Protokół montażu taśmy do wysokiej rozdzielczości obrazowania złożonych oczu Drosophila Z-stack

Summary

Głównym celem tego protokołu jest umożliwienie nieniszczącego obrazowania i analizy ilościowej złożonych oczu Drosophila. Łączy strategię montażu na taśmie ze stereomikroskopowym pozyskiwaniem stosu Z oraz rekonstrukcją rozszerzonej głębi ostrości, aby uzyskać obrazy o wysokiej rozdzielczości, wolnych od artefaktów.

Abstract

Przedstawiamy tutaj niedestrukcyjny protokół montażu i obrazowania do wysokiej rozdzielczości analizy fenotypowej złożonego oka Drosophila. Dokładne fenotypowanie złożonego oka Drosophila często jest ograniczone przez jego wypukłą geometrię i mechaniczną kruchość podczas manipulacji. Aby temu zaradzić, szczegółowo przedstawiamy wszechstronny, nieinwazyjny workflow obrazowania, który umożliwia wizualizację w wysokiej rozdzielczości z wielu perspektyw. Protokół wykorzystuje niestandardową strategię montażu kleju na platformie z odwróconą taśmą, która zabezpiecza muchy za ciało i skrzydła, pozostawiając głowę całkowicie nietkniętą. Co istotne, ta elastyczna konfiguracja wspiera różne orientacje montażu: pozycję boczną do pełnego wypukłości poszczególnych oczu oraz pozycję czołową do oceny symetrii całej głowy. Metoda ta ułatwia również układanie matryc o wysokiej gęstości, umożliwiając szybkie przetwarzanie 20–30 próbek na sesję. Integrując stereomikroskopię światła odbitego z akwizycją stosu Z i rekonstrukcją rozszerzonej głębi ostrości (EDF), proces generuje jednolicie ostre, quasi-3D obrazy kompozytowe. Takie podejście zachowuje naturalne pigmentacje i tworzy obrazy o wysokiej wierności i kontrastie, odpowiednie do ilościowej analizy fenotypowej na skalę narządów.

Introduction

Złożone oko Drosophila melanogaster to klasyczny i potężny model do badania wzrostu, wzorowania i odporności narządów podczas rozwoju. Składające się z około 800 wysoko uporządkowanych ommatidiów, oko muchy zapewnia czuły i mierzalny odczyt zaburzeń genetycznych wpływających na proliferację, różnicowanie i organizację tkanek ^1,2,3. Genetyczna manipulacja rozwoju oczu historycznie dostarczała fundamentalnych wglądów w zachowane szlaki sygnalizacyjne. Badania przełomowe wykazały, że ektopowa ekspresja czynnika transkrypcyjnego eyeless wystarcza, aby wywołać fo....

Protocol

1. Zbieranie próbek i synchronizacja

UWAGA: Aby zapewnić porównywalność eksperymentalną, wymagana jest ścisła kontrola czasu ekluzji. W standardowych warunkach hodowli w temperaturze 25 °C eklosja zazwyczaj następuje 10 do 12 dni po złożeniu jaj. Poczwarki powinny być uważnie obserwowane w tym okresie, ponieważ ciemnienie obudowy poczwarki wskazuje na rychłą eklekcję.

1. Metoda bezpośredniego natapiania (metoda standardowa)
   1. Delikatnie stuknij standardową plastikową fiolkę Drosophila o wymiarach 24 x 95 mm (zamkniętą piankowym korkiem) o miękką podkładkę, aby wypchnąć dorosłe muchy na dno.
   ....

Results

Cały proces eksperymentalny, od pobierania próbek do pozyskiwania obrazu, jest podsumowany na Rysunku 1. Efektywność zmodyfikowanego protokołu jest demonstrowana poprzez tworzenie matryc próbek o wysokiej gęstości. Jak pokazano na Rysunku 2A, 20–30 znieczulonych much można ułożyć w siatkowatym wzorze na jednej platformie z odwróconą taśmą. Znaczniki orientacji zapisane na nieklejących końcach taśmy zapewniają spójną kierunkowość głowic, co ułatwia szybkie i syst.......

Discussion

Złożone oko Drosophila pełni funkcję potężnego odczytu fenotypowego do badań genetycznych, gdzie zauważalne zmiany rozmiaru, szorstkości lub pigmentacji oka^często wskazują na zaburzenia w podstawowych szlakach sygnalizacji, takich jak Hippo ^5,6 czy Hedgehog⁷. Jednak efektywność takich ekranów od dawna była ograniczana przez ograniczenia t.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Butla gazowa z dwutlenkiem węgla (CO2	Lokalny dostawca	Nie ma
CO2 dmuchawka do znieczulenia	T& L	DG-08
Cyfrowy aparat mikroskopowy	Leica	DMC6200
Delikatne pęsety	VETUS	MOS-167B
Piankowe korki	Dongpeng	Nie ma
Oprogramowanie do akwizycji obrazu (LAS X)	Leica	3.7.1
Oprogramowanie do przetwarzania obrazu (FIJI/ImageJ)	NIH	Open source
Oświetlenie kopuły LED	Leica	LED5000 HDI
LED Gooseneck iluminator	cossim	LG-10
Zmotoryzowany stereomikroskop	Leica	M205 FCA
Soczewka obiektywowa	Leica	1.0x PlanApo NA0.2
Pneumatyczny zawór pedału nożnego	DELIXI	FV-320
Standardowe fiolki z kulturą Drosophila	LAIBOER	2424951
Standardowe podłoże pokarmowe Drosophila	Nie ma	Mąka kukurydziana-agar-melasa
Standardowe szkiełka mikroskopowe szklane	Citotest	10127101P-G
Standardowy stereomikroskop	Nikon	SMZ745
Taśma maskująca z białego papieru	UBWIN	Szerokość 25 mm