Protokół montażu taśmy do wysokiej rozdzielczości obrazowania złożonych oczu Drosophila Z-stack

Summary

Głównym celem tego protokołu jest umożliwienie nieniszczącego obrazowania i analizy ilościowej złożonych oczu Drosophila. Łączy strategię montażu na taśmie ze stereomikroskopowym pozyskiwaniem stosu Z oraz rekonstrukcją rozszerzonej głębi ostrości, aby uzyskać obrazy o wysokiej rozdzielczości, wolnych od artefaktów.

Abstract

Przedstawiamy tutaj niedestrukcyjny protokół montażu i obrazowania do wysokiej rozdzielczości analizy fenotypowej złożonego oka Drosophila. Dokładne fenotypowanie złożonego oka Drosophila często jest ograniczone przez jego wypukłą geometrię i mechaniczną kruchość podczas manipulacji. Aby temu zaradzić, szczegółowo przedstawiamy wszechstronny, nieinwazyjny workflow obrazowania, który umożliwia wizualizację w wysokiej rozdzielczości z wielu perspektyw. Protokół wykorzystuje niestandardową strategię montażu kleju na platformie z odwróconą taśmą, która zabezpiecza muchy za ciało i skrzydła, pozostawiając głowę całkowicie nietkniętą. Co istotne, ta elastyczna konfiguracja wspiera różne orientacje montażu: pozycję boczną do pełnego wypukłości poszczególnych oczu oraz pozycję czołową do oceny symetrii całej głowy. Metoda ta ułatwia również układanie matryc o wysokiej gęstości, umożliwiając szybkie przetwarzanie 20–30 próbek na sesję. Integrując stereomikroskopię światła odbitego z akwizycją stosu Z i rekonstrukcją rozszerzonej głębi ostrości (EDF), proces generuje jednolicie ostre, quasi-3D obrazy kompozytowe. Takie podejście zachowuje naturalne pigmentacje i tworzy obrazy o wysokiej wierności i kontrastie, odpowiednie do ilościowej analizy fenotypowej na skalę narządów.

Introduction

Złożone oko Drosophila melanogaster to klasyczny i potężny model do badania wzrostu, wzorowania i odporności narządów podczas rozwoju. Składające się z około 800 wysoko uporządkowanych ommatidiów, oko muchy zapewnia czuły i mierzalny odczyt zaburzeń genetycznych wpływających na proliferację, różnicowanie i organizację tkanek ^1,2,3. Genetyczna manipulacja rozwoju oczu historycznie dostarczała fundamentalnych wglądów w zachowane szlaki sygnalizacyjne. Badania przełomowe wykazały, że ektopowa ekspresja czynnika transkrypcyjnego eyeless wystarcza, aby wywołać formowanie się oka w tkankach niesiatkówkowych, ustanawiając oko jako wzorzec specyfikacji narządów i plastyczności⁴. Kolejne badania zidentyfikowały szlak sygnalizacyjny D. melanogaster Hippo jako centralny regulator wielkości i liczby komórek oka poprzez skoordynowaną kontrolę proliferacji i apoptozy ^5,6. Równolegle, wykazano, że sygnalizacja Hedgehog i BMP reguluje progresję morfogenetyki, precyzję wzrostu oraz wzorce przestrzenne w rozwijającej się siatkówce ^7,8.

Jednak wykonywanie zdjęć o wysokiej wierności dorosłego oka złożonego stanowi poważne wyzwania optyczne ze względu na jego wypukłą, półkulistą geometrię. Standardowa mikroskopia jasnego pola jest ograniczona przez płytką głębię ostrości, co uniemożliwia jednoczesne skupienie ostrości na najbardziej grzbietowym punkcie (biegunie) i krawędziach (równiku) oka w jednej ekspozycji⁹. To ograniczenie często skutkuje obrazami, w których znaczne części powierzchni siatkówki są rozmyte, co utrudnia zastosowanie narzędzi do analizy obrazów o wysokiej rozdzielczości i uczenia maszynowego, zaprojektowanych do ilościowego określania zróżnicowanych fenotypów. Aby w pełni scharakteryzować powierzchnię siatkówki, cała krzywizna musi być zobrazowana bez artefaktów optycznych. Dlatego wymagana jest metoda obrazowania, która zachowuje naturalną morfologię oka i umożliwia wizualizację całej zakrzywionej powierzchni siatkówki w wysokiej rozdzielczości.

Ponadto tradycyjne metody przygotowywania próbek do mikroskopii często naruszają integralność strukturalną głowicy muchy. Tradycyjne techniki montażowe często opierają się na klejach, które mogą zaciemniać detale powierzchni lub wymagają fizycznej manipulacji pęsetą, która wywiera nacisk na kapsułę głowicy. Jak zauważono w badaniach morfogenezy siatkówki, integralność strukturalna oka jest kluczowa. Bezpośrednie ciśnienie lub przebicie powoduje wyciek hemolimfy, co prowadzi do utraty ciśnienia wewnętrznego i późniejszego zapadania się lub "wgniecenia" powierzchni oka. Te artefakty mechaniczne mogą naśladować fenotypy neurodegeneracyjne lub wady genetyczne, prowadząc do fałszywie pozytywnych wyników w dużych badaniach przesiewowych. Celem tego protokołu jest zapewnienie niedestrukcyjnego montażu i procesu obrazowania do wizualizacji w wysokiej rozdzielczości nienaruszonych oczu złożonych Drosophila.

Przedstawiamy tutaj szybki i powtarzalny proces obrazowania, który umożliwia wysokorozdzielczą wizualizację nienaruszonych oczu złożonych Drosophila oraz morfologii całej głowy bez bezpośredniego kontaktu z głową. W tej metodzie dorosłe muchy są unieruchomiane za pomocą elastycznej strategii montażu klejowego, która zabezpiecza ciało i skrzydła, pozwalając na stabilne ustawienie w pozycji bocznej — aby uchwycić pełną krzywiznę pojedynczego oka — lub w orientacji czołowej — w celu oceny symetrii całej głowy i cech międzyocznych. Ta wszechstronna strategia montażu minimalizuje uszkodzenia mechaniczne i zachowuje naturalną geometrię oka w trzech wymiarach. W połączeniu ze stereomikroskopią światła odbitego, akwizycją stosu Z oraz rozszerzoną rekonstrukcją głębi ostrości⁹, to podejście generuje jednolicie ostre, wysokiej jakości obrazy z wielu perspektyw, odpowiednie zarówno do inspekcji jakościowej, jak i ilościowej analizy fenotypowej. Metoda ta jest szczególnie odpowiednia do badań zaburzeń genetycznych, fenotypów rozwojowych oraz wysokoprzepustowego przesiewowego przesiewu morfologii oka u Drosophila.

Protocol

1. Zbieranie próbek i synchronizacja

UWAGA: Aby zapewnić porównywalność eksperymentalną, wymagana jest ścisła kontrola czasu ekluzji. W standardowych warunkach hodowli w temperaturze 25 °C eklosja zazwyczaj następuje 10 do 12 dni po złożeniu jaj. Poczwarki powinny być uważnie obserwowane w tym okresie, ponieważ ciemnienie obudowy poczwarki wskazuje na rychłą eklekcję.

1. Metoda bezpośredniego natapiania (metoda standardowa)
   1. Delikatnie stuknij standardową plastikową fiolkę Drosophila o wymiarach 24 x 95 mm (zamkniętą piankowym korkiem) o miękką podkładkę, aby wypchnąć dorosłe muchy na dno.
   2. Szybko wyjmij korek i wyrównaj otwor świeżej fiolki z fiolką hodowlą.
   3. Odwróć ustawienie, żeby fiolka kultury była na górze. Delikatnie stuknij w ściany, aby przenieść muchy do fiolki zbierającej.
      UWAGA: Ta metoda nie jest zalecana, jeśli standardowe podłoże z mąki kukurydzianej i agaru jest wilgotne, ponieważ świeżo zamknięte muchy łatwo łapać i zabijać. Aby zminimalizować śmiertelność, najpierw zbieraj muchy do pustej fiolki o wymiarach 24 x 95 mm. Po znieczuleniu (Krok 3) przenieś muchy na wewnętrzną ścianę fiolki o wymiarach 24 x 95 mm zawierającej świeże podłoże pokarmowe.
2. Metoda transferu geotaksji ujemnej (metoda antyadhezyjnej)
   1. Wyjmij korek z świeżej fiolki i odwróć go na blacie, aby zapobiec wejściu przypadkowych much.
   2. Trzymaj fiolkę z otworem skierowanym w dół. Muchy wspinają się w górę w stronę jedzenia, z dala od otworu.
   3. Gdy otwór jest wolny od much, szybko odkorkuj fiolkę hodowlę i wyrównaj ją z odwróconą pustą fiolką o wymiarach 24 x 95 mm na stole.
   4. Delikatnie stuknij punktem połączenia o blat, aby wrzucić muchy do fiolki zbierającej.
      UWAGA: Ta metoda znacząco zmniejsza śmiertelność spowodowaną przyczepnością pokarmu, ale jest bardziej czasochłonna niż bezpośrednie pobieranie pokarmów.
3. Metoda znieczulenia CO₂ (metoda wysokiej efektywności)
   1. Odwróć fiolkę hodowlową tak, aby korek był skierowany w dół.
   2. Ostrożnie włóż igłę pistoletu do znieczulenia CO₂ między korek a ściankę fiolki.
   3. Delikatnie włącz pedał nożny i ręczny zawór, aby uwolnić 100% CO₂ przy niskim, łagodnym przepływie.
   4. Gdy muchy zostaną znieczulone i spadną na korkę, umieść fiolkę z hodowlą poziomo. Usuń korek, wyrównaj się z pustą fiolką zbiorczą i delikatnie stuknij w fiolkę hodowlową, aby przenieść znieczulone muchy do fiolki.
      UWAGA: Nadmierny przepływ powietrza może zdmuchnąć muchy na powierzchnię pokarmu, powodując przyczepność i śmierć; ściśle utrzymuje delikatny przepływ_CO2 wystarczający, by znieczulić muchy bez ich fizycznego przemieszczania. Monitor obserwuje blisko wczesnych oznak rekonwalescencji, takich jak subtelne drganie lub ruch skrzydeł i nóg.
4. Oznakowanie i konserwacja
   1. Oznacz fiolkę zbiorową płcią, datą pobrania, datą eklozji, genotypem i warunkami hodowli.
   2. Rozdzielenie płci: Jeśli obrazowanie much starszych niż 10 dni jest rozdzielone, samce i samice rozdzielają do różnych fiolek z pokarmem, aby zapobiec godowaniu i powstaniu pokolenia F2, które mogłoby zakłócić środowisko eksperymentalne.
      UWAGA: Muchy można utrzymywać w tych fiolkach zawierających pokarm w dawnych warunkach hodowli (np. 25 °C) aż osiągną pożądany wiek do badania obrazowego.

2. Przygotowanie płyty montażowej

1. Uzyskaj czyste, standardowe szkiełko mikroskopowe.
2. Wytnij pasek białej taśmy maskującej z papieru, około 2 cm dłuższy niż slajd.
3. Przyklej taśmę na suwak tak, że strona klejąca jest skierowana do góry (strona nieprzyklejająca do szkła). Upewnij się, że taśma wystawa na zasuw o około 1 cm na obu końcach.
4. Zabezpiecz wystające końce, owijając dwa dodatkowe paski taśmy o grubości ~5 mm ciasno wokół tylnej części zamka.
5. Upewnij się, że powierzchnia kleju jest płaska, napięta i wolna od zagnieceń.
6. Etykietowanie: Oznacz wskaźniki orientacji (np. "Góra/Góra" i "Dolna/Dolna") lub identyfikatory próbek na nieklejących końcach taśmy, aby ułatwić orientację i śledzenie próbek pod mikroskopem.
   UWAGA: Wybierając muchy do obrazowania, unikaj osobników z istotnymi różnicami w rozmiarze ciała. Nawet przy identycznym powiększeniu, różnice rozmiaru ciała mogą skutkować nieporównywalną powierzchnią oczu złożoną.

3. Eutanazja i montaż

1. Eutanazja
   1. Przełóż muchy do szczelnej i pustej fiolki do zbierania.
   2. Umieść szczelnie zamkniętą fiolkę w zamrażarce o temperaturze -80 °C na 15–20 minut.
      UWAGA: Nigdy nie przebijaj ani nie ściśniaj rozporka ostrymi końcówkami cienkiej pęsety. Nawet niewielki wyciek hemolimfy powoduje gwałtowną utratę wewnętrznego ciśnienia hydrostatycznego, prowadząc do natychmiastowego wgniecenia i nieodwracalnego zapadania się złożonego oka, co niszczy jakość obrazowania.
2. Montaż dla widoku bocznego (pojedyncze oko złożone)
   1. Pozycjonowanie: Pod standardowym stereomikroskopem (np. Nikon SMZ745) użyj pęsety cienkopunktowej, aby ustawić uśpioną muchę w pozycji bocznej (leżącej bokiem).
   2. Przeniesienie: Używając cienkiej pęsety, delikatnie chwyć rozlot za skrzydło (utrzymując boczną postawę) i przenieś go na przygotowaną klejową płytkę montażową.
   3. Fiksacja: Przyklej jedną stronę korpusu muchy do taśmy klejącej. Rozłóż skrzydła i przyklej je płasko do taśmy, aby zwiększyć stabilność.
   4. Zarządzanie kończynami: Podczas montażu upewnij się, że nogi nie zasłaniają oczka złożonego. Jeśli przednie nogi zasłaniają pole widzenia, użyj pęsety, aby ostrożnie odsunąć je od oka i mocno przykleić do taśmy (np. wyciągając je w dół lub chowając pod klatką piersiową).
   5. Zabezpieczenie: Przechyl pęsetę i użyj boku końcówki (nie ostrego końca), aby delikatnie przycisnąć korpus do taśmy, aby zapewnić solidne połączenie.
   6. Precyzyjna regulacja: Sprawdź, czy głowica jest pozioma. Jeśli oko nie znajduje się na jednej płaszczyźnie ogniskowej, użyj pęsety do mikroregulacji kąta ciała.
3. Montaż dla widoku z przodu (cała głowa)
   1. Ustawienie: Na poduszce znieczulniowej ustaw rozlot w pozycji brzusznej do dołu (na brzuchu).
   2. Transfer: Użyj pęsety, aby chwycić jedno skrzydło i podnieść rozporek. Przenieś go na klej mocujący.
   3. Początkowe umocnienie: Delikatnie rozłóż oba skrzydła na zewnątrz (w lewo i prawo) i mocno przyciskaj je do powierzchni klejącej, aby zakotwiczyć muchę.
   4. Stabilizacja ciała: Delikatnie naciśnij na tułów, aby zapewnić pełny kontakt z płytką klejącą. Użyj pęsety, aby lekko chwycić tylny odbrzuch (ogon) i delikatnie pociągnąć, aby wyprostować oś ciała, zanim przykleisz brzuch do taśmy.
   5. Orientacja głowy: Reguluj kąt głowicy za pomocą cienkiej pęsety, aby upewnić się, że płaszczyzna frontalna (powierzchnia) jest równoległa do powierzchni klejącej. Oba złożone oczy powinny być w wysokości i widoczne w tej samej płaszczyźnie ogniskowej.
4. Układ
   1. Zamontuj kilka much w równoległych rzędach lub w siatkowatej tablicy na powierzchni klejnej. Upewnij się, że pojedyncze muchy nie nakładają się na siebie, aby zapobiec zakłóceniom stosu Z, choć dozwolone jest zwarte upakowanie, aby zmaksymalizować przepustowość (np. 20–30 much na zjeżdżalnię). Ustaw wszystkie muchy tak, by ich głowy były skierowane w tym samym kierunku (jak wskazuje etykieta w kroku 2.6), aby ułatwić systematyczne obrazowanie.
   2. Przygotuj oddzielne matryce próbek do obrazowania bocznego i czołowego, używając różnych zestawów uśpionych much z tej samej kohorty. Po przyklejeniu muchy do taśmy nie można jej bezpiecznie usunąć ani przestawić bez poważnych uszkodzeń mechanicznych preparatu; dlatego wielu widoków nie może być kolejno obrazowanych z perspektywy tej samej osoby.
      UWAGA: Zaleca się pobieranie zdjęć bezpośrednio po eutanazji i montażu, aby zapobiec wysychaniu tkanek.

4. Akwizycja obrazu

1. Uruchamianie i inicjalizacja systemu obrazowania stereomikroskopowego z motoryzacją
   1. Włączaj komputer, monitor i mikroskop kolejno.
   2. Uruchom oprogramowanie LAS X.
   3. Gdy pojawi się komunikat "Inicjalizuj/Samodzielnie testuj", upewnij się, że przestrzeń pod celem jest wolna od przeszkód i kliknij Potwierdź. Pozwól mikroskopowi wykonać pełny ruch kalibracji osi Z.
      UWAGA: Poniższe kroki są zoptymalizowane pod stereomikroskop z systemem oprogramowania LAS X.
2. Rozmieszczenie próbek i oświetlenie
   1. Przenieś przygotowaną płytę montażową na podstawę zmotoryzowanego stereomikroskopu, ręcznie ustawiając ją tak, aby pierwsza próbka w matrycy była wycentrowana pod obiektywem aparatu cyfrowego.
   2. Włącz światło transmisyjne (podstawowe) i padające światło (górne). Do złożonego obrazowania oka głównie używaj światła odbitego (Reflect). Reguluj przysłonę, aby zapewnić równomierne oświetlenie.
3. Konfiguracja oprogramowania
   1. Ustaw tryb pozyskiwania na stos Z. W ustawieniach projektu ustaw priorytet ruchu wielowymiarowego na 'Z-first', aby zapewnić ciągłą i stabilną pracę napędu silnikowego.
   2. Ustaw tryb obrazowania na Światło Odbite.
   3. Włącz rozszerzoną głębię ostrości (EDF), aby umożliwić syntezę w pełni ostrego obrazu.
   4. W zaawansowanych ustawieniach obrazu włącz wysoki zakres dynamiczny (HDR). Zaleca się to, aby zminimalizować światła zwierciaste i nadmierne naświetlanie, które często powoduje silnie refleksyjna, chitynowa powierzchnia oka złożonego.
4. Pozycjonowanie i balans bieli
   1. Reguluj powiększenie do odpowiedniego poziomu (np. współczynnik zoomu 16x dla widoku bocznego z pojedynczym okiem i 12,5x dla widoku całej głowy z przodu), zapewniając, że konkretny obszar zainteresowania zajmuje 1/2 do 2/3 pola widzenia.
   2. Ręcznie ustaw płytkę montażową, aby umieścić tułów muchy w centrum pola widzenia.
   3. Wykonaj kalibrację balansu bieli za pomocą tułowia, aby skorygować temperaturę barwową.
5. Parametry ekspozycji i obrazowania (wartości referencyjne)
   Ekspozycja: 60–80 ms.
   Wzmocnienie: 0–5 (utrzymuj niski, aby zminimalizować szumy).
   Intensywność: 60%–80%.
   Rozmiar kroku stosu Z: standardowy: 8–12 μm.
   UWAGA: Dla gładkich, zdrowych oczu złożonych (np. w¹¹¹⁸ × GMR-GAL4) wystarczą kroki do 15 μm, ponieważ ciągła i regularna krzywizna wymaga mniejszej liczby przekrojów optycznych. Jednak dla fenotypów szorstkich lub nierównych oka charakteryzujących się nagłymi zmianami topologicznymi wymagane są mniejsze kroki (nawet do 5 μm), aby uchwycić drobne szczegóły strukturalne i znacząco poprawić dokładność rekonstrukcji EDF.
6. Definicja i przechwytywanie stosu Z
   1. Dla widoku bocznego: Ustaw zakres stosu Z od krawędzi orbitalnej (Start) do środkowej ommatidium (End), używając kroku 8–12 μm.
   2. Dla widoku frontalnego: Reguluj pokrętło ostrości tak, aby zewnętrzny kontur oczu złożonych był tylko ostry (Start). Reguluj ostrość w przeciwnym kierunku, aż centralne oczka (żółte proste oczy) na czubku głowy są tylko ostre (End). Kliknij Set End.
   3. Kliknij Stop Live , aby zamrozić podgląd.
   4. Kliknij Start Acquisition. System automatycznie uchwyci zdefiniowane płaszczyzny ogniskowej i zsyntetyzuje obraz o wysokiej rozdzielczości, w pełni ostrym obrazem.
7. Zapisywanie plików:
   1. Po zakończeniu rekonstrukcji EDF kliknij ikonę Zapisz w interfejsie oprogramowania (lub przejdź do File > Save As).
   2. Wybierz katalog docelowy, wpisz przypisaną nazwę pliku i kliknij Zapisz.
   3. Należy zauważyć, że każde akwizycyjne generuje trzy odrębne pliki obrazu: a. Obraz RAW/kanałowy (w skali szarości);b. Kolorowy podgląd obrazu; c. Obraz kompozytowy EDF (z przyrostkiem "_Composite")
      UWAGA: Zarówno obraz surowy/kanałowy, jak i obraz kompozytowy EDF powinny być zachowane do analizy i dokumentacji

Results

Cały proces eksperymentalny, od pobierania próbek do pozyskiwania obrazu, jest podsumowany na Rysunku 1. Efektywność zmodyfikowanego protokołu jest demonstrowana poprzez tworzenie matryc próbek o wysokiej gęstości. Jak pokazano na Rysunku 2A, 20–30 znieczulonych much można ułożyć w siatkowatym wzorze na jednej platformie z odwróconą taśmą. Znaczniki orientacji zapisane na nieklejących końcach taśmy zapewniają spójną kierunkowość głowic, co ułatwia szybkie i syst...

Discussion

Złożone oko Drosophila pełni funkcję potężnego odczytu fenotypowego do badań genetycznych, gdzie zauważalne zmiany rozmiaru, szorstkości lub pigmentacji oka^często wskazują na zaburzenia w podstawowych szlakach sygnalizacji, takich jak Hippo ^5,6 czy Hedgehog⁷. Jednak efektywność takich ekranów od dawna była ograniczana przez ograniczenia t...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Butla gazowa z dwutlenkiem węgla (CO2	Lokalny dostawca	Nie ma
CO2 dmuchawka do znieczulenia	T& L	DG-08
Cyfrowy aparat mikroskopowy	Leica	DMC6200
Delikatne pęsety	VETUS	MOS-167B
Piankowe korki	Dongpeng	Nie ma
Oprogramowanie do akwizycji obrazu (LAS X)	Leica	3.7.1
Oprogramowanie do przetwarzania obrazu (FIJI/ImageJ)	NIH	Open source
Oświetlenie kopuły LED	Leica	LED5000 HDI
LED Gooseneck iluminator	cossim	LG-10
Zmotoryzowany stereomikroskop	Leica	M205 FCA
Soczewka obiektywowa	Leica	1.0x PlanApo NA0.2
Pneumatyczny zawór pedału nożnego	DELIXI	FV-320
Standardowe fiolki z kulturą Drosophila	LAIBOER	2424951
Standardowe podłoże pokarmowe Drosophila	Nie ma	Mąka kukurydziana-agar-melasa
Standardowe szkiełka mikroskopowe szklane	Citotest	10127101P-G
Standardowy stereomikroskop	Nikon	SMZ745
Taśma maskująca z białego papieru	UBWIN	Szerokość 25 mm