Badanie mikrośrodowiska jajnika: metody izolacji, hodowli 2D i hodowli organoidalnej komórek somatycznych jajnika mysiego

Podsumowanie

Opisujemy metody izolowywania komórek somatycznych jajnika mysiego z frakcji stromy wzbogaconej jajnika oraz generowania organoidów somatycznych jajnika mysiego przy użyciu podejścia bez scaffoldu.

Streszczenie

Jajnik składa się z heterogenicznych populacji komórek somatycznych, zarówno w folikulu, jak i w otaczającej nim stromie, które są kluczowe dla wsparcia funkcji jajnika i wytwarzania wysokiej jakości gamet. Przedstawiamy metody izolacji komórek somatycznych z mysiego jajnika, w tym komórek endotelialnych, nabłonkowych, steroidogennych, stromalnych i odpornościowych. Kiedy te pierwotne komórki somatyczne jajnika są sadzone i hodowane w tradycyjnym układzie kultury 2D, heterogeniczność komórkowa, organizacja oraz interakcje komórka-komórka i komórka-matryca, zwykle występujące w jajniku, są utracone. Dlatego opisujemy również, jak generować mysie organoidy somatyczne jajnika za pomocą podejścia bez szkieletu. Te organoidy samoodpławiają się, utrzymują różnorodne populacje komórek i wytwarzają matrycę pozakomórkową oraz czynniki wydzielane, w tym cytokiny. Organoidy mogą być wykorzystywane do eksperymentów współhodowlanych i mogą być utrzymywane w kulturze przez co najmniej 3 tygodnie z wysoką żywotnością. Ogólnie rzecz biorąc, modele te umożliwiają badanie fizjologii i patologii jajnika z perspektywy komórek somatycznych.

Wprowadzenie

Chociaż oocyt, czyli komórka płciowa żeńska, jest niezbędny do powstania kolejnego pokolenia, komórki somatyczne w jajniku odgrywają kluczowe role w rozwoju gamet, produkcji hormonów steroidowych i homeostazie jajnika. Oocyty, otoczone komórkami somatycznymi granulozy i teca, tworzą funkcjonalne jednostki jajnika znane jako mieszki. Komórki granulozy są fizycznie połączone z oocytem poprzez projekcje transzonalne i dostarczają oocytowi wsparcia metabolicznego i składników odżywczych, oprócz regulacji zatrzymania mejozy^1,2. Ponadto, w odpowiedzi na gonadotropiny, komórki granulozy i teca produkują hormony steroidowe, w tym estrogen, progesteron i androgeny, które mają wpływ poza układem rozrodczym, wpływając na układ krążenia, mięśniowo-szkieletowy i nerwowy, a tym samym wpływając na ogólne zdrowie kobiet³. Mieszki jajnikowe rozwijają się w obrębie niejednorodnego stromy jajnika, złożonej z naczyń krwionośnych, komórek odpornościowych, kilku populacji fibroblastów interstycjalnych i komórek mezenchymalnych, a także wysoce uporządkowanej macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM)⁴. To środowisko stromalne zapewnia fizyczne i chemiczne sygnały, które wpływają na wzrost mieszków, owulację i luteinizację⁴.

Istnieje kilka metod izolowywania i hodowania gamet i mieszków in vitro, a metody te poszerzyły naszą wiedzę na temat ooogenezy i folikulogeneza⁵. Jednak kompartyment somatyczny jajnika jest stosunkowo słabo zbadany, częściowo z powodu braku solidnych modeli in vitro. Obecne modele kompartymentu somatycznego jajnika są w dużej mierze ograniczone do pojedynczego typu komórek, takich jak fibroblasty, komórki nabłonkowe powierzchni jajnika, komórki śródbłonka, odpornościowe lub granulozy^{6,7,8,9,10,11}. Hodowla szeroko definiowanych pierwotnych komórek somatycznych jajnika w dwuwymiarowej (2D) hodowli sprzyja populacjom makrofagów z czasem, co prowadzi do utraty różnorodności komórkowej¹². Ponadto, tradycyjna dwuwymiarowa (2D) kultura monowarstwowa nie pozwala na zróżnicowane interakcje komórka-komórka i komórka-macierz, które są obecne w jajniku. Eksplanty tkanki jajnikowej zachowują złożoność komórkową i strukturalną natywnej tkanki, ale różnią się składem w zależności od tego, skąd w jajniku zostały pobrane^13,14.

Organoidy to trójwymiarowe (3D), wielokomórkowe, miniaturyzowane wersje narządów lub tkanek, które naśladują organizację i funkcje in vivo^15,16. Organoidy mogą być generowane z komórek macierzystych lub komórek pierwotnych izolowanych z tkanki normalnej lub chorej¹⁵. W kontekście żeńskiego układu rozrodczego, organoidy zostały wygenerowane do modelowania endometrium, jajowodu, szyjki macicy i łożyska¹⁷. Jednakże, jeśli chodzi o jajnik, aż do niedawna, modele organoidalne były ograniczone do pojedynczego typu komórek, takich jak nabłonek powierzchni jajnika lub komórki nowotworowe, lub zostały wygenerowane z indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych, aby przypominać struktury mieszków, a nie stromę jajnika^17,18. Ostatnie badania wygenerowały i scharakteryzowały organoidy za pomocą niejednorodnych populacji komórek somatycznych izolowanych z tkanki jajnikowej myszy, makaki rezonansowej i ludzkiej^19,20,21. Te modele organoidalne umożliwiły badanie mechanizmów komórkowych leżących u podstaw starzenia się jajników, a także wpływu narażenia na ftalany na skład ECM^19,21.

Biorąc pod uwagę krytyczne znaczenie komórek somatycznych, zarówno w mieszku, jak i stromie, dla funkcji jajnika, opisujemy metody izolowania komórek somatycznych z frakcji wzbogaconej w stromę mysich jajników i ich hodowania in vitro przy użyciu tradycyjnej kultury monowarstwowej lub w modelu organoidalnym. Za pomocą bezszachownicowych mikromoldów agarozowych, komórki somatyczne jajnika tworzą organoidy w ciągu 1-3 dni. Organoidy zachowują kluczowe populacje komórek jajnikowych, w tym fibroblasty, makrofagi i komórki steroidogenne, i mogą być kultywowane przez okres do 3 tygodni z wysoką żywotnością. Organoidy somatyczne jajników sprzyjają ocenie transkryptomu i histologicznej, analizie pożywienia uwarunkowanego, współhodowli z innymi typami komórek i metodom przesiewowym związków. Ogólnie rzecz biorąc, te organoidy są solidnym modelem do in vitro badania i modyfikacji kompartymentu somatycznego jajnika i mogą być zastosowane do badań nad rozwojem jajnik

Protokół

The use of animals to develop this protocol was in accordance with the Institutional Animal Care and Use Committee at Northwestern University and the National Institutes of Health Guidelines for Care and Use of Laboratory Animals (Northwestern University Animal Welfare Assurance Number: A3283-01; IACUC Protocol ID: IS00013082_IM12). Manufacturer information and catalog numbers for all materials, including silicone casts for agarose micromolds, media, and supplements, are given in the Table of Materials. An overview of the protocol steps is presented in Figure 1. All protocol steps should be performed using appropriate personal protective equipment, in compliance with all institutional biosafety and environmental health and safety regulations, and, unless otherwise specified, within a Class II biosafety cabinet.

Figure 1: Schematic of mouse ovarian somatic cell isolation, ovarian somatic organoid generation, and downstream applications. Mouse ovaries are isolated and the stromal fraction is enriched. The enriched stromal fraction is digested enzymatically and mechanically. Undigested tissue is strained out. Cells are pelleted, washed, counted, and plated for culture in 2D. For organoid generation, following 2D culture overnight, cells are harvested using trypsin and are pelleted, washed, and counted. Cells are seeded into agarose micromolds for organoid culture. Organoids can be utilized for histology, RNA/protein extraction, conditioned media analysis, treatments, and drug screening, as well as co-culture. Please click here to view a larger version of this figure.

1. Preparation of media for ovarian somatic cell isolation and culture

NOTE: Digestion of ovarian tissue and subsequent isolation and culture of primary somatic cells requires four types of media: Dissection media (DM; used in Steps 2.3–2.4 for dissection and puncture of mouse ovaries), enzymatic media (EM; used in Steps 2.5–2.8 for enzymatic digestion of stroma-enriched mouse ovaries), quenching media (QM; used in Step 2.9 to slow enzymatic digestion), and plating media (PM; used in Steps 2.11–2.14 and Step 4.6 for washing, plating, and 2D culture of primary ovarian somatic cells, as well as inactivation of trypsin when harvesting the cells from 2D culture). All media should be prepared in a sterilized, Class II biological safety cabinet or laminar flow hood. Media recipes listed below are sufficient for processing ovaries from 5–6 mice, but should be scaled as needed. All media can be prepared up to a week in advance and stored at 4 °C, but the enzymes for the EM must be added fresh on the day of cell isolation.

1. Prepare DM (15 mL) containing 1% fetal bovine serum (FBS) and 0.5% penicillin-streptomycin (PS) in Leibovitz's L-15 medium. Sterilize the media using a sterile filter.
   NOTE: DM is buffered for ambient air exchange and utilized during microdissection of the ovary from surrounding tissues, as well as enrichment for the stromal fraction.
2. Prepare EM (10 mL) containing 1% FBS and 0.5% PS in αMEM. Add 82 enzymatic units/mL Collagenase IV and 0.2 mg/mL of DNase I (≥400 enzymatic activity units/mg). Dissolve the enzymes by inverting and then sterilize the media using a sterile filter.
   NOTE: Enzymatic media is sodium bicarbonate-buffered for air exchange at 5% CO₂ and utilized for enzymatic digestion of ovarian tissue pieces.
3. Prepare QM (20 mL) containing 10% FBS and 0.5% PS in αMEM medium. Sterilize the media using a sterile filter.
   NOTE: QM is sodium bicarbonate-buffered for air exchange at 5% CO₂ and utilized for quenching of the enzymatic digestion.
4. Prepare PM (30 mL) containing 10% FBS and 1% PS in RPMI 1640 (containing 25 mM HEPES and 2 mM L-Glutamine). Sterilize the media using a sterile filter.
   NOTE: PM is sodium bicarbonate-buffered for air exchange at 5% CO₂ and utilized for plating of primary ovarian somatic cells, as well as culture in 2D.

2. Digestion of ovarian tissue and isolation of primary somatic cells

NOTE: Mouse ovaries are isolated and digested both enzymatically and mechanically to isolate primary somatic cells. Ovaries from 5–6 mice can be processed together in the same dish. The following steps should be performed using aseptic technique, preferably using a dissecting microscope in a laminar flow hood.

1. Add 10 mL of EM, 20 mL of QM, and 20 mL of PM into separate 100 mm Petri dishes. Equilibrate the dishes in a tissue culture incubator (humidified environment, 37 °C with 5% CO₂) for a minimum of 1 h prior to use.
2. Warm DM in a water bath (37 °C) prior to use.
3. Dissect mouse ovaries into a 35 mm Petri dish containing 3 mL of DM. Separate the ovaries from the attached adipose tissue, oviduct, and ovarian bursa using fine-tipped forceps and/or microscissors (Figure 2Ai,ii). Utilize a dissecting microscope as needed for microdissection.
4. Transfer the dissected ovaries to a 45 mm watch glass with 2–3 mL of DM. Under a dissecting microscope, anchor and puncture all areas of the ovaries using 28-G insulin needles with the nondominant and dominant hands, respectively, for approximately 10 min. Frequently rotate the ovarian tissue to ensure that all areas are disrupted.
   NOTE: Puncturing the ovaries enriches the stromal fraction by releasing preantral follicles as well as cumulus-oocyte-complexes and granulosa cells from antral follicles (Figure 2Aiii–iv).
5. Use fine-tipped forceps to move stroma-enriched mouse ovaries to the Petri dish with equilibrated EM (Figure 2Bi).
6. Working quickly to minimize temperature and pH changes to the media, tear the stroma-enriched ovaries into approximately 2–3 mm pieces with fine-tipped forceps (Figure 2Bii).
7. Hold the Petri dish at an angle and repeatedly pipette EM containing ovarian tissue pieces with a p1000 pipette, set to 1 mL, 100× or for 3 min, whichever comes first (Figure 2Biii). Swirl the Petri dish as necessary to make sure that all tissue pieces are pipetted.
   NOTE: If the tissue is too large to be pipetted with a p1000 tip, the tip can be cut with a sterile scalpel to make the opening wider. The bore should be wide enough to allow most (>50%), but not all, of the tissue pieces to enter, creating a shearing effect.
8. Transfer the Petri dish containing EM and ovarian tissue pieces to a tissue culture incubator (humidified environment, 37 °C with 5% CO₂) and incubate for a total of 30 min, removing the dish and pipetting repeatedly (100× or for 3 min) after 15 min, and then again

Wyniki

Aby określić skład komórkowy sromowych organoidalnych jajników, przeprowadziliśmy immunohistochemikę sekcji tkanki organoidalnej po 6 dniach hodowli, używając przeciwciał przeciwko kluczowymi tipom komórek jajnika. Organoidy zawierały fibroblasty dodatnie na wimentynę, makrofagi dodatnie na F4/80, a także populacje komórek steroidogenicznych (Rysunek 6B)¹⁹. Użyliśmy przeciwciała przeciwko Foxl2 do oznaczenia komórek ziarnistych i komórek ziarnistych-luteinowych, opróc...

Dyskusja

W niniejszym artykule opisano metody izolacji pierwotnych komórek somatycznych jajnika mysiego z frakcji wzbogaconej w stromę jajnika, w sposób zachowujący heterogeniczność komponentu somatycznego jajnika. Pierwotne komórki somatyczne jajnika mysiego mogą być hodowane w 2D monowarstwie lub wykorzystywane do generowania organoidów somatycznych jajnika za pomocą bezoporowych form mikromatryc mikromolowych z agarozy. Mikroformy z agarozy zawierają 96 mikrodołków do tworzenia organoidów i pasują do pojedynczej komórki płytki...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
0.2 μm, Polyethersulfone syringe filter	Corning	431229
1.5 mL microcentrifuge tubes	MIDSCI	PR-MCT15
100 mL glass beaker	Fisherbrand	FB100100
100 mm Petri dishes	Corning	351029
15 mL conical tubes	ThermoFisher Scientific	339651
24-well plates (TC-treated)	Corning	353047
28-gauge insulin needles	Exel International	26027
35 mm Petri dishes	Corning	351008
3β-HSD antibody	Cosmo Bio	K0607	1:1000
4% Paraformaldehyde	Electron Microscopy Sciences	1574100
40 µm cell strainer	Corning	431750
45 mm watch glass	Electron Microscopy Sciences	7054345
50 mL concial tubes	ThermoFisher Scientific	339652
60 mL sterile syringe	Air-Tite	ML60
60 mm TC-treated plates	Corning	353037
6-well plates (TC-treated)	Corning	353046
Agarose	Hoefer	GR140-500	Gel strength >1200 g/cm2; Gel Temperature 36 °C
Autoclave sterilization pouch	Fisherbrand	01-812-55
Biotinylated Goat Anti-Mouse IgG	Vector Laboratories	BA-9200-1.5	1:200
Biotinylated Goat Anti-Rabbit IgG	Vector Laboratories	PK-6101	1:200
Biotinylated Goat Anti-Rat IgG	Vector Laboratories	BA-9400-1.5	1:100
Bluing reagent	Fisherbrand	23-245681
Centrifuge with swing bucket rotor for 50 mL conical tubes	ThermoFisher Scientific	Sorvall X1R Pro-MD
Class II biosafety cabinet	The Baker Company	SG403A
Cleaved Caspase-3 (CC3) antibody	Cell Signaling Technology	9579T	1:250
CO2 incubator	ThermoFisher Scientific	Heracell VIOS 160i CO2 Incubator
Collagenase, Type IV, powder	Gibco, Fisher Scientific	17-104-019
C-Series Mouse Cytokine Antibody Array 3 Kit	RayBiotech	AAM-CYT-3-8
Cytoseal XYL	Epredia	83124
Deoxyribonuclease I from bovine pancreas	Millipore Sigma	DN25-100MG	Dnase I
Dissecting microscissors	World Precision Instruments	WPI-14003
Dissecting scissors	World Precision Instruments	WPI-15922
Dissection microscope	Leica	MZ9.5, S9 series
DPBS, no calcium, no magnesium	Gibco, Fisher Scientific	14-190-250	pH 7.0–7.3
Eosin	Fisherbrand	23-314631
F4/80 antibody	Bio-Rad	MCA497G	1:50
Fetal Bovine Serum, certified, heat inactivated, United States	Gibco, ThermoFisher Scientific	10082147
Fine-tipped dissecting forceps	World Precision Instruments	WPI-14098
FOXL2 antibody	Abcam	ab246511	1:200
Graefe Forceps	Fine Science Tools	1105010
Hematoxylin	EK Industries	EKI 47971GL
Hemocytometer	MedOne	DHCN015
Imaging System	ThermoFisher Scientific	EVOS FL Auto
IntestiCult Organoid Growth Medium (Mouse)	STEMCELL Technologies	06005	Basal medium, Supplements 1 and 2
Laminar flow hood	IVFtech	IVFtech sterile workstation
Leibovitz's L-15 Medium	Gibco, Fisher Scientific	11415114
Microscope slides	Mercedes Scientific	MER 7255/90/WH/CC
MicroTissues 3D Petri Dish micro-mold spheroids	Millipore Sigma	Z764043-6EA	Silicone casts for agarose micromolds
Modified Davidson's Fixative	Electron Microscopy Sciences	6413350
OVCAR8-RFP cells			Gift from Joanna Burdette PhD, University of Illinois Chicago
Penicillin-Streptomycin	Millipore Sigma	P4333-100ML
Picrosirius Red staining solution	StatLab	STPSRPT
RPMI 1640 Medium (ATCC modification)	Gibco, Fisher Scientific	A1049101
Tabletop centrifuge	Eppendorf	Centrifuge 5430 R
Trypan blue	ThermoFisher Scientific	T10282
Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red	Gibco, ThermoFisher Scientific	25300054
Vimentin antibody	Cell Signaling Technology	5741S	1:100
αMEM, GlutaMAX Supplement, no nucleosides	Gibco, Fisher Scientific	32561102