Identyfikacja genów kluczowych, polimorfizmów jednonukleotydowych i potencjalnych celów leków w raku piersi za pomocą analizy transkryptomowej

Summary

Niniejsze badanie dotyczyło genów związanych z mitochondrialnym stresem oksydacyjnym, powiązanych z opornością na leczenie w raku piersi HER2-dodatnim. Wykorzystując zestawy danych transkryptomowych, zintegrowaną bioinformatykę i dane kliniczne (n = 4 929), autorzy zidentyfikowali MTHFD2 i PRDX3 jako kluczowe geny o zróżnicowanej ekspresji o potencjalnej wartości prognostycznej. In silico. analizy sugerują funkcjonalne efekty wariantów genetycznych.

Abstract

Rak piersi HER2-dodatni (HER2⁺) często rozwija oporność na terapie takie jak Lapatinib, potencjalnie związane z przeprogramowaniem mitochondrialnego metabolizmu i redoksu. Badanie to miało na celu zidentyfikowanie genów związanych z mitochondrialnym stresem oksydacyjnym (MOS-DEGs) jako biomarkerów oporności oraz scharakteryzowanie ich funkcjonalnych nsSNP i wpływów strukturalnych. Zestawy danych RNA-seq (GSE231524, GSE231525) zostały przeanalizowane za pomocą DESeq2 w celu zidentyfikowania DEGs, które zostały przecięte z genami mitochondrialnego stresu oksydacyjnego, aby uzyskać MOS-DEGs. Wykonano analizę wzbogacenia funkcjonalnego, analizę PPI, analizę ROC, profilowanie ekspresji i analizę przeżycia. nsSNPs zostały oceniane za pomocą wielu narzędzi predykcyjnych, a wpływy strukturalne oceniane były poprzez modelowanie wtórnej i 3D. Zintegrowana analiza transkryptomowa i kliniczna zidentyfikowała MTHFD2 i PRDX3 jako centralne MOS-DEGs wykazujące przeciwne role regulacyjne w mitochondrialnym metabolizmie redoksowym. MTHFD2 był znacząco nadmiernie eksprymowany i kojarzony z złym rokowaniem (HR = 1,53, p = 1,1 × 10⁻¹⁶), podczas gdy PRDX3 wykazywał ochronne wzorce ekspresji (HR = 0,73, p = 7,7×10⁻¹⁰). Analiza ROC sugerowała ich potencjał jako predyktory odpowiedzi terapeutycznej. Analiza nsSNP ujawniła pięć szkodliwych wariantów w MTHFD2 i cztery szkodliwe warianty w PRDX3, z rs1471336772 (MTHFD2) i rs747786383 (PRDX3) zidentyfikowanymi jako najbardziej patogenne. Te warianty były przewidywane jako szkodliwe na podstawie wielu systemów punktacji komputerowych, w tym SIFT ≤ 0,05, PolyPhen-2 ≥ 0,85, szkodliwe wyniki CADD i wysokie wyniki REVEL, i znajdowały się w domenach katalizycznych lub aktywnych redoksowo. Modelowanie strukturalne sugerowało, że te substytucje mogą destabilizaować konformację, zakłócać miejsca wiązania metali i kofaktorów oraz wpływać na regenerację NADPH lub aktywność peroksydazy zależną od tioredoksyny. Predykcje dynamiki molekularnej wskazywały na potencjalną utratę stabilności strukturalnej i zmienioną elastyczność, sugerując możliwe upośledzenie funkcji kontroli redoksowej mitochondrialnej. To badanie identyfikuje MTHFD2 i PRDX3 jako regulatorów mitochondrialnego stresu oksydacyjnego w raku piersi HER2⁺. Szkodliwe nsSNP w tych genach mogą przyczyniać się do zmiany równowagi redoksowej, potencjalnie wpływając na adaptację metaboliczną (MTHFD2) i obronę przeciwutleniaczkową (PRDX3).

Introduction

Rak piersi jest najczęściej diagnozowaną postacią raka u kobiet na całym świecie i główną przyczyną zgonów związanych z rakiem, pomimo znacznego postępu w wczesnym wykrywaniu i stosowaniu leczenia ukierunkowanego^1,2,3. Różnorodność molekularna w obrębie guzów piersi leży u podstaw zróżnicowanego przebiegu klinicznego i reakcji na leczenie, co stanowi ciągle obecne wyzwania dla precyzyjnej onkologii^4,5. Wśród rozpoznanych podtypów molekularnych rak piersi z przewlekłym nadmiernym ekspresją receptora 2 dla ludzkiego czynnika wzrostu naskórka (HER2) stanowi około 15–20% wszystkich przypadków raka piersi i charakteryzuje się amplifikacją genu HER2 oraz nadmierną ekspresją kinazy tyrozynowej receptora HER2^6,7. Chociaż leki ukierunkowane na HER2, takie jak trastuzumab i lapatinib, znacznie poprawiły rokowanie pacjentów, często pojawia się oporność pierwotna i nabyta na te leki, co prowadzi do nawrotu guza i progresji choroby^8,9. Zrozumienie mechanizmów molekularnych leżących u podstawy oporności na terapię HER2 jest zatem nadal głównym niezabezpieczonym potrzebom w klinicznej onkologii.

Nowe dowody sugerują, że dysfunkcja mitochondriów i stres oksydacyjny odgrywają krytyczną rolę w mediacji oporu na leczenie w raku piersi. Mitochondria, oprócz swojej kanonicznej roli w produkcji ATP, są kluczowymi regulatorami apoptozy, sygnalizacji redoks i plastistyczności metabolicznej—wszystkie procesy, które komórki nowotworowe wykorzystują do przetrwania pod presją terapeutyczną. W szczególności odporne komórki nowotworowe HER2⁺ wykazują przemianę metaboliczną ku fosforylacji utlennej (OXPHOS), zwiększone buforowanie reaktywnych form tlenu (ROS) i zmienioną biogenezę mitochondriów. Te adaptacje pozwalają komórkom na utrzymanie sygnalizacji przetrwania i uniknięcie apoptozy pomimo trwałego hamowania szlaków sygnalizacyjnych HER2. Geny kodujące podjednostki kompleksów mitochondrialnych i enzymy regulujące redoks są zatem potencjalnymi biomarkerami i celami terapeutycznymi do pokonania oporu.

Równolegle, niesynonimiczne polimorfizmy pojedynczego nukleotydu (nsSNPs) w genach związanych z mitochondriami lub stresem oksydacyjnym mogą modyfikować strukturę i funkcję białek, wpływając na aktywność enzymów, reakcję na leki i podatność na chorobę¹⁰. Predykcja komputerowa szkodliwych skutków nsSNPs przy użyciu narzędzi in silico takich jak SIFT, PolyPhen-2 i CADD zapewnia szybki sposób identyfikacji funkcjonalnych wariantów, które mogą przyczyniać się do heterogeniczności nowotworu i oporu na leczenie. Integracja danych transkryptomowych i mutacyjnych oferuje zatem wielowymiarowy widok dysregulacji genów i zmian strukturalnych na poziomie transkrypcyjnym i genomowym.

Ostatnie postęp w bioinformatyce i biologii systemowej umożliwiły wysoko przepustowe identyfikowanie potencjalnych genów sterujących poprzez dużo skalową analizę ekspresji i analizę opartą na sieci. Publiczne repozytoria takie jak Gene Expression Omnibus (GEO) dostarczają cennych zestawów danych sekwencjonowania RNA, które uchwytują zmiany molekularne w różnych modelach eksperymentalnych i kohortach pacjentów. W połączeniu z narzędziami analitycznymi takimi jak DESeq2, clusterProfiler i analiza sieci STRING–Cytoscape, zasoby te umożliwiają kompleksową charakteryzację różnicowej ekspresji genów (DEGs), wzbogacania szlaków i odkrywania genów centralnych. Co ważne, integracja sygnatur genów stresu oksydacyjnego mitochondrialnego z DEGs może wyjaśnić nowe mechanizmy molekularne leżące u podstawy oporu na terapię ukierunkowaną na HER2 i zidentyfikować kandydatów na biomarkery do interwencji terapeutycznej.

Oś odporności napędzana przez HER3 ostatnio zyskała uwagę jako główna ścieżka kompensacyjna po hamowaniu HER2. Aktywacja HER3 przywraca sygnalizację PI3K/AKT w dół strumieni, promując przetrwanie komórkowe i tolerancję na leki (Rysunek 1). DUSP6 (Dual Specificity Phosphatase 6), negatywny regulator sygnalizacji ERK, jest zaangażowany w modulacje tej adaptacyjnej odpowiedzi. Hamowanie DUSP6 ponownie aktywuje sygnalizację ERK i może przeciwdziałać oporowi pośredniczonemu przez HER3, ale jego współpraca ze stresem oksydacyjnym mitochondrialnym i adaptacją metaboliczną pozostaje niedostatecznie zrozumiana. Dlatego porównawcza analiza transkryptomowa linii komórek HER2⁺ (BT474 i MDA-MB-453) pod hamowaniem DUSP6 i przewlekłym narażeniem na lapatinib oferuje idealny model do analizy determinant molekularnych oporu na leki.

Rysunek 1. Schematyczne przedstawienie struktury molekularnej łączącej dysfunkcję mitochondrialną, stres oksydacyjny i progresję raka piersi. Te zintegrowane mechanizmy molekularne leżące u podstawy onkogenezy pośredniczonej przez stres oksydacyjny mitochondrialny w raku piersi. Dysregulacja kompleksów łańcucha transportu elektronów mitochondrialnych, w szczególności zaangaż

Protocol

Pobieranie danych i przetwarzanie wstępne

Badanie to przeprowadzono z wykorzystaniem publicznie dostępnych danych transkryptomowych i genetycznych; bezpośrednio nie były zaangażowane żadne ludzkie ani zwierzęce podmioty badań. Zestawy danych transkryptomowych dotyczące oporu na terapię raka piersi HER2⁺ pobrane zostały z bazy danych NCBI Gene Expression Omnibus (GEO) (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)¹¹. Dwa zestawy danych RNA-seq, GSE231524 i GSE231525, zostały wybrane ze względu na ich specyficzne skupienie się na oporze wywołanym przez HER3 i hamowanie DUSP6 w liniach komórek raka piersi HER2+ (BT474 i MDA-MB-453). Te zestawy danych zawierały fenotypy macierzyste, tolerujące leki i oporność na leki pochodzące z ekspozycji na Lapatinib (1 µM) i wyciszeniu DUSP6. Surowe macierze liczbowe i odpowiednie pliki metadanych zostały udostępnione za pomocą pakietów GEOquery (v2.70.0) i Biobase (v2.62.0) w RStudio (v4.3.2)¹². Metadane zostały skrupulatnie skatalogowane w celu zdefiniowania dwóch głównych kontrastów dla każdego zestawu danych: GSE231524 porównywał kontrolę (BT474 macierzysty, Dzień 0) z próbkami tolerującymi leki i odpornymi na leki (Dzień 9–Miesiąc 9), podczas gdy GSE231525 porównywał kontrolę (Scrambled siRNA) z wyciszeniem DUSP6 (DUSP6-KD). Kontrolę jakości i normalizację danych przeprowadzono przy użyciu ramówki DESeq2 (v1.42.0), która stosuje transformację stabilizującą wariancję (VST) w celu zmniejszenia heteroscedasticzności i zapewnienia porównywalności między próbkami. Rozkład danych i wzorce klasteryzacji zostały wizualnie oszacowane za pomocą ggplot2 (v3.5.0) i pheatmap (v1.0.12) w celu potwierdzenia jednolitości danych i zidentyfikowania potencjalnych wartości odchylonych przed analizą różnicowej ekspresji genów^13,14.

W niniejszym badaniu utrzymano wyraźne rozróżnienie między wynikami uzyskanymi z zestawów danych transkryptomowych linii komórkowych a wynikami uzyskanymi z danych klinicznych pochodzących od pacjentów. Dane z linii komórkowych były głównie wykorzystywane do analizy eksploracyjnej, w tym identyfikacji genów o zróżnicowanej ekspresji i generowania wstępnych wniosków mechanistycznych w kontrolowanych modelach eksperymentalnych. Z kolei dane pochodzące od pacjentów były wykorzystywane do zewnętrznej walidacji wzorców ekspresji genów i oceny istotności klinicznej, w tym oceny prognostycznej. W związku z tym wyniki z modeli linii komórkowych i kohortach klinicznych są interpretowane osobno, aby uniknąć nadmiernego uogólniania i zapewnić odpowiedni kontekst translacyjny dla wszystkich wyników.

Analiza różnicowej ekspresji genów

Analiza różnicowej ekspresji została przeprowadzona w celu zidentyfikowania genów, które były istotnie modulowane między warunkami kontrolnymi a traktowanymi. Znormalizowane liczby zostały przetworzone przy użyciu modelu regresji dostosowanej (ARM) zintegrowanego z DESeq2, aby dokładnie oszacować zmiany wartości logarytmicznych i istotność statystyczną. Formuła projektu została zdefiniowana jako ~condition, reprezentująca grupy kontrolne i traktowane. Geny o dostosowanym p-value (FDR) < 0,05 i bezwzględnej zmianie wartości logarytmicznych ≥ 1 były uważane za istotnie różnicująco eksprazowane. Skrócenie zmian wartości logarytmicznych zostało przeprowadzone za pomocą metody apeglm w celu zwiększenia niezawodności oszacowania wielkości efektu. Wyniki analizy zostały wizualizowane za pomocą EnhancedVolcano (v1.22.0)¹⁵ i ggplot2¹⁶, które generowały wykresy wulkaniczne i wykresy MA przedstawiające relację między wielkością ekspresji a pewnością statystyczną. Estymacje dyspersji zostały również oceniane w ramach DESeq2, aby zapewnić dokładne modelowanie wariancji i spójną normalizację między replikowanymi próbkami biologicznymi¹⁷.

Pobieranie i identyfikacja genów o zróżnicowanej ekspresji związanych ze stresem oksydacyjnym mitochondrialnym (MOS-DEGs)

Aby zbadać związek między metabolizmem energetycznym, stresem oksydacyjnym i opornością na leki, skompilowaną listę genów związanych z mitochondriami i stresem oksydacyjnym uzyskano z wielu baz danych, w tym Human MitoCarta3.0¹⁸ (https://personal.broadinstitute.org/scalvo/MitoCarta3.0/human.mitocarta3.0.html), Gene Ontology (GO:0006979, odpowiedź na stres oksydacyjny) (http://geneontology.org/), Encyklopedia Genów i Genomów Kyoto (KEGG) ścieżka fosforylacji oksydacyjnej (https://www.genome.jp/kegg/) i Human Oxidative Stress Gene Database (HOSGDB) (http://hosgdb.com/). Wszystkie pozyskane geny zostały standaryzowane do zatwierdzonych symboli genów HGNC za pomocą org.Hs.eg.db (v3.18.0) i AnnotationDbi (v1.64.0), podczas gdy duplikaty, pseudogeny i niekodujące RNA zostały usunięte w celu zapewnienia dokładności adnotacji. Powstały kuratowany panel genów mitochondrialnego

Results

Analiza różnicowej ekspresji genów

Profilowanie różnicowej ekspresji zostało przeprowadzone w celu zbadania zmian transkrypcyjnych związanych z progresją i opornością na terapię raka piersi HER2+ przy użyciu dwóch niezależnych zestawów danych RNA-seq, GSE231524 i GSE231525. W pierwszym zestawie danych (GSE231524) początkowo zliczono 19 727 genów. Po normalizacji, filtrowaniu i zastosowaniu skorygowanych modeli regresji (ARM) do różnicowej ekspresji, 6 604 geny zostały zachowan...

Discussion

Stres oksydacyjny mitochondriów jest charakterystyczną cechą adaptacji nowotworowej, która wpływa na przeżywalność komórek, ich plastyczność metaboliczną oraz oporność na terapię. Niniejsze badanie systematycznie zbadano mitochondrialny stres oksydacyjny – powiązane z różnicowo ekspresowanymi genami (MOS-DEGs) w raku piersi HER2⁺, integrując dane transkryptomowe, analizy wzbogacenia funkcjonalnego, walidację kliniczną oraz szczegółowe analizy mutacyjne i strukturalne in silico. Integracja różnicowanej...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
AnnotationDbi	Bioconductor	v1.64.0	Pakiet do analizy danych R służący do standaryzacji i adnotacji symboli genów HGNC.
apeglm	Bioconductor	metoda w DESeq2	Metoda stosowana do redukcji zmian w skali log2 w analizie różnicowej ekspresji.
Biobase	Bioconductor	v2.62.0	Pakiet R służący dostępu i zarządzania obiektami ekspresji i metadanych pochodzącymi z GEO.
CADD	University of Washington / Kircher Lab	narzędzie internetowe	Zintegrowana liczba Combined Annotation Dependent Depletion stosowana do przewidywania patogenności nsSNP.
clusterProfiler	Bioconductor	v4.8.1	Pakiet R służący do analizy wzbogacenia GO i KEGG.
ComplexHeatmap	Bioconductor	v2.18.0	Pakiet R służący do generowania wykresów heatmap i klastrowania ekspresji.
Cytoscape	Cytoscape Consortium	oprogramowanie	Platforma wizualizacji sieci używana w sieciach PPI pochodzących z STRING oraz priorytetyzacji CytoHubba.
dbSNP	NCBI	baza danych	Baza danych wariantów populacyjnych służąca do walidacji nsSNP.
DESeq2	Bioconductor	v1.42.0	Pakiet R służący do normalizacji, modelowania wariancji i analizy różnicowej ekspresji.
dplyr	CRAN / tidyverse	v1.1.3	Pakiet R służący do manipulacji danymi i przekroju zbiorów genów.
DynaMut	University of Melbourne / BioSig	serwer internetowy	Narzędzie służące do estymacji zmian w stabilności i elastyczności białek związanych z mutacjami.
EnhancedVolcano	Bioconductor	v1.22.0	Pakiet R służący do wizualizacji wyników różnicowej ekspresji jako wykresów wulkanicznych.
Ensembl Genome Browser	EMBL-EBI / Ensembl	baza danych	Źródło kanonicznych sekwencji transkryptów dla MTHFD2 i PRDX3.
Ensembl Variant Effect Predictor (VEP)	EMBL-EBI / Ensembl	narzędzie internetowe	Narzędzie służące do adnotacji wariantów missense i integracji wyników predykcyjnych.
ExAC	Broad Institute	baza danych	Baza danych eksomowe na poziomie populacyjnym służąca do walidacji nsSNP.
Gene Expression Omnibus (GEO)	NCBI	baza danych	Repozytorium służące do pobierania zbiorów danych transkryptomowych do analizy raka piersi HER2-dodatniego.
Gene Ontology	Gene Ontology Consortium	GO:0006979	Zasób ontologii służący do pobierania genów związanych ze stresem oksydacyjnym i do analizy wzbogacenia.
GEOquery	Bioconductor	v2.70.0	Pakiet R służący dostępu do macierzy zliczeń GEO i metadanych.
ggplot2	CRAN / tidyverse	v3.5.0	Pakiet R służący do wizualizacji danych, wykresów klastrowania i wyjść graficznych.
ggraph	CRAN	pakiet R	Pakiet R służący do wizualizacji grafów i sieci podczas reprezentacji wzbogacenia i ścieżek.
gnomAD	Broad Institute	baza danych	Baza danych wariantów populacyjnych służąca do sprawdzania częstotliwości i rozkładu priorytetowych nsSNP.
GOplot	CRAN	pakiet R	Pakiet R służący do wizualizacji wzbogacenia GO, w tym wykresów składowych i sumarycznych.
GSE231524	NCBI GEO	dostęp	Zestaw danych RNA-seq używany do analizy fenotypu komórek BT474 rodziców, tolerancyjnych na leki i opornych.
GSE231525	NCBI GEO	dostęp	Zestaw danych RNA-seq używany do analizy wyciszenia DUSP6 w komórkach raka piersi HER2-dodatnich.
Human MitoCarta3.0	Broad Institute	baza danych	Kuratowany zasób genów mitochondrialnych służący do definiowania zestawów genów mitochondrialnych.
Human Oxidative Stress Gene Database (HOSGDB)	HOSGDB	baza danych	Baza danych służąca do pobierania genów związanych ze stresem oksydacyjnym.
igraph	CRAN	pakiet R	Pakiet R służący do reprezentacji sieci i wizualizacji ścieżek.
iMutant 3.0	University of Bologna / Biofold	serwer internetowy	Narzędzie służące do przewidywania efektów mutacji na stabilności białka.
Kaplan–Meier Plotter	KMplot	narzędzie internetowe	Platforma internetowa służąca do analizy przeżycia wolnego od nawrotu w kohortach chorych na raka piersi.
KEGG	Kyoto University	baza danych	Baza danych ścieżek służąca do analizy fosforylacji oksydacyjnej i wzbogacenia ścieżek.
KEGGREST	Bioconductor	pakiet R	Pakiet służący do pobierania i adnotacji informacji o ścieżkach KEGG.
Lapatinib	Nie określono w manuskrypcie	warunek leczenia 1 µM	Inhibitor HER2 stosowany w źródłowych zbiorach danych eksperymentalnych do wyprowadzenia fenotypu tolerancyjnego/opornego na leki.
MetaLR	Zintegrowane przez Ensembl VEP	wynik	Obliczeniowa liczba patogenności służąca do priorytetyzacji wariantów.
MutPred2	MutPred	serwer internetowy	Narzędzie służące do przewidywania funkcjonalnych konsekwencji substytucji aminokwasów.
NetSurfP 3.0	Technical University of Denmark	serwer internetowy	Narzędzie służące do przewidywania struktury wtórnej i dostępności rozpuszczalnika.
org.Hs.eg.db	Bioconductor	v3.18.0	Pakiet do analizy genom