Method Article

Przestrzennie rozdzielone, zintegrowane profilowaniu wieloomowe z pojedynczymi komórkami transkryptomu i epigenomicznych celów w zamrożonych sekcjach tkankowych

DOI:

10.3791/71046

⸱

June 12th, 2026

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Enteric Neuroscience Program and Department of Physiology and Biomedical Engineering, Mayo Clinic College of Medicine and Science, 2Gastroenterology Research Unit, Division of Gastroenterology and Hepatology, Department of Medicine, Mayo Clinic College of Medicine and Science, 3Division of Computational Biology, Department of Quantitative Health Sciences, Mayo Clinic College of Medicine and Science, 4Division of Experimental Pathology and Laboratory Medicine, Department of Laboratory Medicine and Pathology, Mayo Clinic College of Medicine and Science

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

To badanie przedstawia przestrzenny protokół Trekker–CUT&Tag multiome, łączący bezpośrednie przestrzenne kodowanie sekcji tkanki z analizą wielodostępu pojedynczych komórek. To podejście umożliwia przestrzennie rozdzielone profilowanie pojedynczych komórek ekspresji genów i modyfikacji histonu H3K27ac jednocześnie, oferując mechanizmy wglądu w regulację genów w kontekście mikroanatomii tkanki.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Technologie przestrzenne multiomiczne w połączeniu z profilowaniem pojedynczych komórek oferują bezprecedensowe możliwości wyjaśnienia molekularnej i komórkowej architektury złożonych tkanek. Połączenie przestrzennego kodowania jąder w pojedynczych krojach kryogenicznych przygotowanych z bloków tkankowych osadzanych w optymalnym medium zamrażającym (OCT) z pojedynczymi pomiarami multiomicznymi w pojedynczej komórce w prosty i wydajny przepływ pracy może ułatwić adnotacje i przestrzennie rozdzieloną analizę molekularną komórek w typach tkanek. To badanie opisuje przestrzenny podejście do rozszczepienia pod celami i tagmentacji (CUT&Tag) multiomowi, które jednocześnie opisuje modyfikację histonu H3K27ac i ekspresję genów na pojedynczej zamrożonej sekcji mózgu. Po przestrzennym kodowaniu, pojedyncze jądra są izolowany i poddany CUT&Tag, połączonemu chwytaniu tagmentowanych DNA, RNA i przestrzennych kodów kreskowych, przygotowaniu biblioteki i sekwencjonowaniu. Przepływ pracy generuje przestrzennie adnotowany profil epigenomowy i transkryptomowy z tych samych jąder, umożliwiając przypisanie informacji multiomicznych do współrzędnych anatomicznych. Integracja informacji epigenomowych z danymi przestrzennymi transkryptomowymi zwiększa wiarygodność identyfikacji typów komórek i ujawnia przestrzennie zorganizowane programy regulacyjne i interakcje międzykomórkowe w nietkniętych tkankach.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Biologia przestrzenna to dziedzina szybko rozwijająca się, która mapuje lokalizację, organizację i interakcje cząsteczek, komórek i tkanek w ich naturalnych środowiskach1,2,3. W przeciwieństwie do metod masowych lub konwencjonalnych jednokomórkowych, które wymagają dysocjacji tkanki i powodują utratę informacji o pozycji, podejścia przestrzenne zachowują współrzędne fizyczne analitów lub komórek/jąder, umożliwiając bezpośrednie badanie, jak architektura tkanki wpływa na tożsamość komórkową, komunikację międzykomórkową i funkcję biologiczną4,5,6,7. Podczas gdy przestrzenna transkryptyka i przestrzenna proteomika są obecnie najczęściej stosowanymi modalnościami, dziedzina szybko rozwija się w kierunku przestrzennego profilowania multi-omicznego3,8,9. Współprofilowanie ekspresji genów i stanów epigenomicznych w tej samej tkance jest szczególnie potężne, ponieważ bezpośrednio łączy produkt transkrypcji z mechanizmami regulacyjnymi—takimi jak dostępność chromatyny i modyfikacje histonów—które rządzą aktywnością genów i są znane z tego, że różnią się w różnych domenach przestrzennych10,11,12. Dlatego zintegrowana analiza przestrzennego epigenomu i transkryptomu zapewni kluczowe wglądy w sposób, w jaki programy regulacyjne kształtują tożsamość komórkową i organizację tkanki.

Opracowano kilka strategii przestrzennego multiomiku, aby umożliwić jednoczesne profilowanie epigenomiczne i transkryptomowe. Deterministyczne kodowanie kreskowe w sekwencjonowaniu tkanki (DBiT-seq) wykorzystuje kanały mikrofluidyczne do dostarczania kodów kreskowych przestrzennych bezpośrednio lub pośrednio, poprzez tłoczenie z żelowymi płytkami, do sekcji tkanki, umożliwiając przestrzenne oznaczanie analitów. To podejście ułatwia przestrzennie rozdzielone współprofilowanie cech epigenomicznych i transkryptomowych12,13,14,15. Metoda Slide-tag, komercyjnie dostępna jako platforma Takara Trekker, bezpośrednio wprowadza kody kreskowe przestrzenne do nienaruszonej tkanki przed dysocjacją, umożliwiając przestrzennie indeksowanemu jądru przetwarzanie za pomocą standardowych przepływów jednokomórkowych i projektowanie komputerowe z powrotem do ich oryginalnych współrzędnych tkanki16. W przeciwieństwie do tego, przestrzenny test na dostępność chromatyny, linie komórkowe i ekspresja genów z sekwencjonowaniem (SPACE-seq) stosuje strategię target-out, w której poli(A)-ogonkowane cele epigenetyczne i mRNA są uchwytywane na poli-dT sekwencjonującej sekwencyjującej w przestrzennych płytkach transkryptomu17.

Rozcinanie pod celami i tagowanie (CUT&Tag) to potężne narzędzie do mapowania interakcji między DNA i histonami lub białkami nie-histonowymi z bardzo niskiej ilości próbki18. CUT&Tag opiera się na fragmentacji chromatyny i oznaczaniu DNA (tagowaniu) z podziałem Tn5 transpomazowym, stosując Tn5 związany z przeciwciałami i proteiną A do cięcia specyficznego dla lokusu i oznaczania molekularnego. Podczas gdy konwencjonalne badanie CUT&Tag obejmuje wiele kroków inkubacji i płukania, uproszczony i usprawniony przepływ CUT&Tag został wykorzystany do poprawy wydajności CUT&Tag w dalekosiężnych zastosowaniach jednokomórkowych multiome19.

figure-introduction-1
Rysunek 1: Przegląd przepływu i kontroli jakości przestrzennego testu Trekker–CUT&Tag multiome. (A) Schematyczny diagram przepływu przestrzennego Trekker–CUT&Tag multiome. Koronalny przekrój świeżo zamrożonego tkanki mózgu myszy jest zamontowany na przestrzennej płytce Trekker i poddany przestrzennemu kodowaniu kreskowemu. Po lizie tkanki, jądra są izolowany i oceniany pod względem wydajności i jakości. Około 50 000 jąder jest użytych do CUT&Tag H3K27ac, a tagmentowane jądra są poddawane jednokomórkowemu kodowaniu kreskowemu za pomocą żelowych pereł 10x Genomics Chromium Multiome po przeliczeniu. Pre-amplifikowana jednokomórkowa DNA jest zakodowana kreskowo i podzielona na dwie frakcje. Skatalogizowana biblioteka CUT&Tag jest generowana bezpośrednio przez indeks PCR. Dla bibliotek ekspresji genów i kodów kreskowych przestrzennych, pre-amplifikowana DNA jest dalsza amplifikowana i selekcjonowana pod względem wielkości. Fragmenty odpowiadające typowym rozmiarom cDNA są używane do przygotowania biblioteki ekspresji genów, podczas gdy krótsze fragmenty DNA są używane do wygenerowania biblioteki kodów kreskowych przestrzennych. Biblioteki są se

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Myszy dorosłe zostały uśpione poprzez wdychanie CO2 (IACUC #: A48315-15-R24) przed pobraniem tkanki. Mózgi zostały usunięte in toto po przeprowadzeniu craniectomii w płaszczyźnie strzałkowej i usunięciu połowy kości czaszki. Reagenty i sprzęt użyty są wymienione w Tabeli Materiałów.

1. Montaż sekcji tkanki na płytce kodowej Trekker do przestrzennego kodowania kreskowego

  1. Przygotuj następujące elementy przed rozpoczęciem.
    1. Równoważ temperaturę optymalnego cięcia (OCT)-zakonserwowaną tkankę przed sekcjonowaniem w cryostat. Przygotuj bufor do kleizenia UV, dysocjacji tkanki i izolację jąder.
      UWAGA: Optymalna temperatura do sekcjonowania może się różnić w zależności od rodzaju tkanki.
    2. Do izolacji jąder, wstępnie schłodź wirówkę z wirującymi wkładkami do 4 °C. Schłodź 12-dołkową płytkę z pierścieniem O-ring Trekker na lodzie.
    3. Ustaw licznik UV na maksymalnym limicie prądu (1,2 A) i maksymalnej mocy.
  2. Zapisz ID płytki kodowej przestrzennej (np. U0001_001) płytki Trekker do użycia.
    UWAGA: Każda płytka Trekker zawiera unikalne współrzędne kodu kreskowego. ID płytki jest wymagane do odzyskania odpowiedniego pliku do przestrzennego mapowania kodu kreskowego danych sekwencjonowania.
  3. Przeprowadź sekcjonowanie tkanki. Przekroj koronny o grubości 25 μm w przybliżeniu na poziomie bregma -1 mm został przeprowadzony w temperaturze -18 °C (Rysunek 1A).
    UWAGA: Grubość można zwiększyć do 30 μm podczas pracy z tkankami o niskiej gęstości komórkowej.
  4. Umieść sekcję (lub region zainteresowania) na płytce przestrzennej i stopień ją, delikatnie umieszczając palec na dnie szkiełka slajdowego.
    UWAGA: Jeśli to konieczne, sprawdź procedury za pomocą pomiarów kontroli jakości jąder przy użyciu płytki szkoleniowej Trekker.
  5. Za pomocą szczypiec usuń płytkę z kleju i umieść ją w dołku płytki kultury tkankowej 12-dołkowej na lodzie na pierścieniu O-Ring Trekker. Natychmiast zakrop 30 μL buforu do kleizenia UV Trekker na płytce, upewniając się, że cała tkanka jest pokryta buforem.
  6. Umieść lampę UV (ustawienie 1,2 A) na płytce bezpośrednio nad dołkiem. Oświetl przez 1 min, aby uwolnić kody kreskowe, trzymając wszystko na lodzie.
    UWAGA: Podczas pracy z lampą UV nosić ochronne okulary przeciwsłoneczne.
  7. Wyłącz lampę UV i inkubauj płytkę na lodzie przez 7,5 min. Podczas inkubacji wyjmij komorę do mycia Trekker 10 x 10 i wypełnij komory 1 i 2 400 μL zimnego buforu do mycia jąder Trekker dla próbki na lodzie.
  8. Z zachowaniem ostrożności, podnieś płytkę za pomocą szczypiec bez dotykania perełek i wypłucz płytkę w komorze 1 przez 5 s. Wypłucz płytkę w komorze 2 przez 5 s. Ostrożnie umieść płytkę w dołku na płytce 12-dołkowej na lodzie. Sekcja tkanki powinna być zabarwiona na niebiesko i łatwo widoczna.

2. Dysocjacja tkanki i izolacja jąder

  1. Wydaj 175 μL buforu Invent Minute A na tkankę. Powtórz 3 razy więcej, aby uzyskać łącznie 700 μL. Przy każdym wydawaniu, celuj w różne części płytki, aby oddzielić całą tkankę od płytki.
    UWAGA: Unikaj kontaminacji perełek przez drapaniec płytki lub spadanie perełek.
  2. Kontynuuj dysocjację tkanki z płytki, aspirując bufor z boku dołka i wydając go na regiony płytki pokryte tkanką, trzymając płytkę na lodzie tak długo, jak to możliwe. Powtórz, aż nie pozostanie żadna tkanka na płytce. Gdy cała tkanka zostanie usunięta z płytki, delikatnie przenieś płytkę do pustego dołka za pomocą szczypiec.
  3. Za pomocą pipety P1000 mechanicznie dysocjuj jądra wielokrotnym trytowaniem w tym samym dołku. Powtórz, aż nie pozostaną widoczne fragmenty tkanki.
  4. Delikatnie przenieś zawiesinę jąder do kartridżu filtratorskiego z rurką do odbiornika z zestawu izolację pojedynczych jąder Invent Minute dla tkanek/komórek neuronalnych. Inkubuj rurkę z otwartą pokrywką w temperaturze -20 °C przez 10 min. Zakorkuj kartridż filtratorski i natychmiast wyśrodkuj w temperaturze 13 000 x g przez 30 s w chłodnicy mikrowirówkowej.
  5. Wyrzuć kartridż filtratorski i resuspenduj pellet przez delikatne pipetowanie 10-20 razy. Wyśrodkuj rurkę w wstępnie schłodzonej wirówce z wirującymi wkładkami w temperaturze 600 x g przez 5 min. Ostrożnie usuń nadstan i resuspenduj pellet w 200 μL buforu Trekker C.
  6. Dodaj 1 mL zimnego buforu Invent Minute B do 1,5 mL rurkę Eppendorf o niskiej wiązliwości i delikatnie nałożyć 200 μL zawiesiny

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Używając przekroju koronowego (grubość 25 µm, około 70% pokrycia płaszczyzny 10 × 10 mm) świeżo zamrożonej tkanki mózgu myszy, opisany tutaj proces pracował konsekwentnie, uzyskując 50 100 wysokiej jakości jąder (SD = 12 200, n = 8), co jest wystarczającą liczbą dla dalszego profilowania pojedynczych komórek w zakresie multiomiki (Rysunek 1). Po przeprowadzeniu barkodowania przestrzennego sekcji tkanki za pomocą Trekker, jądra zostały wyizolowane za pomocą delikatnego rozdzielania tkanki i dalszej oczyszczono za pomocą zestawu do izolację pojedynczych jąder Invent. Procedura ta skutkowała minimalnymi zanieczyszczeniami i niskim poziomem agregacji jąder, produkując preparaty jąder nadające się do analiz pojedynczych komórek. Reprezentatywne obrazy izolowanych jąder są przedstawione na Rysunku 2.

Do dalszych analiz pojedynczych jąder, w tym do profilowania multiomu CUT&Tag (CUT&Tag + ekspresja genów), tutaj zazwyczaj przetwarzano około 50 000 jąder. Aby zmaksymalizować odzyskiwanie jąder, zaimplementowano uproszczony, skomplfikowany protokół CUT&Tag o niskiej zawartości, używając bezpośredniego ukierunkowania przeciwciał-pA/Tn5 i tagmentacji, minimalizując tym samym czasy inkubacji i etapy płukania19. Używając tego podejścia, odzyskiwano około 25 000 tagmentowanych jąder, co odpowiadało średniemu wskaźnikowi 48,3% (SD = 6,1, n = 3). Te jądra następnie były używane do kodowania pojedynczych komórek za pomocą koralików żelowych 10x Genomics Chromium Multiome. W celu wygenerowania GEM, zazwyczaj przetwarzano około 15 000 jąder, z oczekiwaniem odzyskania ~10 000 przestrzennie skorygowanych jąder po filtrowaniu jakościowym. Na podstawie dekodowania barkodów przestrzennych Trekker, 81,3% jąder (SD = 9, n = 3) z pojedynczego zestawu danych mogło zostać pewnie przypisane do położeń przestrzennych w obrębie płaszczyzny.

Przestrzenny proces Trekker-CUT&Tag multiomu generuje trzy skorygowanych biblioteki: CUT&Tag, ekspresję genów i biblioteki barkodów przestrzennych. Przednamplifikowane DNA z barkodami zostało podzielone na dwie frakcje, z których każda została użyta do przygotowania biblioteki zgodnie z chemią chwytania celów na koralikach żelowych. Biblioteki CUT&Tag zostały bezpośrednio amplifikować z przednamplifikowanego DNA i wyświetliły rozkłady wielkości fragmentów charakterystyczne dla tagmentacji CUT&Tag, odpowiadające DNA wolnemu od nukleosomów i nukleosomalnemu (Rysunek 3A). Biblioteka wykazała dobre wzbogacenie locus Actb dodatniego na H3K27ac w porównaniu z lokusami genomowymi negatywnymi na H3K27ac20,21 (tj. 68-krotna różnica, przekraczająca 10-krotny próg wcześniej ustalony dla analizy immunoprecypitacyjnej chromatyny-sekwencjonowania H3K27ac20) (Rysunek 3B). Dla bibliotek ekspresji genów i barkodów przestrzennych, przednamplifikowane DNA zostało najpierw amplifikować zgodnie z protokołem amplifikacji cDNA 10x Genomics, a następnie rozdzielono na dwie frakcje na podstawie wielkości fragmentów za pomocą paramagnetycznej czystości pereł. Skorigowana biblioteka barkodów przestrzennych została przygotowana z frakcji wzbogaconej w krótsze fragmenty i wykazała ostry szczyt na oczekiwanej wielkości fragmentu. Biblioteki ekspresji genów wykazały charakterystyczny rozkład wielkości skoncentrowany wokół amplifikowanych fragmentów cDNA (Rysunek 3A).

figure-results-1
Rysunek 4: Pojedyncza komórka i przestrzenna reprezentacja przestrzennego testu Trekker-CUT&Tag multiomu w tkankach mózgu myszy. (A) Identyfikacja typów komórek poprzez analizę pojedynczych komórek. Wykresy UMAP (Uniform Manifold Approximation and Projection) pokazują sklasyfikowane populacje komórek pochodzące z H3K27ac CUT&Tag samodzielnie, ekspresji genów samodzielnie i zintegrowanego zestawu danych multiomu (CUT&Tag + ekspresja genów). (B) Przestrzenna reprezentacja danych multiomu Trekker-CUT&Tag. Jądra z zintegrowanego zestawu danych multiomu są przypisywane do współrzędnych przestrzennych za pomocą barkodów Trekker, ujawniając anatomicznie zorganizowane dystrybucje typów komórek w przekroju tkanki mózgu myszy. Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.

Sekwencjonowane i mapowanie bibliotek CUT&Tag i ekspresji genów było wykonywane za pomocą Cell Ranger ARC v2.0.2 zgodnie z wytycznymi 10x Genomics, podczas gdy biblioteki barkodów przestrzennych były prze

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten protokół opisuje przestrzenny przepływ pracy Trekker-CUT&Tag multiome, który integruje przestrzenną kodowanie, nisko-wejściowe profilowanie CUT&Tag H3K27ac, jednoczesne przechwytywanie wielu docelowych cząsteczek na żelowych perłach 10x Genomics single-cell multiome oraz przygotowanie biblioteki do sekwencjonowania Illumina. Łącząc indeksowanie przestrzenne z epigenomowymi i transkryptonomicznymi odczytami jednokomórkowymi, to podejście eliminuje fundamentalną ograniczenie konwencjonalnych jednokomórkowych przepływów pracy multiome, które nie mają natywnego kontekstu tkankowego. To badanie z powodzeniem demonstruje wykonalność przestrzennego profilowania multiome CUT&Tag (H3K27ac CUT&Tag + ekspresja genów) i ustanawia podstawę dla przestrzennego współprofilowania ekspresji genów oraz docelowych regulatorów, takich jak znaki histonowe i białka związane z chromatyną.

Rygoryzujący kontrolę jakości na wielu etapach przepływu pracy jest niezbędny dla pomyślnej implementacji tego przepływu pracy (Rysunek 1). Chociaż opisany tutaj proces rozpoczyna się od kroków po przekroju, jakość samego przekroju tkankowego jest krytyczna dla optymalnych wyników. Grubość przekroju powinna być dostosowana w oparciu o typ tkanki i oczekiwaną komórkowość. Podczas dysocjacji tkanki i izolacji jąder maksymalizacja wydajności jąder przy zachowaniu integralności jądra jest kluczowa dla ogólnej wydajności przepływów pracy multiome jednokomórkowych opartych na Trekkerze. Niska wydajność jąder może wynikać z nieoptymalnej dysocjacji tkanki, nieefektywnej izolacji jąder lub niewystarczającej grubości przekroju. Zła integralność jąder może wynikać z nadmiernego mechanicznego uszkodzenia, przedłużającego się czasu przetwarzania lub nadmiernego rozkładania. Izolacja jąder stanowi główny punkt rozwiązywania problemów dla pomyślnej implementacji przepływu pracy multiome jednokomórkowego opartego na Trekkerze. Dlatego zaleca się mocno tkankową optymalizację protokołu izolacji jąder przed rozpoczęciem przepływu pracy multiome jednokomórkowego opartego na Trekkerze. Izolowanych jąder należy oceniać ilościowo i jakościowo. Liczenie jąder za pomocą barwników jądrowych zapewnia estymację wydajności, podczas gdy mikroskopowe badanie umożliwia ocenę integralności błony jądrowej, agregacji oraz obecności niejądrowych zanieczyszczeń. Po przygotowaniu biblioteki wszystkie biblioteki powinny być oceniane pod kątem dystrybucji rozmiarów fragmentów i braku dimerycznych adapterów. W przypadku bibliotek CUT&Tag należy oceniać wzbogacenie docelowych regionów genomu nad tłem za pomocą ilościowej PCR, co zapewnia wczesny wskaźnik specyficzności assayu i ogólnej jakości biblioteki przed sekwencjonowaniem. Kontrolę jakości po sekwencjonowaniu jest równie ważna dla dokładnej interpretacji danych multiome przestrzennych. Takie wskaźniki jak współczynniki mapowania, liczba fragmentów na jądro, wzbogacenie miejsca startu transkrypcji, wyniki fragment-in-peak dla CUT&Tag, złożoność genów i głębokość odczytu na komórkę powinny być oceniane zgodnie z zaleceniami 10x Genomics i Takara Trekker. Wspólna ocena tych wskaźników w obu trybach epigenomowych i transkryptonomicznych umożliwia identyfikację artefaktów technicznych i zapewnia niezawodną integrację informacji przestrzennych, epigenomowych i transkrypcyjnych.

Mimo że wykonalność podejścia opartego na barkodzie Trekker w połączeniu z jednokomórkowym assayem multiome CUT&Tag jest demonstrowana w tym badaniu, opisane podejście ma również ograniczenia. Na przykład metoda jest obecnie ograniczona do świeżo zamrożonej tkanki, a jej wykonalność została zademonstrowana tylko dla profilowania pojedynczej modyfikacji histonowej (H3K27ac) w jednym typie tkanki (mózg myszy) bez replikat biologicznych. Ponadto podejście opiera się na dwóch komercyjnych platformach (Takara Trekker i 10x Genomics Next GEM Chromium Single Cell Multiome). Dalsza ocena na różnych typach tkanek i dodatkowych znakach epigenetycznych będzie konieczna, aby ocenić szersze zastosowanie, wydajność, ogólność i powtarzalność tej technologii.

Podsumowując, przestrzenny protokół Trekker-CUT&Tag multiome przedstawiony tutaj demonstruje zdolność do przestrzennego jednokomórkowego współprofilowania epigenomowych i transkryptonomicznych cech. Łącząc kodowanie przestrzenne z ugruntowanymi jednokomórkowymi chemiami multiome, umożliwia mechaniczne badanie regulacji genów w całym układzie tkankowym i oferuje potężną platformę dla przyszłych zastosowań biologii przestrzennej. Warto zauważyć potencjalne zastosowania, takie jak ocena wpływu różnych bodźców eksperymentalnych i środowiskowych na epigenetyczną kontrolę ekspresji genów w określonych typach komórek – na przykład skutki stymulacji nerwowej mogą być analizowane w określonych typach neuronów w centralnym i obwodowym układzie nerwowym, lub wpływ na sąsiednie komórki przenikających pro- i anty-zapalnych komórek odpornościowych można ujawnić w chorobach zapalnych i rakach.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

To prace została częściowo wspierana przez granty National Institutes of Health R01 DK142826 (T.O.), R01 DK121766 (Y.H.), R01 DK126827 (T.O.), R01 DK131455 (T.O.; MPI), P30 DK084567 (T.O.: Epigenomics and Spatial Biology Core, Mayo Clinic Center for Cell Signaling in Gastroenterology) oraz Mayo Clinic Presidential Strategic Initiative Fund (T.O.). Agencje finansujące nie miały wpływu na projekt badań, analizę danych, ani przygotowanie manuskryptu. Treść jest wyłączną odpowiedzialnością autorów.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
0.4% Trypan BlueInvitrogenT10282Rozcieńczony z 4% roztworu Trypan Blue (Invitrogen, T10282)
10% Tween 20Bio-Rad1662404
10X Genomics Chromium X instrument10X Genomics1000331RRID:SCR_024537
12-well platesThermo Fisher150200
1X CUT&Tag Nuclei Buffer10x GenomicsPrzygotowane z 20X Nuclei bufferAby uzyskać łączną objętość 110 μL, wymieszaj 5.5 μL 20X Nuclei Buffer (10X Genomics) + 8.25 μL inhibitora RNAse + 1.1 μL 100 mM DTT + 95.15 μL wody bez nukleazy
20X Nuclei Buffer10x Genomics2000207
4% Trypan Blue solutionInvitrogenT10282
5200 Fragment AnalyzerAdvanced AnalyticalM5310AA
ABC atlasopen-sourceN/AOpracowanie: Allen Institute for Brain Science (Seattle, WA)
RRID:SCR_024440
ActivatorEpigenome TechnologyCF1006
Adaptor Ligation Mix10X GenomicsPrzygotowane z buforu ligacyjnego, enzymu, oligonukleotydówAby uzyskać łączną objętość 50 ul mieszanki do ligacji adaptorów, wymieszaj 20 μL buforu ligacyjnego + 10 μL ligazy DNA + 20 μL oligonukleotydów adaptorów
Adaptor Oligos10X Genomics2000094
Amp Mix10X Genomics2000047
Amuletopen-sourceN/AOpracowanie: Ucar Lab (The Jackson Laboratory)
RRID: N/A
Anti-H3K27ac antibodyEpiCypher13-0059Partia przeciwciała jest zweryfikowana dla próbek bulkowych i in situ CUT&Tag assay
RRID:AB_3712075
ATAC Buffer B10X GenomicsPN-2000193
Buffer EBQiagen19086
cDNA Amplification Reaction Mix10X Genomicsprzygotowane z Pre-Amp Mix i primerów 2Aby uzyskać łączną objętość 65 μL mieszanki do amplifikacji cDNA, wymieszaj 50 μL Amp Mix + 15 μL primerów cDNA Feature 2
Cell Ranger Arc v2.0.210X GenomicsN/ARRID:SCR_023897
CFX Opus Real-Time PCR SystemBio-Rad12011319
Chromium Next GEM Chip J10X GenomicsPN 2000264
Chromium Next GEM Single Cell Multiome Gel Bead Kit10X GenomicsPN-1000231
Chromium Next GEM Single Cell Multiome GEM Kit10X GenomicsPN-1000232Zestaw zawiera następujące elementy: Barcoding Reagent Mix, Barcoding Enzyme Mix, Template Switch Oligo, Reducing Agent B, Cleanup Buffer i Quenching Agent
Chromium Recovery Agent10X Genomics220016
Cleanup Buffer10X Genomics2000088
CryostatLeica BiosystemCM1860
DNA Ligase10X Genomics220110
DNA LoBind 1.5 mL tubesEppendorf22431021
Dual Index TT Set A10X GenomicsPN-3000431
Dynabeads® MyOne® SILANE to make Dynabeads Cleanup Mix10X GenomicsPN-2000048Aby uzyskać łączną objętość 200 μL mieszanki do czyszczenia Dynabeads, wymieszaj 182 μL buforu do czyszczenia + 13 μL Dynabeads Myone SILANE + 5 μL Reducing Agent B
Elution Solution I10X GenomicsPrzygotowane z Bufferu EBAby uzyskać łączną objętość 100 μL Elution Solution I, wymieszaj 98 μL Bufferu EB + 1 μL 10% Tween 20 + 1 μL Reducing Agent B
Feature cDNA Primers 210X Genomics2000097
Fragmentation Buffer10X Genomics2000091
Fragmentation Enzyme10X Genomics2000090
Fragmentation Mix10X GenomicsPrzygotowane z Bufferu do fragmentacji i enzymuAby uzyskać łączną objętość 15 μL mieszanki do fragmentacji, wymieszaj 5 μL Bufferu do fragmentacji + 10 μL enzymu do fragmentacji
Gasket, 6-pack10X Genomics370017
GEM Master Mix10X GenomicsPN-1000232Z zestawu Chromium Next GEM Single Cell Multiome GEM Kit (PN-1000232). Aby uzyskać łączną objętość 60 μL GEM Mater Mix, wymieszaj 49.5 μL Barcoding Reagent Mix + 1.1 μL Template Switch Oligo + 1.9 μL Reducing Agent B + 7.5 μL Barcoding Enzyme Mix
GEM-X Single-Cell 3' Feature Barcode Kit10X GenomicsPN 2000047
High Sensitivity NGS Fragment Analysis KitAdvanced AnalyticalDNF-474
Incubation BufferEpigenome TechnologyCF1001Aby przygotować łączną objętość 100 μL buforu do inkubacji CUT&Tag I, wymieszaj 90.5 μL buforu do inkubacji (CF1001, Epigenome Technology) z 1.5 μL permeabilizer, 0.5 μL stabilizatora i 7.5 μL inhibitora RNAse
Invent Minute buffer AInvent Biotechnologies, IncBN-020Z zestawu Minute Single Nucleus Isolation Kit (Cat. BN-020). Aby uzyskać łączną objętość 800 μL bufferu A, wymieszaj 786.4 μL Minute Buffer A + 13.6 μL inhibitora RNAse (Takara Bio)
Invent Minute Buffer BInvent Biotechnologies, IncBN-020Z zestawu Minute Single Nucleus Isolation Kit (Cat. BN-020)

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Spatial MultiomicsSingle Cell ProfilingFrozen Tissue SectionsSpatial BarcodingCUT And TagHistone H3K27acGene Expression ProfilingEpigenomic ProfilingSpatial TranscriptomicsCell Type Identification

Related Articles