dodatniego przypisywanego N. concava, dostarczając cennych informacji do diagnozy i leczenia nieodrostu.

Prezentacja przypadku:
50-letni pacjent został przyjęty do naszego szpitala z miesięczną historią pęcherzy krwi w jamie ustnej i purpurowych zmian na kończynach. Ponad dziesięć lat wcześniej zdiagnozowano u niego zakażenie HIV, ale nie stosował konsekwentnie terapii antyretrowirusowej. Około miesiąc przed przyjęciem rozwinęły się u niego krwiaki jamy ustnej i purpura kończyn bez wyraźnego wyzwalacza, a początkowo leczono go w lokalnym szpitalu Biktarvy (bictegravir/emtricitabina/tenofovir alafenamid) w leczeniu antyretrowirusowym. Na podstawie dalszych badań podejrzewano immunologiczną trombocytopenię (ITP), a pacjent otrzymał terapię pulsową metyloprednizolonem i dożylną immunoglobuliną (IVIG), wraz z ochroną żołądkową i suplementacją wapnia.

Z powodu utrzymującej się trombocytopenii pacjent został skierowany do naszej placówki w celu dalszego leczenia. Po przyjęciu jego temperatura ciała wynosiła 37,9 °C; Był czujny, zorientowany i w przyzwoitym stanie ogólnym. Nie zaobserwowano kości kłówki w skórze ani twardówce. Na całym ciele zaobserwowano rozległe wybroczyny i ekchymozy, a na prawym czołowym obszarze widoczna była wyczuwalna masa. Tomografia komputerowa klatki piersiowej bez kontrastu wykazała zmiany śródmiąższowe w dolnych płatach obu bocznych oraz rozedmę przyseptalną w płatach górnych. USG brzucha nie wykazało istotnych nieprawidłowości.

Badania laboratoryjne wykonane następnego dnia wykazały liczbę płytek krwi 12 × 10⁹/L (83–303 × 10⁹/L), poziom prokalcytoniny 0,11 ng/mL (<0,50 ng/mL) oraz wysokoczułe białko C-reaktywne (CRP) 1,11 mg/L (<6,00 mg/L). Bezwzględna liczba limfocytów pomocniczych/indukcyjnych T (CD3+, CD4+) wynosiła 15 komórek/μL (550–1440 komórek/μL). Ilościowe testy reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR) wykazały DNA wirusa Epsteina-Barr (EBV) o stężeniu 1,21 × 10⁴ IU/mL (0–200 IU/mL) oraz ludzkiego cytomegalowirusa (HCMV) na 4,53 × 10 5 IU/mL (0–200 IU/mL), oba pozytywne; Inne rutynowe badania krwi były bez większych uwag.

Biorąc pod uwagę potwierdzoną wirowiznę HCMV, pacjent został rozpoczęty terapią przeciwwirusową w połączeniu z ganciklowirem i foscarnetem, jednocześnie kontynuując Biktarvy w celu hamowania HIV. Dawka pulsowa metyloprednizolon i IVIG były utrzymywane dla ITP. Z powodu utrzymującej się niskiej gorączki, rytuksimab podano 6. dnia szpitala, a worikonazol rozpoczęto 7. dnia jako profilaktykę przeciwko kandyzie orofaryngealnej.

Po przyjęciu badanie fizykalne wykazało masę nad prawą częścią czołowej (Rysunek 1). W szóstym dniu szpitala z tej zmiany pobrano materię gnojną do oceny mikrobiologicznej. Bezpośrednie barwienie Gramem ropy wykazało obfite rozgałęzienia, nitkowate pałeczki Gram-dodatnie (Rysunek 2). Część okazu została zaszczepiona na płytkach agarowych z krwią Columbia i inkubowana w temperaturze 35 °C w atmosferze wzbogaconej o 5–10% CO₂. Po 24 godzinach inkubacji obserwowano białe, wypukłe, suche, pomarszczone, ziarniste, niehemolityczne kolonie. Do piątego dnia inkubacji kolonie rozwinęły jasnożółte zabarwienie (Rysunek 3). Zmodyfikowane kwasotrwałe barwienie izolatu dało częściowo kwasotrwałe, a częściowo niekwasotrwałe organizmy (Rysunek 4).

MALDI-TOF MS, korzystając z systemu Autobio MS2000, zidentyfikował organizm jako N. concava (rysunek 5). Identyfikacja ta została następnie potwierdzona sekwencjonowaniem genu 16S rRNA, które również sklasyfikowało izolat jako N. concava. Przeprowadzono testy podatności na środki przeciwdrobnoustrojowe, a wyniki podsumowano w Tabeli 1. Wyniki podatności, interpretowane zgodnie z wytycznymi CLSI M24 dla Nocardia spp., wskazywały na podatność na wszystkie testowane leki.

W 8. dniu szpitala, po wynikach laboratoryjnych obfitości Gram-dodatnich pałeczek, odstawiono vorikonazol i rozpoczęto terapię przeciwdrobnoustrojową z linezolidem i trimetoprim–sulfametoksazolem. Temperatura ciała pacjenta stopniowo się normalizowała, a postęp kliniczny był obserwowany. W dniu 18 szpitala pacjent został wypisany w poprawionym stanie, z receptami na doustny linezolid i metyloprednizolon w celu kontynuowania leczenia ambulatoryjnego.

Diagnoza, ocena i plan:
Pacjent ma AIDS z niską bezwzględną liczbą komórek pomocniczych T-helper/induktorów CD4+, co predysponuje do infekcji oportunistycznych. Wykrywalne DNA CMV i EBV wskazują na możliwą aktywną replikację cytomegalowirusa oraz wirusa Epsteina-Barr. Badanie fizykalne wykazało ropień prawego czoła oraz rozproszone wybroczyny/purpury. Ropa wydobywana z ropnia czoła dała kolonie zidentyfikowane jako N. concava przez MALDI-TOF MS.

Tomografia komputerowa klatki piersiowej wykazała obustronne zmiany śródmiąższowe dolnego płata; Wymagana jest kontrola kontrolna, aby wykluczyć nokardiozę płucną lub śródmiąższową chorobę płuc związaną z HIV/CMV. Ropień został nacięty i drenowany, opanowano trombocytopenię, a pacjent został wypisany na doustnym linezolidzie oraz trimetoprim–sulfametoksazolie na odczucie userca.

Monitorowanie po wypisie obejmuje cotygodniowe badanie morfologii oraz profile wątroby/nerek w celu monitorowania mielosupresji i zespołu zapalnego rekonstrukcji odporności; Natychmiastowa ponowna hospitalizacja jest wymagana w przypadku gorączki, nowych guzków, krwawienia lub objawów neurologicznych.

Protokół

Protokoły badania zostały zatwierdzone przez Komitet Etyki Medycznej Pierwszego Szpitala Afiliowanego Kolegium Medycznego Uniwersytetu Zhejiang. (Numer referencyjny: IIT20240874A).

1. Ocena pacjenta i wstępna ocena

1. Uzyskano kompleksową historię medyczną.
   1. Miesiąc przed wystąpieniem pacjent pojawiły się pęcherze z krwi w jamie ustnej i ekchymozy kończyn bez wyraźnych czynników wywołujących.
   2. Pacjent następnie szukał pomocy w lokalnym szpitalu, gdzie rozpoczęto terapię Biktarvy jako terapię antyretrowirusową i podano środki zakrzepoowe; niemniej jednak nie osiągnięto poprawy hematologicznej.
2. Podczas badania fizykalnego stwierdzono, że pacjent przebywał w stanie łagodnej gorączki. Na całej powierzchni ciała obserwowano rozproszone petechie i ekchymozy, a w prawej części czołowej obecna była dobrze określona masa.
3. Badania laboratoryjne
   1. Pełna morfologia krwi (enumeracja płytek krwi): Cała krew (3 mL) została pobrana do rurki zawierającej kwas etylendiaminetetraoctowy (EDTA), delikatnie odwrócona 8–10 razy i przeanalizowana w ciągu 4 godzin od flebotomii.
   2. Testy białka C-reaktywnego w surowicy i prokalcytoniny: Krew (2–3 mL) została pobrana do probówki separatora surowicy, pozostawiona do zakrzepnięcia przez 20–30 minut, odwirowana w dawce 1 500–2 000 × g przez 10 minut i przeanalizowana w dniu pobrania.
   3. Cytometryczna enumeracja podzbiorów limfocytów (CD3/4/8/16/19/45/56): Cała krew (3 mL) została pobrana do rurki EDTA, delikatnie odwrócona 8–10 razy w celu zapewnienia odpowiedniej antykoagulacji i przeanalizowana w ciągu 24 godzin od pobrania.
   4. Ilościowa reakcja łańcuchowa polimerazy (PCR) dla wirusa Epsteina–Barr i DNA cytomegalowirusa: Cała krew (3 mL) została pobrana do rurki EDTA, delikatnie odwrócona 8–10 razy, utrzymywana w temperaturze 2–8 °C i transportowana w ciągu 4 godzin od pobrania. Osocze było rozdzielane przez wirowanie w ciągu 2–4 godzin po flebotomii i przechowywane w temperaturze 4 °C do czasu analizy.

2. Procedury diagnostyczne

1. Aspiracja ropnia prawego czoła pod kontrolą ultrasonograficzną:
   1. Po standardowej dezynfekcji skóry i sterylnym zasłonięciu, podano miejscową infiltrację z udziałem lidokainy o stężeniu 2%. Pod kierunkiem ultrasonograficznym w czasie rzeczywistym do ropnia czoła wprowadzono strzykawkę o pojemności 20 ml z przymocowaną igłą, a następnie zasysano 4 mL ropnego płynu.
   2. Pacjent pozostał hemodynamicznie stabilny i nie zgłaszał dyskomfortu przez cały zabieg. W okresie po zabiegu nie zaobserwowano natychmiastowych komplikacji.
2. Purulentny aspirat został przekazany do laboratorium mikrobiologicznego w celu natychmiastowego barwienia Gram i późniejszej hodowli w 5–10% CO₂ w temperaturze 35 °C.
   1. W przypadku barwienia Gramem najpierw weź czystą szkiełkę, aby przygotować rozmaz bakteryjny, przytrzymaj go na płomieniu, następnie nałóż barwę crystal violet do pierwotnego barwienia przez 1 minutę, a następnie płukaj wodą.
   2. Następnie dodaj roztwór jodu jako żodę przez 1 minutę i spłuknij wodą. Następnie odbarwiaj etanolem 95% przez około 20–30 sekund, aż spływ stanie się bezbarwny, a następnie natychmiast spłukuj wodą, aby zapobiec odbarwieniu.
   3. Na koniec kontrum roztworem safraniny przez 30 sekund do 1 minuty, przepłucz wodą, wysusz i obserwuj pod mikroskopem.
3. Wybrano pętlę kolonii z płytki agarowej krwi, które poddano zmodyfikowanemu kwasotrwałemu barwieniu.
   1. W przypadku zmodyfikowanego kwasotrwałego barwienia najpierw weź czysty szkiełko, aby przygotować rozmaz bakteryjny, przykryj go na płomieniu, następnie przykryj rozmaz barwikiem Carbol Fuchsin i podgrzej, aż para uniesie się bez wrzenia, utrzymując przez 3–5 minut, a następnie płukaj wodą.
   2. Następnie wykonaj słabą dekoloryzację z 1% roztworem kwasu siarkowego przez 30 sekund do 1 minuty, aż rozmaz stanie się jasnoróżowy, i przepłuknij wodą.
   3. Na koniec kontrum roztworem błękitu etylenowego przez 30 sekund do 1 minuty, spłuknij wodą, wysusz i obserwuj pod mikroskopem.
4. Identyfikacja została przeprowadzona za pomocą zautomatyzowanego systemu identyfikacji mikroorganizmów spektrometrii mas, a izolat zidentyfikowano jako N. concava.
   1. Przygotowanie próbki
      1. Przygotowanie tarczy tarczowej: Pojedyncza czysta kolonia była zbierana bambusowym patykiem i równomiernie rozsmarowana na docelowym miejscu tarczy MALDI.
      2. Dodawanie kwasu mrówkowego: Po wyschnięciu rozmazu na powietrzu do każdego docelowego miejsca dodawano 1 μL kwasu mrówkowego do analizy komórek.
      3. Dodawanie matrycy: Po całkowitym wyschnięciu plamy na powietrzu natychmiast nakładano 1 μL roztworu matrycowego (α-cyjano-4-hydroksycynaminowy, HCCA), a płyta ponownie wyschła na powietrzu.
   2. Włącz i skonfiguruj oprogramowanie.
      1. Włącz zasilanie instrumentów, pompę próżniową i komputer, i poczekaj, aż próżnia osiągnie stan pracy. Uruchom oprogramowanie stacji roboczej i zaloguj się.
      2. Potwierdź normalną komunikację między oprogramowaniem a instrumentem oraz sprawdź, czy próżnia, temperatura i stan lasera są w normie.
   3. Wprowadź informacje w oprogramowaniu.
      1. Pojawia się moduł zarządzania płytami celu. Wybierz typ płyty docelowej, stwórz nową partię i wprowadź informacje o próbce, w tym identyfikator próbki, typ, źródło i uwagi.
      2. Zapisz informacje o tablicy docelowej i wybierz odpowiadającą mu bazę danych identyfikacyjnych do porównania.
   4. Obsługuj instrument i zbieraj dane.
      1. Włóż wysuszoną tarczę do komory instrumentów i zamknij drzwi komory. Wybierz w oprogramowaniu Run Target Plate i potwierdź ID oraz pozycję płyty celu.
         UWAGA: Oprogramowanie automatycznie realizuje wzbudzanie lasera, lot jonów, akwizycję sygnału oraz generowanie widma. Dostępne jest monitorowanie postępów pozyskiwania i jakości widma w czasie rzeczywistym.
   5. Analiza i identyfikacja danych
      1. Przetwarzanie widma: Oprogramowanie automatycznie wykonuje wygładzanie, korekcję bazy oraz ekstrakcję szczytów na surowym widmie.
      2. Porównanie baz danych: Przetworzone spektrum charakterystyczne szczytów jest porównywane ze standardową bazą danych znanych bakterii wbudowaną w instrument.
      3. Interpretacja wyników: Oprogramowanie dostarcza wyniki identyfikacji i oceny oparte na podobieństwie porównawczym. Zazwyczaj wynik ≥ 9,0 oznacza wiarygodną identyfikację na poziomie gatunku; wynik od 6,0 do 8,9 wskazuje na identyfikację na poziomie rodzaju; a wynik poniżej 6,0 jest uznawany za niewiarygodny.
      4. Raportowanie i zarządzanie danymi: Surowe widma, wyniki identyfikacji i logi są automatycznie zapisywane. Dane mogą być eksportowane, analizowane statystycznie i łączone z LIS.
   6. Procedura wyłączania
      1. Po wykonaniu wszystkich zadań opuść interfejs operacyjny. Wchodzę w tryb czuwania w oprogramowaniu, czekam na bezpieczne obniżenie ciśnienia przez urządzenie, zamykam oprogramowanie i komputer, a na końcu wyłączam zasilanie instrumentu i pompy próżniowej.
5. Testy podatności na leki przeciwdrobnoustrojowe
   1. Zbierać kolonie i mielić je prętem szlifierskim lub szklanymi kulkami w wodzie sterylnej, aby przygotować jednorodną zawiesinę, dostosowaną do normy mętności McFarlanda 0,5; ponieważ Nocardia ma tendencję do tworzenia grudek, konieczne jest dokładne szlifowanie, aby zapewnić równomierne zawieszenie.
   2. Następnie dodaj zawiesinę bakteryjną do każdego dołka płytki mikrorozcieńczeniowej zawierającej kationowo skorygowany bulion Mueller-Hinton (CAMHB), inokuluj 10 μL na dołek, aby uzyskać końcowe inokulum około 1 × 10⁵–5 × 10⁵ CFU/mL, jednocześnie przygotowując studnię kontrolującą wzrost bez antybiotyków oraz studnię kontrolną ujemną.
   3. Inkubuj mikropłytę w temperaturze 35 ±± 2°C w powietrzu przez 3–5 dni, utrzymując pokrywkę płytki zamkniętą podczas inkubacji, aby zapobiec wysychaniu.
   4. Po inkubacji obserwuj wzrost bakterii w każdej dołku gołym okiem i zapisuj najniższe stężenie leku, które całkowicie hamuje wzrost, jako minimalne stężenie hamujące (MIC).

3. Terapia antybiotykami

1. Natychmiast po przyjęciu rozpoczęto terapię kombinowaną przeciwwirusową i immunosupresyjną: podawano ganciklowir i foscarnet wraz z kontynuowaniem Biktarvy w celu hamowania HIV, a jednocześnie rozpoczęto terapię pulsową metyloprednizolonem i dożylną immunoglobuliną.
2. Dzień 6: Nawracająca niska gorączka spowodowała dodanie rituksimabu do terapii.
3. Dzień 7: Aby zapobiec możliwej inwazyjnej infekcji grzybiczej, rozpoczęto empiryczne przyjmowanie vorikonazolu.
4. Dzień 8: Mikroskopia wykazała obfitość pałeczek Gram-dodatnich; Voriconazol został odstawiony, a terapia przeciwdrobnoustrojowa została natychmiast przeniesiona na linezolid oraz trimetoprim-sulfametoksazol. Następnie nastąpiła defervescence, a stan kliniczny pacjenta stopniowo się poprawiał. Został wypisany 18. dnia szpitala w stanie stabilnym.

Wyniki

50-letni mężczyzna z HIV zachorował na uogólnione wybroczyny i ekchymozy oraz opryszczkę jamy ustnej. Po przyjęciu otrzymał empiryczne terapie przeciwwirusowe i trombopoetyczne. Badanie fizykalne wykazało guz na prawym czole. Wykonano aspirację pod kierunkiem ultrasonograficznym (Rysunek 1) w celu uzyskania ropy do badań laboratoryjnych. Wyniki barwienia gramowego pokazano na Rysunku 2, a wyniki barwienia kwasotrwałego na Rysunku 4....

Dyskusja

Nocardia to tlenowa, Gram-dodatnia bakteria klasyfikowana w ramach typu Actinobacteria, klasy Actinobacteria, podklasy Actinobacteridae, rzędu Actinomycetales, podrzędu Corynebacterineae, rodziny Nocardiaceae oraz rodzaju Nocardia¹⁵. Zidentyfikowano ponad 100 gatunków, z których najczęstszymi patogenami u ludzi i zwierząt są N. asteroides, N. brasiliensis, N. farcinica oraz N. cyriacigeorgica

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
5– 10% CO2 Inkubator	Thermo Fisher Scientific	20172416507
Kwasotrwała barwa	Baso	20170094
Seria Autof MS	Autobio Diagnostics	https://en.autobio.com.cn/Product/productDetail/fid/63/cid/2/id/145.html
Autof MS2000	Autobio Diagnostics	20182400196
Kwas mrówkowy	Autobio Diagnostics	20140009
Gram Stain	BioMé rieux	20171067
&alfa;-cyjano-4-hydroksycynamowa kwas	Autobio Diagnostics	20140009