Artykuł metodologiczny

Model kombinatoryczny myszy z zaburzeniem rytmu dobowego i stresem dietetycznym do badania przyspieszonej fizjopatologii starzenia się związanego z trybem życia

250 wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/70866

⸱

28 kwietnia 2026

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Chinese Materia Medica, Chengde Medical University, 2School of Pharmacy, Hebei Medical University, 3State Key Laboratory for Innovation and Transformation of Luobing Theory, 4College of Integrated Traditional Chinese and Western Medicine, Hebei University of Chinese Medicine, 5The Second Clinical Medical College, Heilongjiang University of Chinese Medicine

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Przedstawiamy tutaj protokół do ustanowienia modelu mysiego zaburzeń rytmu dobowego oraz diety wysokotłuszczowej i wysokocukrowej (HFHS), która naśladuje niezdrowy tryb życia i wywołuje zaburzenia metaboliczne oraz fenotypy starzenia.

Streszczenie

Celem tego protokołu jest ustanowienie standaryzowanego modelu mysiego, który na nowo odtwarza wieloczynnikowe uszkodzenia wywołane przez współczesne, niezdrowe styl życia. W tym celu opracowałeśmy nowy model C57BL/6J łączący randomizowane zakłócenia rytmu dobowego z dietą wysokotłuszczową i wysokocukrowa (HFHS), z pojedynczymi grupami HFHS i zakłóceń rytmu dobowego jako kontrolami. W porównaniu z kontrolami, złożony model wykazał poważniejsze zaburzenia metaboliczne, w tym wzrost masy ciała, podwyższone poziomy glukozy na czczo i lipidów oraz wyraźną steatozę wątroby, a także oczywiste upośledzenia poznawcze i motoryczne. Złożony model wykazywał również bardziej znaczące przyspieszone starzenie się, co potwierdził wskaźnik niedoborów i barwienie hematoksyliną i eozyną (HE). Ten zintegrowany model niezawodnie naśladuje związane ze stylem życia zaburzenia metaboliczno-poznawcze i przedwczesne starzenie się. Ten krokowy, powtarzalny protokół wspiera badania mechanizmu starzenia się związanego z stylem życia i ocenę ukierunkowanych strategii terapeutycznych.

Wprowadzenie

Przyspieszone współczesne tryby życia coraz częściej narażają populacje na zachowania zakłócające rytm i diety prowadzące do otyłości, przy czym przekonujące dowody łączą te czynniki z ogólnoustrojowym spadkiem funkcji i patogenezą przewlekłych chorób1. Dane epidemiologiczne ujawniają uderzające współistnienia chorób: pracownicy zmiany wykazują wysoką częstość występowania markerów zespołu metabolicznego, podczas gdy długotrwała dieta bogata w tłuszcze i cukry jest mocno związana ze zwiększonym ryzykiem demencją2,3. Te obrażenia łączą się, aby prowadzić do wieloorganowej patologii – zaburzenia metaboliczne często występują współcześnie z przyspieszonym spadkiem funkcji poznawczych i remodelacją układu krążenia, co pokazuje dwukierunkowy wpływ obwodowych i centralnych procesów pogorszenia stanu zdrowia. Pomimo rozpoznanych klinicznych synergii, standaryzowane modele przedkliniczne opisujące zintegrowaną patofizjologię spadku funkcji narządów indukowanego stylem życia pozostają słabo rozwinięte.

Na poziomie molekularnym przewlekłe niedopasowanie rytmu dobowego inicjuje patologiczną kaskadę rozpoczynającą się w jądrze nadchiazmatycznym, zakłócając przekaźnictwo glutamatu do przykomorowego podwzgórza i tępiąc pulsację hormonu uwalniającego kortykotropinę. To osłabia negatywne sprzężenie zwrotne osi podwzgórze-przysadka-nadnercza (HPA)4, powodując odurzenie receptorów glikokortykoidowych i utrzymaną podwyższoną stężenie kortyzol. Następnie aktywacja glukoneogenezy wątrobowej i tłumienie fosforylacji podłoża receptora insulinowego-1 w mięśniach szkieletowych razem prowadzą do obwodowego oporu na insulinę, stając się podstawą metaboliczną dla hiperglikemii i dyslipidemii5,6. Równocześnie dieta bogata w nasycone kwasy tłuszczowe przenika przez upośledzoną barierę krew-mózg poprzez downregulację białek szczelnych złączek śródkomórkowych śródbłonka7,8, aktywując sygnał TLR4/NF-κB w mikrogleju. To wyzwala neuroinflamację pośredniczoną przez TNF-α/IL-1β9. Kluczowym punktem jest fakt, że te dwa niezdrowe czynniki stylu życia nie działają niezależnie, lecz raczej synergicznie. Jednakże w obecnej literaturze nadal brakuje systematycznych badań nad ich łącznym wpływem. Dlatego warto przeprowadzić badania modelowe integrujące zaburzenie rytmu dobowego z dietą bogatą w tłuszcze i cukry jako złożone czynniki.

Mimo ich użyteczności w badaniu izolowanych mechanizmów starzenia się, obecne modele myszy nie radzą sobie z odtworzeniem zintegrowanej patofizjologii pogorszenia stanu zdrowia indukowanego stylem życia. Naturalne starzenie się wykazuje wyraźną zmienność międzyosobniczą i wymaga długich czasów niekompatybilnych z efektywnością eksperymentalną. Farmakologiczne środki takie jak doksorubicyna przede wszystkim wywołują uszkodzenia DNA i ostre starzenie się bez naśladowania przewlekłych zaburzeń metabolicznych10. Genetycznie zmodyfikowane modele skupiają się na pojedynczych szlakach molekularnych, zaniedbując systemową neuroendokrynno-metaboliczną komunikację11,12. Podawanie D-galaktozy, choć indukujące stres oksydacyjny, nieadekwatnie naśladuje wpływ zaburzeń rytmu dobowego na rytmizmiczność glikokortykoidów czy neuroinflamację pośredniczoną przez lipidy pokarmowe13. Krytycznie, interwencje jednoczynnikowe nie mogą uchwycić synergicznych wzorców wieloorganowego pogorszenia stanu zdrowia obserwowanych klinicznie. Ta luka translacyjna wymaga zaawansowanej platformy kombinacyjnej jednocześnie uwzględniającej przewlekłe zaburzenie rytmu dobowego i stresory pokarmowe prowadzące do otyłości, aby wiernie przyspieszyć współzależne neurodegenerację, zaburzenie czynności serca i upośledzenie metabolizmu.

Aby rozwiązać ten problem, opracowałeśmy model myszy C57BL/6J integrujący losowe zaburzenie rytmu dobowego z dietą bogatą w tłuszcze i cukry, aby naśladować synergiczne współczesne obrażenia stylu życia. Poddanie myszy do obrotowych harmonogramów świetlnych w połączeniu z długotrwałą dietą prowadzącą do otyłości spowodowało znacznie zaostrzone zaburzenia metaboliczne, w tym podwyższoną tkankę tłuszczową, hiperglikemię na czczo i dyslipidemię. Oceny poznawcze ujawniły wyraźne niedobory w pamięci przestrzennej i rozpoznawczej, podczas gdy testy ruchowe wskazywały na zmniejszoną wytrzymałość. Istotnie, długotrwała kwantifikacji wskaźnika słabości wykazała przyspieszone nagromadzenie deficytów związanych z wiekiem. Nasz paradygmat dwóch wyzwań więc zdecydowanie naśladuje wielowymiarowe przyspieszone starzenie się, zapewniając zweryfikowaną nową platformę do badania patofizjologii indukowanej stylem życia.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszystkie procedury eksperymentalne zostały zatwierdzone przez Komitet Etyczny ds. Badań na Zwierzętach Instytutu Badań Farmaceutycznych Hebei Yiling (Numer zgody: N2024043). Trzydzieści dwa 8-miesięczne samce myszy C57BL/6J (patrz Tabela materiałów) były trzymane w specjalnym, wolnym od patogenów (SPF) centrum badań zwierzęcych, związanym z Centrum Oceny Nowych Leków, Instytutem Badań Farmaceutycznych Hebei Yiling. Środowisko wychowu było utrzymywane w znormalizowanych warunkach: temperatura otoczenia waha się od 20–26 °C, wilgotność względna była kontrolowana na poziomie 40%–70%, a wdrożony był 12-godzinny cykl światło/ciemność. Myszy miały swobodny dostęp do standardowej laboratoryjnej diety dla gryzoni i sterylizowanej wody pitnej.

1. Ustanowienie kombinacyjnego modelu mysiego zaburzeń rytmu dobowego i stresu dietetycznego (Rysunek 1)

UWAGA: Zwierzęta, które zmarły nieoczekiwanie w czasie eksperymentu, wykazywały poważną utratę wagi lub nie ukończyły procedury modelowania, zostały wykluczone z ostatecznej analizy. Początkowa liczba zwierząt wynosiła 8 na grupę, a ostateczna ważna liczba prób wynosiła 5 na grupę.

  1. Przygotuj dietę wysoko tłuszczową/wysoko cukrowa (HFHS) (patrz Tabela materiałów) i niezależne pomieszczenie wyposażone w programowalny timer na elastyczną kontrolę cyklu światło-ciemność przed eksperymentem.
    UWAGA: Przechowuj dietę w temperaturze 4 °C lub -20 °C, aby zapobiec utlenianiu; przynieś ją do temperatury pokojowej przed użyciem, aby uniknąć skroplenia wpływającego na jej skład.
  2. Adaptacja zwierząt i losowa grupa
    1. Przechowuj wszystkie 8-miesięczne myszy w warunkach standardowych przez 7-dniowy okres adaptacyjnego karmienia przed rozpoczęciem eksperymentu.
    2. Losowo przydziel myszy do czterech grup na podstawie masy ciała (n = 8 na grupę) po okresie adaptacji: Grupa kontrolna, połączona grupa modelu stresu, grupa HFHS i grupa stresu zaburzenia rytmu dobowego (CR).
  3. Podaj 8-miesięczną interwencję diety HFHS w połączeniu z zaburzeniem rytmu dobowego do połączonej grupy modelu stresu. Karm grupę HFHS tylko dietą HFHS przez taki sam czas.
  4. Poddaj grupę CR tylko zaburzeniu rytmu dobowego. Karm grupę kontrolną standardową dietą utrzymującą przez cały czas eksperymentu. Zapewnij wszystkim zwierzętom wolny dostęp do wody pitnej.
    UWAGA: 8-miesięczna interwencja może być tymczasowo wstrzymana (np. na rutynowe kontrole zdrowia myszy) bez wpływu na wynik eksperymentu, a interwencja może być wznowiona po zakończeniu kontroli.
  5. Protokół zaburzenia rytmu dobowego (Rysunek 2A,B)
    1. Użyj programowalnego timera (patrz Tabela materiałów), aby elastycznie kontrolować tygodniowy cykl światło-ciemność. Zastosuj cztery różne reżimy świetlne: szybkie przełączanie światła-ciemność (naprzemienne światło i ciemność co 7 min przez 2 kolejne godziny dziennie), odwrócony cykl światło-ciemność (gaszenie światła o 8:00 i włączenie o 20:00 codziennie), ciągłe światło (24-godzinny blask) i ciągła ciemność (24-godzinna ciemność).
    2. Wygeneruj losową sekwencję za pomocą oprogramowania statystycznego (język R, z ustalonym losowym ziarnem) na początku każdego tygodnia. Losowo przypisz cztery tryby świetlne do każdego dnia tygodnia, aby upewnić się, że każdy tryb jest stosowany z rzędu przez 1-2 dni.
  6. Podawaj myszom dietę HFHS ad libitum i monitoruj spożycie pokarmu co tydzień. Szczegółowy skład diety HFHS przedstawiono w Tabeli 1.
    UWAGA: Konieczne jest inspekcjonowanie zapasów żywności, aby zapobiec niedożywieniu lub pozbawieniu pokarmu.
  7. Waż myszy co tydzień w ustalona porę (9:00 w czwartek) za pomocą elektronikicznej wagi podczas 8-miesięcznego okresu interwencji. Dokładnie rejestruj wszystkie dane dotyczące masy ciała.
    UWAGA: Proces ważenia należy wykonać szybko (każda sesja zakończona w mniej niż 30 s), aby zminimalizować stres i zakłócenie rytmu dobowego.

2. Nowa rekognicja obiektu

  1. Umieść myszy w pudełku testowym o wymiarach 60 cm x 60 cm x 40 cm na jeden dzień przed treningiem i pozwól im swobodnie eksplorować przez 5 minut, aby przyzwyczaić się do środowiska testowego.
    UWAGA: Usuń kał i mocz z pudełka po każdej próbie. Wytrzyj pudełko 75% alkoholem, aby wyeliminować resztkowe zapachy.
  2. Umieść dwa identyczne cylindry (A i B) w lewym dolnym i prawym dolnym rogu pudełka testowego. Wprowadź każdą mysz do pudełka, zwróconą plecami do obiektów i pozwól myszy swobodnie eksplorować

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Synergistyczne zaostrzenie patologii metabolicznej w kohortach poddanych podwójnej ekspozycji
Podłużne monitorowanie masy ciała ujawniło odmienne trajektorie wzrostu pomiędzy kohortami. Grupa modelowa oraz grupa HFHS wykazały przyspieszoną przyrost mas ciała w porównaniu zarówno z grupą kontrolną (Control), jak i grupą CR. Co istotne, grupa CR wykazała niewielkie przyspieszenie w stosunku do grupy Control (Rysunek 3A). Dalsze dowody na dysfunkcję metaboliczną dostarczył ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Współczesne badania jednoznacznie potwierdziły, że zaburzenie rytmu dobowego i dieta wysokokaloryczna, bogata w tłuszcze i cukry, są dwoma niezależnymi czynnikami powodującymi ogólnoustrojowe obniżenie funkcji organizmu. Nasze dane pokazują, że patologiczne uszkodzenia wywołane łącznym działaniem tych dwóch czynników są znacznie poważniejsze niż prosty dodatkowy efekt każdego z nich osobno. W porównaniu z grupami interwencji jednoczynnikowych, grupa modelu złożonego nie wykazała istotnych różnic w dotyczących otyłości wz...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Praca ta była wspierana przez Program Nauki i Technologii Hebei (246W2501D, 252W7716D), Program S&T Hebei (24462501D) oraz Yanzhao Golden Platform (A20240022).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
ANY-mazeScienceSA225
Accu-Chek Active Blood Glucose MonitorSwitzerland, Roche Diagnosticsaccu check active
C75BL/6J miceBEIJING HFK BIOSCIENCE CO.,LTDNo.110324241101250228
Grip strength meterUSA, Columbus Instruments1027CSM-E54
High-fat and high-sucrose dietChina, Xietong Biotechnology Co., Ltd.XT303
HistoCore MULTICUT - Semi-Automated Rotary MicrotomeGermany, LeicaRM2245
Oil Red O solutionChina, Wuhan Servicebio Technology Co., Ltd.G1260
Optimal cutting temperature compoundJapan, Sakura4583
Programmable Timer SocketChina, GONEOGND-1
Tissue Tech Prisma PlusJapan, Sakura20B2X00014000034
Tissue-Tek TEC 6 Embedding ModuleJapan, SakuraM01-021E-02
Total Cholesterol (TC) Assay KitChina, Suzhou Grace Biotechnology Co., Ltd.G0909W

Bibliografia

  1. Wang, F., et al. Meta-analysis on night shift work and risk of metabolic syndrome. Obes Rev. 15, 709-720 (2014).
  2. Zhang, S., et al. Associations of sugar intake, high-sugar dietary pattern, and the risk of dementia: a prospective cohort study of 210,832 participants. BMC Med. 22, 298 (2024).
  3. Yeomans, M. R., Armitage, R., Atkinson, R., Francis, H., Stevenson, R. J. Habitual intake of fat and sugar is associated with poorer memory and greater impulsivity in humans. PLoS One. 18, e0290308 (2023).
  4. Sharma, V. K., Singh, T. G. Chronic stress and diabetes mellitus: Interwoven pathologies. Curr Diabetes Rev. 16, 546-556 (2020).
  5. Kaikaew, K., Steenbergen, J., van Dijk, T. H., Grefhorst, A., Visser, J. A. Sex difference in corticosterone-induced insulin resistance in mice. Endocrinology. 160, 2367-2387 (2019).
  6. Guillaume-Gentil, C., Assimacopoulos-Jeannet, F., Jeanrenaud, B. Involvement of non-esterified fatty acid oxidation in glucocorticoid-induced peripheral insulin resistance in vivo in rats. Diabetologia. 36, 899-906 (1993).
  7. Gori, M., et al. Palmitic acid affects intestinal epithelial barrier integrity and permeability in vitro. Antioxidants (Basel). 9 (5), 417 (2020).
  8. Dong, Q., et al. Effects of Tremella fuciformis polysaccharides on intestinal barrier and its functional mechanism. Mycosystema. 44 (03), 104-113 (2025).
  9. Velloso, L. A., Folli, F., Saad, M. J. TLR4 at the crossroads of nutrients, gut microbiota, and metabolic inflammation. Endocr Rev. 36, 245-271 (2015).
  10. Marques, M., et al. Doxorubicin induces a senescent phenotype in murine and human astrocytes. J Neurochem. 169, e70177 (2025).
  11. Krüger, P., et al. Inflammation and fibrosis in progeria: Organ-specific responses in an HGPS mouse model. Int J Mol Sci. 25 (17), 9323 (2024).
  12. Cristòfol, R., et al. Neurons from senescence-accelerated SAMP8 mice are protected against frailty by the sirtuin 1 promoting agents melatonin and resveratrol. J Pineal Res. 52, 271-281 (2012).
  13. Azman, K. F., Safdar, A., Zakaria, R. D-galactose-induced liver aging model: Its underlying mechanisms and potential therapeutic interventions. Exp Gerontol. 150, 111372 (2021).
  14. Takeshita, H., et al. Modified forelimb grip strength test detects aging-associated physiological decline in skeletal muscle function in male mice. Sci Rep. 7, 42323 (2017).
  15. Whitehead, J. C., et al. A clinical frailty index in aging mice: comparisons with frailty index data in humans. J Gerontol A Biol Sci Med Sci. 69, 621-632 (2014).
  16. Feridooni, H. A., Sun, M. H., Rockwood, K., Howlett, S. E. Reliability of a frailty index based on the clinical assessment of health deficits in male C57BL/6J mice. J Gerontol A Biol Sci Med Sci. 70, 686-693 (2015).
  17. Zhang, Y., Chu, J. M., Wong, G. T. Cerebral glutamate regulation and receptor changes in perioperative neuroinflammation and cognitive dysfunction. Biomolecules. 12 (4), 597 (2022).
  18. Fujiwara, M., Ferdousi, F., Isoda, H. Investigation into molecular brain aging in senescence-accelerated mouse (SAM) model employing whole transcriptomic analysis in search of potential molecular targets for therapeutic interventions. Int J Mol Sci. 24 (18), 13867 (2023).
  19. Ong, J., et al. Senescence accelerated mouse-prone 8: a model of neuroinflammation and aging with features of sporadic Alzheimer's disease. Stem Cells. 43 (2), sxae091 (2025).
  20. Linders, A. N., et al. A review of the pathophysiological mechanisms of doxorubicin-induced cardiotoxicity and aging. NPJ Aging. 10, 9 (2024).
  21. Sadigh-Eteghad, S., et al. D-galactose-induced brain ageing model: A systematic review and meta-analysis on cognitive outcomes and oxidative stress indices. PLoS One. 12, e0184122 (2017).
  22. Kohsaka, A., et al. High-fat diet disrupts behavioral and molecular circadian rhythms in mice. Cell Metab. 6, 414-421 (2007).
  23. Morris, C. J., Purvis, T. E., Hu, K., Scheer, F. A. Circadian misalignment increases cardiovascular disease risk factors in humans. Proc Natl Acad Sci U S A. 113, E1402-E1411 (2016).
  24. Latimer, M. N., Rhoads, M. K., Reynolds, L. D., Pollock, D. M. Chronic circadian stress impairs blood pressure and sodium homeostasis in a diet- and sex-specific manner. Am J Physiol Renal Physiol. 330, F186-F198 (2026).
  25. Joo, J., et al. The acute effects of time-of-day-dependent high fat feeding on whole body metabolic flexibility in mice. Int J Obes (Lond). 40, 1444-1451 (2016).
  26. Pati, P., et al. Time-restricted feeding reduces cardiovascular disease risk in obese mice. JCI Insight. 10 (4), e160257 (2025).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

dieta wysokot uszczowadieta wysokocukrowazaburzenia metaboliczneupo ledzenie poznawczest uszczenie w trobywska nik krucho ci

Powiązane artykuły