Artykuł przeglądowy

Postęp badań nad strategiami oceny efektywności naprawy uszkodzeń DNA

DOI:

10.3791/71031

⸱

23 czerwca 2026

 ,  ,  ,  ,  , 
1Jiangsu Province Engineering Research Center of Development and Translation of Key Technologies for Chronic Disease Prevention and Control, Suzhou Vocational Health College, 2School of Chemistry and Life Sciences, Suzhou University of Science and Technology, 3Department of Orthopedics, The First Affiliated Hospital of Soochow University, 4Department of Hematology, The First Affiliated Hospital of Soochow University

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Testy wydajności naprawy uszkodzeń DNA można ogólnie podzielić na trzy grupy: testy funkcjonalne oparte na komórkach, in vitro testy biochemiczne i testy markerów molekularnych. Te podejścia umożliwiają jakościową lub ilościową ocenę wydajności naprawy w wielu szlakach naprawy uszkodzeń DNA.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Genomiczna DNA komórkowa jest ciągle narażona na endogenne i egzogenne czynniki, które indukują różne formy uszkodzenia DNA. W komórkach ssaków dzienne obciążenie uszkodzeniami DNA może osiągnąć 104–105 uszkodzeń na komórkę. Uszkodzenie DNA, które utrzymuje się w fazie S, może prowadzić do mutacji. Gdy takie mutacje występują w onkogenach, genach supresorowych nowotworów lub genach zaangażowanych w proliferację komórek, mogą promować transformację komórkową i karcynogenezę. Dlatego naprawa uszkodzeń DNA odgrywa krytyczną rolę w utrzymaniu stabilności genomowej i zapobieganiu rozwojowi raka. Ocena zdolności naprawy DNA jest najlepiej osiągalna poprzez pomiar aktywności funkcjonalnej systemów naprawczych DNA. Ścieżki naprawy uszkodzeń DNA i ich efektywności naprawy są bardzo istotne dla rozwoju leków chemioterapeutycznych, walidacji funkcji genów i terapii raka. W związku z tym, badanie efektywności naprawy poszczególnych ścieżek naprawy uszkodzeń DNA ma ważne znaczenie teoretyczne i praktyczne. Niniejsza recenzja podsumowuje główne ścieżki naprawy uszkodzeń DNA, metody stosowane do oceny efektywności naprawy oraz zalety i ograniczenia tych podejść.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

System naprawy uszkodzeń DNA to kluczowy mechanizm obrony komórkowej, który utrzymuje stabilność genomu poprzez zmniejszenie częstości mutacji i hamowanie karcynogenezy1. Różne typy uszkodzeń DNA są naprawiane przez odrębne, ale powiązane ze sobą ścieżki naprawcze2. Na przykład błędy bazowe powstałe podczas replikacji DNA są korygowane przez naprawę niedopasowań (MMR), podczas gdy chemicznie zmodyfikowane zasady, takie jak alkilowane zasady, są głównie naprawiane poprzez naprawę wycinania zasad (BER)3. Fotoprodukty 6-4 indukowane przez promieniowanie UV i ogromne nukleotydowe addukty generowane przez pewne czynniki chemiczne są usuwane poprzez naprawę wycinania nukleotydów (NER). Uszkodzenia przerwań międzyłańcuchowych (ICL) są naprawiane poprzez skoordynowane działania białek związanych z ścieżką niedokrwistości Fanconiego4. Przerwy jednoniciowe (SSBs) są naprawiane poprzez ścieżkę naprawy przerw jednoniciowych (SSBR), podczas gdy przerwy dwuniciowe (DSBs) są głównie naprawiane poprzez niehomologiczną łączenie końców (NHEJ) lub homologiczną rekombinację (HR). W większości przypadków złożone uszkodzenia DNA są rozwiązywane poprzez skoordynowane interakcje między wieloma ścieżkami naprawy DNA5.

Ocena uszkodzeń DNA i wydajności naprawy w komórkach zazwyczaj opiera się na kombinacji podejść eksperymentalnych, w tym asacie Comet, immunofluorescencji (IF), Western blottingu (WB), reaktywacji komórki gospodarza (HCR) oraz asatach naprawczych opartych na plazmidach. Te metody oceniają uszkodzenia DNA i naprawę poprzez wykrywanie przerw nici DNA, markerów uszkodzeń DNA oraz ekspresji lub lokalizacji białek związanych z naprawą6. Jednak dokładna ilościowa ocena wydajności naprawy komórkowej zwykle wymaga dynamicznych assayów opartych na wyzwaniu. W tych podejściach specyficzne uszkodzenia DNA są indukowane eksperymentalnie, a komórki są pobrane w kolejnych punktach czasowych, aby monitorować tworzenie i usuwanie sygnałów uszkodzeń. Porównanie pozostałych poziomów uszkodzeń w czasie w stosunku do początkowego obciążenia uszkodzeniami umożliwia ilościową ocenę kinetyki naprawy i funkcjonalności ścieżek.

Aby systematycznie porównać cechy i zastosowania obecnie dostępnych assayów oceny wydajności naprawy uszkodzeń DNA, niniejsza recenzja podsumowuje główne metody wykrywania według pięciu parametrów: specyficzność uszkodzenia/substratu, rozdzielczość analityczna, czułość, zdolność ilościowa oraz wymagania sprzętowe (Tabela 1). Niniejsza recenzja ma na celu dostarczenie praktycznego przewodnika metodologicznego dotyczącego wyboru odpowiednich podejść do badania ścieżek naprawy uszkodzeń DNA w badaniach podstawowych, translacyjnych i klinicznych.

Metoda wykrywaniaSpecyficzność uszkodzenia/substratuRozdzielczość analitycznaCzułość/prog stwierdzeniaWynik ilościowy vs. jakościowyWymagania sprzętowe
Western blotCPDs, 6-4PPs, białka naprawcze (np. MGMT, RAD51)PopulacjaUmiarkowanaPółilościowyElektroforeza białek, transfer membrany, system obrazowania chemiluminescencyjnego
Imunos fluorescencjaCPDs, skupienia DSB (np. α-H2AX, RAD51)JednokomórkowaUmiarkowanaPółilościowyMikroskop fluorescencyjny
HPLC-MS/MSCPDs, 6-4PPs, oksydacyjne i alkylatywne uszkodzenia zasadPopulacja/In vitroBardzo wysokaIlościowyHPLC-MS/MS
Assay aktywności enzymu MGMTUszkodzenia alkylacji O6-meGPopulacja/In vitroWysokaIlościowyCzytnik mikroplatek
Assay CometSSBs, DSBs, utlenione zasady (z pretretowaniem FPG/OGG)JednokomórkowaWysokaIlościowyMikroskop fluorescencyjny/system elektroforetyczny
Assay nacięciaMiejsca AP, nacięcia NER, nacięcia BERPopulacja/In vitroWysokaIlościowyWizerunek żelowy, radiooznaczanie/wykrywanie fluorescencyjne
Rekonstytuowany system naprawczyUszkodzenia zasad w określonych miejscach, miejsca AP, przerwy niciIn vitroWysokaIlościowyElektroforeza żelowa, wykrywanie fluorescencyjne/MS
Assay naprawy oparty na plazmidzieUszkodzenia w określonych miejscachPopulacjaUmiarkowanaIlościowyCzytnik mikroplatek, cytometr przepływowy, liczenie kolonii
Assay reporterowy

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przegląd i perspektywa

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Naprawa bezpośrednia (DR)

Naprawa bezpośrednia (DR) jest najprostszą formą naprawy DNA i odnosi się do bezpośredniego przywracania uszkodzonego DNA bez usuwania zasad lub nukleotydów7. DR naprawia głównie dwa główne rodzaje uszkodzeń DNA. Pierwsze to uszkodzenie dimeru pirymidynowego cyklobutanu (CPD) wywołane przez promieniowanie ultrafioletowe (UV). W wielu organizmach fotoliaza rozpoznaje i wiąże dimery pirymidynowe. Po ekspozycji na światło widzialne, fotoliaza aktywuje się, bezpośrednio odwraca uszkodzenie DNA i następnie odłącza się od cząsteczki DNA. Ten mechanizm fotoreaktywacji jest szczególnie ważny w roślinach i niższych organizmach. Jednak ssaki łożyskowe, w tym ludzie, nie mają funkcjonalnej fotoliazy i dlatego nie mogą przeprowadzić fotoreaktywacji. W konsekwencji, uszkodzenie CPD wywołane promieniowaniem UV w komórkach ludzkich jest naprawiane głównie przez naprawę wycinania nukleotydów (NER)8.

Drugi główny rodzaj uszkodzenia naprawiany przez DR to uszkodzenie zasad wywołane alkylacją. Naprawa jest pośredniczona przez O6-alkilguaninę-DNA alkiltransferazę (AGT), znaną również jako O6-metylguaninę-DNA metylotransferazę (MGMT). Enzym ten przenosi grupy alkylowe z pozycji O6 reszty guaniny na siebie, bezpośrednio przywracając uszkodzoną zasadę DNA.

Metody wykrywania efektywności DR

  1. Wykrywanie efektywności naprawy uszkodzeń CPD wywołanych promieniowaniem ultrafioletowym (UV)
    1. Test Western blot (WB) do wykrywania zmian w zawartości CPD
      Używając przeciwciał specyficznych dla CPD, badacze mogą wykrywać zmiany w obfitości CPD w różnych punktach czasowych po naświetleniu UV i wywnioskować efektywność naprawy z poziomu resztkowego uszkodzenia. Wyższa efektywność naprawy odpowiada szybszemu usuwaniu CPD. Wykrywanie CPD oparte na WB jest klasycznym i skutecznym podejściem do oceny aktywności naprawczej DNA; jednakże istnieją pewne ograniczenia. Po pierwsze, test mierzy średnie poziomy uszkodzeń w populacjach komórek i dlatego brakuje mu rozdzielczości pojedynczej komórki. Po drugie, i co ważniejsze, test nie potrafi rozróżnić ścieżek naprawczych. Ponieważ CPD w ludzkich komórkach są naprawiane głównie przez NER, analiza WB sama w sobie nie potrafi rozróżnić, czy obserwowana aktywność naprawcza odzwierciedla naprawę pośredniczoną przez fotoliazę czy aktywność NER bez dodatkowego kontekstu eksperymentalnego.
    2. Imunofluorescencyjne (IF) pozycjonowanie dynamicznych zmian w ogniskach CPD
      Komórki poddane naświetleniu UV i leczeniu fotonaprawczym mogą być barwione za pomocą przeciwciał specyficznych dla CPD, a zmiany w ogniskach CPD w jądrach mogą być wizualizowane za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej. Ilościowa analiza formowania się i usuwania ognisk CPD umożliwia ocenę zdolności naprawczej DNA na poziomie populacji i pojedynczych komórek. Szybkość zaniku ognisk CPD bezpośrednio odzwierciedla efektywność naprawy. IF zapewnia przestrzenną i czasową wizualizację dynamiki naprawy w pojedynczych komórkach i pozwala na wykrycie heterogeniczności międzykomórkowej. Jednakże sygnały fluorescencyjne są podatne na zgaśnięcie, a analizy ilościowe często opierają się na ręcznym liczeniu, co wprowadza subiektywność. W komórkach ssaków pozbawionych aktywności fotoreaktywacji ta metoda odzwierciedla głównie efektywność naprawy pośredniczonej przez NER.
    3. Chromatografia cieczowa wysokiej efektywności połączona z spektrometrią masową (HPLC-MS/MS) do ilościowej analizy CPD
      Wyekstrahowany DNA jest enzymatycznie trawiony na nukleozydy, po czym CPD są oddzielane od normalnych nukleozydów za pomocą chromatografii cieczowej wysokiej efektywności (HPLC). Następnie ilościowa analiza jest przeprowadzana za pomocą tandemowej spektrometrii masowej (MS/MS). Efektywność naprawy jest określana przez porównanie obfitości CPD przed i po naprawie9. HPLC-MS/MS zapewnia niezwykle wysoką specyficzność i czułość na poziomie pikomolowym; jednakże metoda wymaga drogiego sprzętu, złożonej przygotki próbki i nie odbija stanu naprawy in situ w całych komórkach. W próbkach komórek ludzkich, mierzona efektywność naprawy odzwierciedla głównie aktywność NER.
  2. Efektywność naprawy uszkodzeń zasad DNA wywołana przez czynniki alkylujące
    1. Test aktywności enzymu MGMT
      Efektywność naprawy uszkodzeń DNA wywołanych przez czynniki alkylujące jest zwykle oceniana poprzez pomiar aktywności MGMT10. Radioaktywnie zmodyfikowane podłoża DNA z metylowanymi zasadami są używane do monitorowania transferu grup metylowych z uszkodzonego DNA na białko MGMT, umożliwiając tym samym ilościową ocenę efektywności naprawy.
    2. Test raportujący gen do wykrywania efektywności naprawy O6-meG
      Plazmidy reporterowe zawierające uszkodzenia O6-metylguaniny (O6-meG) mogą być skonstruowane w celu oceny efektywności naprawy. Wprowadzone uszkodzenie

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wnioski

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dokładne wykrywanie i ilościowa analiza procesów naprawy uszkodzeń DNA są niezbędne do zrozumienia mechanizmów molekularnych leżących u podstaw naprawy DNA, oceny efektów biologicznych narażenia na czynniki środowiskowe oraz oceny reakcji terapeutycznych78. Dlatego głębokie zbadanie ścieżek naprawy uszkodzeń DNA i efektywności naprawy ma znaczące znaczenie zarówno w badaniach podstawowych, jak i w zastosowaniach klinicznych79.

Liczne badania wyka...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy deklarują, że nie mają żadnych konkurencyjnych interesów finansowych ani osobistych relacji, które mogłyby wpłynąć na prace zgłoszone w niniejszym badaniu.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

To prace zostało wspierane przez Jiangsu Province Engineering Research Center of Development and Translation of Key Technologies for Chronic Disease Prevention and Control; Jiangsu Higher Education Institution Innovative Research Team for Science and Technology (2021); Program Jiangsu Vocational College Engineering Technology Research Center (2023); Natural Science Key Foundation of Jiangsu Higher Education Institutions of China (Grant No. 24KJA310008); Key Program of Suzhou Vocational Health College (Grant No. szwzy202406); oraz State Key Laboratory of Radiation Medicine and Protection, Soochow University (Grant No. GZK1202506).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Szlaki naprawy DNAstabilno genomicznaterapia nowotworowaopracowywanie lek w chemioterapeutycznychocena aktywno ci funkcjonalnejwalidacja funkcji genuzdolno naprawy DNAtransformacja kom rkowa

Powiązane artykuły