Przestrzennie rozdzielone, zintegrowane wielokomórkowe profilowanie wielokomórkowe transkryptomu i celów epigenomowych w przekrojach tkanek zamrożonych

Summary

Niniejsze badanie przedstawia przestrzenny protokół wielokomórkowy Trekker–CUT&Tag, łączący bezpośrednie kodowanie przestrzenne przekroju tkanki z analizą wielokomórkową pojedynczej komórki. Takie podejście umożliwia jednoczesne przestrzenne profilowanie ekspresji genów w pojedynczych komórkach oraz modyfikację histonu H3K27ac, dostarczając mechanistycznych wglądów w regulację genów w kontekście mikroanatomii tkanek.

Abstract

Technologie multiomiczne przestrzenne połączone z profilowaniem pojedynczych komórek oferują bezprecedensowe możliwości wyjaśnienia architektury molekularnej i komórkowej złożonych tkanek. Połączenie przestrzennego kodowania kreskowego jąder w ramach indywidualnych kriosekcji przygotowanych z bloków tkanek osadzonych w ośrodku zmrażającym w optymalnej temperaturze cięcia (OCT) z pojedynczokomórkowymi testami multiomicznymi w prosty i efektywny sposób pracy może ułatwić adnotację i przestrzennie rozdzieloną analizę molekularną komórek w typach tkanek. Badanie to opisuje wieloprzestrzenne rozszczepienie pod celami i tagmentacją (CUT&Tag), które jednocześnie profiluje modyfikację histonów H3K27ac oraz ekspresję genów w jednym zamrożonym przekroju mózgu. Po przestrzennym barkodowaniu pojedyncze jądra są izolowane i poddawane metodom CUT&Tag, czyli łącznemu przechwytywaniu tagowanych DNA, RNA oraz przestrzennych kodów kreskowych, przygotowaniu biblioteki oraz sekwencjonowania. Workflow generuje przestrzennie annotowane profile epigenomiczne i transkryptomiczne z tych samych jąder, umożliwiając przypisanie informacji multiomicznych do współrzędnych anatomicznych. Integracja informacji epigenomicznych z danymi transkryptomicznymi przestrzennymi zwiększa dokładność identyfikacji typów komórek i ujawnia przestrzennie zorganizowane programy regulacyjne oraz interakcje między komórkami w tkankach nienaruszonych.

Introduction

Biologia przestrzenna to szybko rozwijająca się dziedzina, która mapuje lokalizację, organizację i interakcje cząsteczek, komórek i tkanek w ich rodzimych środowiskach^(1,2,3). W przeciwieństwie do metod masowych lub konwencjonalnych z pojedynczą komórką, które wymagają dysocjacji tkanek i skutkują utratą informacji pozycyjnych, podejścia przestrzenne zachowują fizyczne współrzędne analitów lub komórek/jąder, umożliwiając bezpośrednie badania tego, jak architektura tkanek wpływa na tożsamość komórek, komunikację międzykomórkową oraz funkcję biologiczną 4,5,6,7 . Chociaż transkryptomika przestrzenna i proteomika przestrzenna są obecnie najczęściej stosowanymi modalnościami, dziedzina ta szybko rozwija się w kierunku profilowania wieloomicznego przestrzennego ^3,8,9. Współprofilowanie ekspresji genów i stanów epigenomicznych w tej samej tkance jest szczególnie skuteczne, ponieważ bezpośrednio łączy produkcję transkrypcyjną z mechanizmami regulacyjnymi — takimi jak dostępność chromatyny i modyfikacje histonów — które regulują aktywność genów i są znane z różnic w domenach przestrzennych 10,11,12 . W związku z tym zintegrowana analiza epigenomu przestrzennego i transkryptomu dostarczy kluczowych informacji na temat tego, jak programy regulacyjne kształtują tożsamość komórkową i organizację tkanek.

Opracowano kilka strategii multiomicznych przestrzennych, które umożliwiają jednoczesne profilowanie epigenomiczne i transkryptomiczne. Deterministyczne kodowanie kreskowe w sekwencjonowaniu tkanek (DBiT-seq) wykorzystuje kanały mikrofluidyczne do dostarczania przestrzennych kodów kreskowych bezpośrednio lub pośrednio, poprzez stemplowanie żelowymi płytami, do przekrojów tkanek, umożliwiając przestrzenne anotacje analitów. To podejście ułatwia przestrzennie rozdzielone współprofilowanie cech epigenomicznych i transkryptomicznych 12,13,14,15. Metoda Slide-tag, skomercjalizowana jako platforma Takara Trekker, bezpośrednio wprowadza przestrzenne kody kreskowe do nienaruszonej tkanki przed dysocjacji, umożliwiając przetwarzanie przestrzennie indeksowanych jąder za pomocą standardowych procesów pojedynczych komórek i obliczeniowe rzuty powrotu do ich pierwotnych współrzędnych^{tkanek 16}. Natomiast przestrzenny test dostępnej chromatyny, linii komórkowych i ekspresji genów z sekwencjonowaniem (SPACE-seq) wykorzystuje strategię target-out, w której epigenetyczne cele i mRNA o poli(A)-ogoniastych są rejestrowane na sekwencji przechwytującej poly-dT w przestrzennych kafelkach^{transkryptomiki 17}.

Cięcie pod celami i tagmentacja (CUT&Tag) to potężne narzędzie do mapowania interakcji między DNA a białkami histonowymi lub niehistonowymi z bardzo niskich próbek wejściowych¹⁸. CUT&Tag opiera się na fragmentacji chromatyny za pośrednictwem transpozazy Tn5 oraz znakowaniu DNA (tagmentacja), wykorzystując Tn5 sprzężony z białkiem A sterowany przeciwciałami do specyficznego dla locus rozszczepienia i oznaczania molekularnego. Podczas gdy konwencjonalny test CUT&Tag obejmuje wiele etapów inkubacji i mycia, uproszczeniowy i usprawniony workflow CUT&Tag został wykorzystany, aby zwiększyć efektywność CUT&Tag w kolejnych aplikacjach wielokomórkowych jednokomórkowych¹⁹.

Rysunek 1: Przegląd przepływu pracy i kontroli jakości przestrzennego testu wieloosomowego Trekker–CUT&Tag. (A) Schematyczny diagram przepływu pracy multiomowego Trekker–CUT&Tag. Koronalny przekrój świeżo zamrożonej tkanki mózgowej myszy jest montowany na przestrzennej płytki Trekker i poddawany przestrzennemu barkodowi. Po lizie tkanek jądra są izolowane i oceniane pod kątem wydajności oraz jakości. Około 50 000 jąder jest używanych do H3K27ac CUT&Tag, a jądra tagowane są poddawane kodowaniu kreskowym pojedynczych komórek za pomocą 10x żelowych kulek Genomics Chromium Multiome po liczeniu. DNA z kodem kreskowym z pojedynczych komórek jest wstępnie amplifikowane i dzielone na dwie frakcje. Indeksowana biblioteka CUT&Tag jest generowana bezpośrednio za pomocą indeksu PCR. Dla bibliotek ekspresji genów i przestrzennych kodów kreskowych preamplifikowane DNA jest dodatkowo amplifikowane i wybierane według rozmiaru. Fragmenty odpowiadające typowym rozmiarom cDNA są wykorzystywane do przygotowania biblioteki ekspresji genów, natomiast krótsze fragmenty DNA do generowania przestrzennej biblioteki kodów kreskowych. Biblioteki są sekwencjonowane i mapowane zgodnie z wytycznymi 10x Genomics i Curio Trekker. Oczekiwany harmonogram eksperymentu jest oznaczony po lewej stronie. (B) kluczowe punkty kontrolne kontroli jakości (QC) oraz kluczowe kwestie w trakcie całego procesu. Kontrola jakości jąder obejmuje ocenę wydajności, nienaruszenia, agregacji oraz zawartości zanieczyszczeń. Wstępne sekwencjonowanie QC obejmuje ocenę rozkładów rozmiarów DNA oraz zanieczyszczenia dimerami primerów dla wszystkich bibliotek. Specyficzność biblioteki CUT&Tag oceniana jest za pomocą ilościowego PCR (qPCR), mierzącego wzbogacenie docelowych regionów genomowych w tle tła. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.

Niniejsze badanie przedstawia przestrzenny test multiomowy Trekker CUT&Tag, który jednocześnie profiluje modyfikację histonów H3K27ac związaną z aktywnymi elementami cis-regulacyjnymi oraz ekspresją genów w świeżo zamrożonych przekrojach tkanek. Protokół ten zapewnia krok-po-kroku procedury dotyczące przestrzennego barkodowania Takara Trekker, dysocjacji tkanek i izolacji jąder, liczenia jąder i kontroli jakości, profilowania CUT&Tag o niskim wejściu modyfikacji H3K27ac, wychwytywania celów molekularnych na 10x Genomics single-cell Multiome kulek żelowych oraz przygotowania biblioteki. Workflow został zademonstrowany za pomocą koronalnego przekroju tkanki mózgowej myszy. W przeciwieństwie do standardowego workflow 10x Genomics Multiome, w którym dostępność chromatyny mierzy się za pomocą testu na chromatynę dostępną przez transpozazę z sekwencjonowaniem wysokoprzepustowym (ATAC-seq), ten protokół zastępuje fragmenty DNA pochodzące z CUT i Tag fragmentami ATAC, umożliwiając bezpośrednie badania krajobrazów modyfikacji histonów w rozdzielczości pojedynczych komórek. Aby połączyć kody kreskowe przestrzenne Trekker z jednokomórkowymi kodami 10x Genomics, kody przestrzenne z poli(A)-ogonami oraz transkrypty mRNA są rejestrowane przez sekwencje poly-dT z kulek żelowych Multiome, natomiast fragmenty DNA CUT&Tag są przechwytywane przez sekwencje spacerowe. Ta strategia podwójnego przechwytywania umożliwia jednoczesne odzyskiwanie informacji epigenomicznych, transkryptomicznych i przestrzennych z tych samych pojedynczych jąder. Z naszej wiedzy jest to pierwszy przestrzenny multiomiczny workflow, który bezpośrednio integruje transplikacje przestrzenne kodów kreskowych Trekker z testem wielokomórkowym jednokomórkowym, aby współprofilować rozkład genomu znaku histonowego oraz transkryptom. Powstałe przestrzennie rozdzielone krajobrazy wielokomórkowe, integrujące dane o zajmowaniu i ekspresji genów H3K27ac, umożliwiają projekcję profili pojedynczych komórek z powrotem do ich pierwotnych współrzędnych tkankowych oraz zapewniają bezpośrednie powiązanie między mechanizmami regulacji epigenomowej a programami transkrypcyjnymi w odniesieniu do nienaruszonej architektury tkanki.

Protocol

Dorosłe myszy zostały uśpione przez inhalację_CO2 (IACUC #: A48315-15-R24) przed pobraniem tkanek. Mózgi zostały całkowicie usunięte po strzałkowej kraniotomii i usunięciu pół kalwarii. Odczynniki i używany sprzęt są wymienione w Tabeli Materiałów.

1. Zamontowanie sekcji tkanki na płytkach kodu kreskowego Trekker do kodowania kreskowego przestrzennego

1. Przygotuj następujące informacje przed rozpoczęciem.
   1. Wyrównaj optymalny blok tkanki osadzony w temperaturze cięcia (OCT) w kriostatie przed sekcją. Przygotuj bufory do rozszczepienia UV, dysocjacji tkanek oraz izolacji jąder.
      UWAGA: Optymalna temperatura do sekcji może się różnić w zależności od typu tkanki.
   2. Aby izolować jądra, schłodź wirówkę za pomocą wiader obrotowych do 1,5 mL do 4 °C. Schłodź płytę z 12 dołkami za pomocą Trekker O-ring na lodzie.
   3. Ustaw miernik UV na maksymalny limit prądu (1,2 A) i maksymalną moc.
2. Zapisz identyfikator przestrzennego kodu kreskowego (np. U0001_001) kafelka Trekker, który ma być użyty.
   UWAGA: Każdy kafelek Trekkera zawiera unikalne współrzędne kodu kreskowego. Identyfikator kafelku jest wymagany do pobrania właściwego pliku do mapowania kodów kreskowych przestrzennych danych sekwencjonowania.
3. Ciąt na cięcie. Przecięcie koronalne o grubości 25 μm w przybliżonym miejscu bregmy -1 mm wykonano w temperaturze −18 °C (rysunek 1A).
   UWAGA: Grubość może być zwiększona do 30 μm przy pracy z tkankami o niskiej komórkowości.
4. Umieść wycinek (lub obszar zainteresowania) na kafelku przestrzennym i stopić go, delikatnie kładąc palec na dole szkła ze szkłem.
   UWAGA: W razie potrzeby sprawdź procedury poprzez pomiary kontroli jakości jąder za pomocą kafelka treningowego Trekker.
5. Użyj pęsety, aby usunąć płytkę z przezroczystego kleju i umieść ją w dołku z 12-dołkową płytką do hodowli tkanek na lodzie na wierzchu Trekker O-Ring. Natychmiast pipetować 30 μL bufora rozszczepiania Trekker UV na płytkę, upewniając się, że cała tkanka jest pokryta buforem.
6. Umieść lampę UV (ustawienie 1,2 A) na płycie bezpośrednio nad otworem. Zapal na minutę, aby uwolnić kody kreskowe, trzymając wszystko w stanie lodowym.
   UWAGA: Zakładaj ochronne okulary UV podczas pracy z lampą UV.
7. Wyłącz lampę UV i inkubuj płytkę na lodzie przez 7,5 minuty. Podczas inkubacji należy wyjąć komorę do płukania Trekker 10 x 10 i napełnić komory 1 i 2 400 μL buforu zimnego jądra Trekkera do próbki na lodzie.
8. Ostrożnie podnieś płytkę pęsetą, nie dotykając koralików, i myj płytkę w komorze 1 przez 5 sekund. Myj płytkę w komorze 2 przez 5 sekund. Ostrożnie umieść płytkę w dołku na 12-dołkowej płycie na lodzie. Część tkanki powinna być zabarwiona na niebiesko i łatwo widoczna.

2. Dysocjacja tkanek i izolacja jąder

1. Podaj 175 μL Invent Minute Buffer A skierowanego na tkankę. Powtórz jeszcze 3 razy, aby uzyskać łącznie 700 μL. Przy każdym podawaniu celuj w różne części płytki, aby odłączyć całą tkankę od kafelka.
   UWAGA: Unikaj zanieczyszczenia kulkami spowodowanym rysowaniem płytek lub spadaniem z płatków.
2. Kontynuuj oddzielanie tkanki od płytki, aspirując bufor z boku dołka i rozprowadzając go na obszary płytek pokryte tkanką, utrzymując płytkę na lodzie tak bardzo, jak to możliwe. Powtarzaj, aż na kafelku nie zostanie żadna tkanka. Gdy wszystkie tkanki zostaną usunięte z płytki, ostrożnie użyj pęsety, aby przenieść płytkę do pustej jamki.
3. Użyj pipety P1000, aby mechanicznie dysocjować jądra przez powtarzającą się triturację w tej samej studni. Powtarzam, aż nie pozostaną widoczne kawałki tkanki.
4. Ostrożnie przenieś zawiesinę jąder do wkładki filtracyjnej z probówką zbiorczą z zestawu izolacyjnego Invent Minute do izolacji pojedynczego jądra dla tkanek/komórek neuronalnych. Inkubuj tubkę z otwartą kapsułką w temperaturze –20 °C przez 10 minut. Zakręć wkład filtracyjny i natychmiast wiruj w 13 000 x g przez 30 sekund w chłodzonej mikrowirówce.
5. Usuń wkład filtrujący i ponownie zawiesij pellet, delikatnie pipetując 10–20 razy. Obracaj probówkę w schłodzonej wirówce z wiadrami wahadłowymi o stężeniu 600 x g przez 5 minut. Ostrożnie usuń supernatant i ponownie zawiesij granulkę w 200 μL buforu Trekker C.
6. Dodaj 1 mL zimnego bufora Invent Minute B do 1,5 mL niskowiążącej rurki Eppendorfa i ostrożnie nałóż 200 μL zawiesiny jąder na bufor Minute B, powoli wypychając przy ścianie rurki, aby uniknąć mieszania warstw. Rozkręć rurkę w schłodzonej wirówce z wiadrami obrotowymi o stężeniu 500 x g przez 10 minut. Ostrożnie usuń mleczną warstwę i nadmiar.
7. Delikatnie ponownie zawiesij jądra z 24 μL buforu Trekkera C i przejdź do pomiarów kontroli jakości izolowanych jąder.

Rysunek 2: Ocena kontroli jakości izolowanych jąder. Reprezentatywne obrazy w świetle wyizolowanych jąder z tkanki mózgowej myszy. Jądra zostały zabarwione 0,4% Trypanowym niebieskim i sfotografowane z 40-krotnym powiększeniem, aby ocenić integralność jądra i obecność szczątków. Przygotowanie jąder pokazane po lewej stronie pokazuje wysokiej jakości, nienaruszone jądra odpowiednie do dalszych badań, natomiast przygotowanie po prawej ilustruje jądra niskiej jakości z częściowo zlizowanymi agregatami tkanek. Uszkodzone lub pęknięte jądra są oznaczone przez wypełnione groty strzał. Skala ma 100 μm. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figury.

3. Liczenie i pomiary kontroli jakości izolowanych jąder

1. Do liczenia jąder należy wziąć 2 μL zawiesiny jąder do 8 μL buforu Trekker C. Wymieszać 10 μL rozcieńczonej zawiesiny jąder z 10 μL roztworu barwienia AO/PI. Licz jądra zgodnie z instrukcjami producenta.
2. Aby ocenić jakość izolowanych jąder, rozcieńcz 2 μL zawiesiny jąder do 8 μL 4% roztworu trypanowego niebieskiego. Zbadaj jądra pod mikroskopem fluorescencyjnym z powiększeniem 40X, sprawdzając nienaruszoną morfologię błony jądrowej oraz zawartość niejądrowych odpadów (Rysunek 2).
3. Natychmiast przejść do testu CUT&Tag multiome pojedynczego jądra (CUT&Tag na H3K27ac + ekspresji genów).
   UWAGA: Przejdź do kolejnych kroków, jeśli zostanie odzyskane co najmniej 30 000 wysokiej jakości jąder.

4. Tagowanie CUT&Tag na izolowanych jądrach

1. Przygotuj bufor inkubacyjny CUT&Tag. Umieść go w lodzie.
2. Przygotuj pierwotne przeciwciało i transpozazę aktywowaną przez enzym TAG (sprzężony).
   1. Dodaj 46,23 μL bufora inkubacyjnego CUT&Tag I oraz 1,33 μL enzymu TAG do probówki PCR na lodzie. Dodaj optymalną ilość pierwotnych przeciwciał do rurki. Powoli mieszaj, pipetując 10 razy.
      UWAGA: Do reakcji dodano 2,43 μL przeciwciała przeciw H3K27ac. Partia przeciwciał została zatwierdzona pod kątem testów CUT&Tag w masie i in-situ . Optymalizuj ilość przeciwciał do koniugacji enzymów TAG za pomocą testu objętościowego. Optymalne przeciwciało zdefiniowano jako najniższe stężenie osiągające maksymalny stosunek sygnał-szum, określone przez qPCR przy dodatnim i ujemnym locusach docelowych.
   2. Krótko obróć i umieść rurkę na rotatorze o prędkości 18 obr./min. Inkubuj w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę. Powstała mieszanka może być przygotowana i umieszczona na lodzie na maksymalnie 5 godzin.
      UWAGA: Inkubacja przeciwciało-TAG może być przeprowadzana równocześnie z izolacją jąder lub przed nią.
3. Inkubacja izolowanych jąder z sprzężonym enzymem przeciwciało-TAG.
   1. Obrać rurkę (Krok 2.7) izolowanych jąder w schłodzonej wirówce z wiadrami obrotowymi o stężeniu 500 x g przez 10 minut. Usuń supernatant bez zakłócania pelletu i pozostawiając ~5 μL supernatantu.
   2. Dodaj 25 μL bufora inkubacyjnego CUT&Tag I (Krok 4.1) i ponownie zawiesij, delikatnie pipetując 10 razy. Przenieś jądra do rurki (Krok 4.2.2) zawierającej sprzężone przeciwciało-TAG, używając tego samego końcówki pipety. Delikatnie mieszaj, pipetując 10 razy i umieszczając tubkę na delikatnym rotatorze.
   3. Inkubować przez noc w temperaturze 4 °C.
4. Następnego dnia (dzień 2) przygotuj 1X bufor jąder CUT&Tag i umieść w lodzie.
5. CUT&Tag tagowanie
   1. Wyjmij rurkę reakcyjną (Krok 4.3.3) z rotatora. Dodaj 5 μL aktywatora CUT&Tag i przelej mieszankę do nowej probówki 1,5 mL. Inkubuj przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C na termomikserze przy 550 obr./min.
   2. Wyjmij probówkę, dodaj 20 μL buforu CUT&Tag do hartowania i delikatnie wymieszaj reakcję, pipetując 10 razy. Wiruj rurkę w schłodzonej wirówce z wiadrami obrotowymi o pojemności 500 x g przez 10 minut. Usuń supernatant bez zakłócania osadu jąder, pozostawiając ~5 μL supernatantu na dnie rurki.
   3. Dodaj 100 μL buforu jąder CUT&Tag 1X i ponownie zawiesij jądra, delikatnie pipetując 10 razy. Rozkręć rurkę w schłodzonej wirówce z wiadrami obrotowymi o stężeniu 500 x g przez 10 minut. Usuń 85 μL supernatantu, pozostawiając ~15 μL. Ponownie zawiesij jądra, delikatnie i powoli pipetując 10 razy.
6. Liczenie jąder tagowanych i określenie liczby celów
   1. Dodaj 1 μL zawiesiny tagmentowanego jądra do 9 μL soli fizjologicznej z buforem fosforanowym i wymieszaj z 10 μL roztworu barwienia AO/PI. Policz jądra tagowane, jak opisano w kroku 3.1.
   2. Użyj 1,6x docelowej liczby jąder do generowania pojedynczych komórek, aby uzyskać pożądaną liczbę przechwyconych jąder.
   3. Skręć rurkę w schłodzonej wirówce z wiadrami obrotowymi o stężeniu 500 x g przez 10 minut i ostrożnie usuwaj supernatant, pozostawiając ostateczną objętość 8 μL.

5. Pojedyncze kodowanie kreskowe jąder oznaczonych oraz wstępna amplifikacja DNA kodowanych kreskowymi

1. Dodaj 7 μL buforu ATAC B do 8 μL oznakowanych jąder z oczekiwaną liczbą jader docelowych dla eksperymentu.
   UWAGA: Więcej szczegółów dotyczących konfiguracji reakcji i działania instrumentu Chromium X można znaleźć w protokole "GEM Generation & Barcoding" w Chromium Next GEM Single-Cell Multiome ATAC + Gene Expression Kit User Guide (CG000338 Rev G).
2. Generowanie GEM i kodowanie kreskowe za pomocą instrumentu Chromium X.
   1. Dodaj 60 μL mieszanki głównej GEM do rurki zawierającej jądra tagowane. Delikatnie wymieszaj przez pipetowanie i załaduj do rzędu 1 chipu Chromium Next GEM J.
   2. Przygotuj żelowe koraliki Single-Cell Multiome i załaduj 50 μL żelowych koralików na rząd 2. Rozdaj 45 μL ropy rozdzielającej do odwiertów w rzędzie 3.
   3. Włóż złożony chip J z uszczelką do tacy instrumentu Chromium X i uruchom urządzenie.
   4. Powoli zasysaj 100 μL GEM z najniższych punktów odwiertów odzyskujących w górnym rzędzie 3. Powoli podawaj GEM do nowej rurki PCR na lodzie, z końcówkami pipety przy ściankach studni.
   5. Inkubuj zebrane GEM w cyklerze termicznym (temperatura pokrywy 50°C) według następującego protokołu: jeden cykl 37 °C przez 45 minut, jeden cykl 25 °C przez 30 minut oraz 4 °C podczas trzymania.
   6. Dodaj 5 μL środka hartującego i powoli mieszaj przez pipetowanie 10 razy.
3. Oczyszczenie inkubacji po GEM i oczyszczanie DNA
   UWAGA: Zobacz więcej szczegółów w protokole "Post GEM Incubation Cleanup" dotyczącym Chromium Next Single-Cell Multiome ATAC + Gene Expression Kit User Guide (CG000338 Rev G).
   1. Dodaj 125 μL różowego środka do rurki w temperaturze pokojowej i delikatnie odwróć ją 10 razy. Krótko w wirówce. Powoli usuń i wyrzuć 125 μL środka odzysku/oleju do przedziałów (różowy) z dna rurki.
   2. Dodaj 200 μL mieszanki oczyszczającej Dynabeads do rurki i mieszaj przez pipetowanie 10 razy. Inkubuj przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Umieść rurkę na stojaku magnetycznym, aż roztwór się rozbieści. Usuń supernatant.
   3. Dodaj 300 μL świeżo przygotowanego etanolu o 80% do pelletu. Inkubuj 30 sekund i usuń supernatant. Dodaj 200 μL etanolu 80% do pelleta, inkubuj 30 sekund i usuń supernatant. Krótko obróć rurkę i umieść ją na magnesie. Usuń pozostały supernatant.
   4. Usuń rurkę z magnesu. Natychmiast dodaj 50,5 μL roztworu elucijnego I. Wymieszaj przez pipetowanie i inkubuj przez 1 minutę w temperaturze pokojowej. Krótko obróć i umieść rurkę na magnesie, aż roztwór się rozklaruje. Przelej 50 μL czystego roztworu do nowej rurki.
   5. Oczyszczanie DNA za pomocą kulek paramagnetycznych
      1. Do każdej próbki dodaj 90 μL kulek paramagnetycznych (1,8x) i wymieszaj przez dokładne pipetowanie. Inkubuj przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Krótko obróć i umieść rurkę na magnesie, aż roztwór się rozklaruje. Usuń supernatant.
      2. Dodaj 200 μL etanolu 80% do pelletu. Inkubuj przez 30 sekund. Usuń etanol. Powtórz to jeszcze raz.
      3. Krótko obróć i umieść rurkę na magnesie. Usuń pozostały supernatant.
      4. Usuń rurkę z magnesu. Dodaj 46,5 μL bufora EB i mieszaj przez pipetowanie. Inkubuj przez 2 minuty w temperaturze pokojowej. Obraca i przyłóż go do magnesu, aż roztwór się rozjasni.
      5. Przenieś 46 μL oczyszczonego DNA do nowej probówki.
4. Preamplifikacja DNA z kodami kreskowymi.
   1. Dodaj 54 μL mieszanki do wzmacniania wstępnego do każdej próbki. Krótko wymieszaj pipety i wirulec.
   2. Inkubować w cyklerze termicznym (temperatura pokrywy 105 °C) według następującego protokołu: jeden cykl 72 °C przez 5 minut; jeden cykl 98 °C przez 3 minuty; łącznie 7 cykli: 98 °C przez 20 s, 63 °C przez 30 s, 72 °C przez 1 minutę; jeden cykl 72 °C przez 1 minutę; oraz przechowywanie w 4 °C. Przechowywanie w 4 °C przez noc.
   3. Następnego dnia (dzień 3) oczyść wcześniej amplifikowane DNA za pomocą paramagnetycznych kulek (1,6X), jak opisano w kroku 5.3.5. Dodaj 80,5 μL buforu EB do rurki i wymieszaj przez pipetowanie. Inkubuj przez 2 minuty w temperaturze 22 °C (temperatura pokojowa). Krótko obróć i umieść rurkę na magnesie, aż roztwór się rozklaruje.
   4. Przenieś 80 μL wcześniej amplifikowanego DNA do nowej rurki. Użyj 40 μL do wygenerowania biblioteki CUT&Tag. Pozostałe wcześniej amplifikowane DNA przechowywać w temperaturze 4 °C.
      UWAGA: 40 μL pozostałych preamplifikowanych DNA zostanie później wykorzystane do ekspresji genów i bibliotek kodów kreskowych przestrzennych.

6. Przygotowanie biblioteki do CUT&Tag, ekspresji genów i przestrzennych kodów kreskowych

1. Przygotowanie biblioteki scCUT&Tag
   1. Przenieś 40 μL preamplifikowanego DNA do nowej probówki i dodaj 60 μL mieszanki PCR z indeksem próbki. Wymieszaj przez pipetowanie i krótko zakręć.
   2. Inkubować w cyklerze termicznym (temperatura pokrywy 105 °C) według następującego protokołu: jeden cykl 98 °C przez 45 s; łącznie 12 cykli: 98 °C przez 20 s, 67 °C przez 30 s, 72 °C przez 20 s; jeden cykl 72 °C przez 1 minutę; 4 °C podczas trzymania).
      UWAGA: Optymalna liczba cykli zależy od początkowej liczby jąder oraz profilowanego znaku histonu. W eksperymencie użyto dwunastu cykli wzmacniania dla znaku H3K27ac.
   3. Podwójny dobór wielkości i oczyszczanie DNA za pomocą kulek paramagnetycznych (0,6X, 1,55X)
      1. Do każdej próbki dodaj 60 μL kulek paramagnetycznych (0,6X) i wymieszaj przez dokładne pipetowanie. Inkubuj przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Krótko obróć i umieść rurkę na magnesie, aż roztwór się rozklaruje.
      2. Przelej 150 μL supernatantu do nowej lampy. Do każdej próbki (supernatant) dodaj 95 μL kulek paramagnetycznych (1,55X) i mieszaj przez pipetowanie. Inkubuj przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Przyłóż rurkę do magnesu, aż roztwór się rozklarza. Usuń supernatant.
      3. Dodaj 300 μL etanolu 80% do pelletu. Poczekaj 30 sekund. Usuń etanol. Powtórz to jeszcze raz. Krótko obróć i umieść rurkę na magnesie. Usuń pozostały supernatant.
      4. Usuń rurkę z magnesu. Dodaj 20,5 μL buforu EB do rurki i mieszaj przez pipetowanie. Inkubuj przez 2 minuty w temperaturze pokojowej. Obraca i przyłóż go do magnesu, aż roztwór się rozjasni.
      5. Przenieś 20 μL oczyszczonych i indeksowanych bibliotek CUT&Tag do nowych lamp.
2. Kontrola jakości dla biblioteki CUT&Tag
   1. Analiza rozkładu rozmiarów DNA w bibliotece
      1. Wymieszaj 1 μL oczyszczonego DNA bibliotecznego z 1 μL buforu o niskim TE.
      2. Wymieszaj rozcieńczone DNA z buforem roboczym analizatora fragmentów i uruchom na instrumentie z zestawem fragmentów HS NGS o wysokiej czułości (1-6000bp) (rysunek 3A).
   2. Oceń wzbogacenie locus genomowego H3K27ac-dodatniego przed sekwencjonowaniem i mapowaniem.
      1. Wymieszaj 1 μL oczyszczonego DNA bibliotecznego z 4 μL wody wolnej od nukleazy. Do pomiarów qPCR dla trzech loców genomowych należy użyć 1 μL rozcieńczonego DNA bibliotecznego.
         UWAGA: Dla H3K27ac CUT&Tag dodatnia zapalnica została zaprojektowana na podstawie locus Actb-TSS, natomiast startery skierowane do T1-TSS i locus intergenic służyły jako kontrolę ujemną²⁰ (Tabela 1). Genomowe DNA myszy było używane jako kontrola wejściowa do normalizacji wydajności PCR (Rysunek 3B).
      2. Przygotuj łącznie 20 μL mieszanki reakcyjnej w następujący sposób: 1 μL rozcieńczonego DNA bibliotecznego, 2 μL mieszanki 10 μM starterów, 10 μL 2X SYBR Green Master Mix oraz 7 μL wody wolnej od nukleazy.
      3. Uruchom przygotowaną płytkę qPCR na systemie CFX Opus Real-Time PCR, używając odpowiedniego programu cyklicznego do wykrywania SYBR Green.
3. Amplifikacja cDNA i przestrzennych kodów kreskowych.
   1. Przenieś 35 μL preamplifikowanego DNA (Krok 5.4.4) do nowej probówki i dodaj 65 μL mieszanki reakcji amplifikacyjnej cDNA. Wymieszaj przez pipetowanie i krótko zakręć. Primerem używanym do amplifikacji DNA cDNA i przestrzennego kodu kreskowego jest Feature cDNA Primers 2.
   2. Inkubować w cyklerze termicznym (temperatura pokrywy 105 °C) według następującego protokołu: jeden cykl 98 °C przez 45 s; łącznie 8 cykli: 98 °C przez 20 s, 63 °C przez 30 s, 72 °C przez 1 minutę; jeden cykl 72 °C przez 1 minutę; 4 °C do trzymania.
      UWAGA: Optymalna liczba cykli musi być określona na podstawie typu komórki, zawartości RNA oraz początkowej liczby jąder. W tym eksperymencie wykonano 8 cykli amplifikacji.
   3. Oczyszczanie amplifikowanych cDNA
      1. Podwójny dobór wielkości i oczyszczanie DNA za pomocą kulek paramagnetycznych (0,6X, 2,0X), jak opisano w kroku 6.1.3. Dodaj 60 μL kulek paramagnetycznych (0,6X) do każdej próbki i wymieszaj przez pipetowanie. Inkubuj przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Przyłóż magnes do roztworu, aż się rozbieści.
      2. Przelej i zachowaj 75 μL supernatantu w nowej tubie bez zakłócania pelletu. Utrzymuj w temperaturze pokojowej.
         UWAGA: Nie odrzucaj supernatantu, ponieważ zawiera on DNA wzbogacone o krótsze fragmenty, które zostaną użyte do wygenerowania przestrzennej biblioteki kodów kreskowych.
      3. Usuń pozostały supernatant z pelletu. Myj dwukrotnie etanolem 80%, jak opisano w kroku 6.1.3.
      4. Dodaj 40,5 μL buforu EB do rurki i wymieszaj przez pipetowanie. Inkubuj przez 2 minuty w temperaturze pokojowej. Krótko obróć i umieść na magnesie, aż roztwór się rozklarza.
      5. Przenieś 40 μL amplifikowanego cDNA do nowej rurki. Zachowaj to na lodzie, aby przygotować indeksowaną bibliotekę ekspresji genów.
         UWAGA: Ta frakcja wzbogaca DNA pod kątem typowego rozmiaru cDNA.
   4. Oczyszczanie wzmocnionych przestrzennych kodów kreskowych DNA
      1. Dodaj 70 uL kulek paramagnetycznych (2,0X) do 75 μL wcześniej zachowanego supernatantu (Krok 6.3.3.2. Wymieszaj przez pipetowanie i krótko zakręć. Inkubuj przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Przyłóż rurkę do magnesu, aż roztwór się rozklarza. Usuń supernatant.
      2. Myj dwukrotnie etanolem 80%, jak opisano w kroku 6.1.3.
      3. Dodaj 40,5 μL buforu EB do rurki i wymieszaj przez pipetowanie. Inkubuj przez 2 minuty w temperaturze pokojowej. Krótko obróć i umieść na magnesie, aż roztwór się rozklarza.
      4. Przenieś 40 μL amplizowanego i oczyszczonego przestrzennego kodu kreskowego DNA do nowej rurki. Przechowywać w temperaturze −20 °C do kolejnego generowania indeksowanej biblioteki kodów kreskowych przestrzennych.
   5. Analiza rozmiarów cDNA za pomocą analizatora fragmentów. Wymieszaj 1 μL amplifikowanego cDNA z 1 μL buforu o niskim TE. Przeprowadź rozcieńczone DNA metodą analizatora fragmentów, jak opisano w kroku 6.2.1.
   6. Przygotowanie indeksowanej biblioteki ekspresji genów
      1. Przenieś 10 μL amplifikowanego cDNA (Krok 6.3.3.5) do nowej rurki. Dodaj 25 μL buforu EB i 15 μL mieszanki fragmentacyjnej. Mieszaj przez pipetowanie na lodzie. Krótko obróć i przenieś rurkę do wcześniej schłodzonego cyklera termicznego w temperaturze 4 °C.
      2. Inkubuj w cyklerze termicznym (temperatura pokrywy 65 °C), inicjując następujący protokół: jeden cykl 32 °C przez 5 minut; jeden cykl 65 °C przez 30 minut; 4 °C do trzymania.
      3. Podwójny dobór wielkości i oczyszczanie DNA za pomocą paramagnetycznych kulek (0,6X, 0,8X), jak opisano w kroku 6.1.3. Dodaj 50,5 μL bufora EB i mieszaj przez pipetowanie. Inkubuj przez 2 minuty w temperaturze pokojowej. Krótko obróć i umieść na magnesie, aż roztwór się rozklarza.
      4. Przelej 50 μL próbki do nowej probówki. Dodaj 50 μL mieszanki do ligacji adaptorowej i mieszaj przez pipetowanie. Krótko się zakręć. Inkubować w cyklerze termicznym (temperatura pokrywy 30 °C) według następującego protokołu: jeden cykl 20 °C przez 15 minut i 4 °C podczas utrzymania.
      5. Oczyszczanie DNA za pomocą kulek paramagnetycznych (0,8X), jak opisano w kroku 5.3.5. Dodaj 30,5 μL bufora EB i mieszaj przez pipetowanie. Inkubuj przez 2 minuty w temperaturze pokojowej. Krótko obróć i umieść na magnesie, aż roztwór się rozklarza. Przelej 30 μL próbki do nowej probówki.
      6. Indeks PCR biblioteki ekspresji genów. Dodaj 50 μL miksu wzmacniaczy i 20 μL pojedynczego zestawu TT z podwójnym indeksem A do każdej próbki.
      7. Inkubować w cyklerze termicznym (temperatura pokrywy 105 °C) według następującego protokołu: jeden cykl 98 °C przez 45 s; łącznie 11 cykli: 98 °C przez 20 s, 54 °C przez 30 s, 72 °C przez 20 s; jeden cykl 72 °C przez 1 minutę; 4 °C do trzymania.
         UWAGA: Optimum liczby cykli należy określić na podstawie typu komórki, zawartości RNA oraz początkowej liczby jąder. W tym eksperymencie użyto łącznie 11 cykli wzmacniania.
      8. Podwójny dobór wielkości i oczyszczanie DNA za pomocą paramagnetycznych kulek (0,6X, 0,8X), jak opisano w kroku 6.1.3. Dodaj 35,5 μL buforu EB do rurki i wymieszaj przez pipetowanie. Inkubuj przez 2 minuty w temperaturze pokojowej. Krótko obróć i umieść na magnesie, aż roztwór się rozklarza.
      9. Przenieś 35 μL oczyszczonej i indeksowanej biblioteki ekspresji genów do nowej rurki.
4. Analiza rozkładu rozmiarów DNA w bibliotece ekspresji genów. Wymieszaj 1 μL DNA bibliotecznego z 1 μL buforu o niskim TE. Przeprowadź rozcieńczone DNA zgodnie z krokiem 6.2.1. (Rysunek 3A).
5. Przygotowanie indeksowanej biblioteki kodów kreskowych przestrzennych
   1. Przygotuj łącznie 100 μL mieszanki PCR o indeksie próbki w następujący sposób: 50 μL Amp Mix (z zestawu GEM-X Single-Cell 3' Feature Barcode Kit), 25 μL Buffer EB, 20 μL primeru z zestawu Double Index Plate TT Set A oraz 1 μL oczyszczonego DNA kodów kreskowych przestrzennych (Krok 6.3.4.4) rozcieńczonych w 4 μL buforu EB.
   2. Inkubować w cyklerze termicznym (temperatura pokrywy 105 °C) według następującego protokołu: jeden cykl 98 °C przez 45 s; łącznie 7 cykli: 98 °C przez 20 s, 54 °C przez 30 s, 72 °C przez 20 s; 72 °C przez 1 minutę; 4 °C do trzymania.
   3. Oczyszczanie DNA za pomocą kulek paramagnetycznych (1,2X), jak opisano w kroku 5.3.5. Dodaj 35,5 μL buforu EB do rurki i wymieszaj przez pipetowanie. Inkubuj przez 2 minuty w temperaturze pokojowej. Przyłóż rurkę do magnesu, aż roztwór będzie przezroczysty.
   4. Przenieś 35 μL oczyszczonego i indeksowanego DNA z przestrzennej biblioteki kodów kreskowych do nowej rurki. Przechowuj w temperaturze 4 °C do 72 godzin lub w −20 °C do długotrwałego przechowywania.
6. Sprawdź rozkład rozmiarów DNA w indeksowanej bibliotece kodów kreskowych przestrzennych. Wymieszaj 1 μL oczyszczonego DNA bibliotecznego z 1 μL buforu o niskim TE. Przeprowadź rozcieńczone DNA analizatorem fragmentów, jak opisano w kroku 6.2.1 (Rysunek 3A).

Rysunek 3: Oceny kontroli jakości bibliotek indeksowanych. (A) Profile rozmiarów w amplifikowanych DNA i bibliotekach indeksowanych. DNA jest analizowane przez analizator fragmentów w celu oceny jakości i rozkładu rozmiaru DNA. Pokazano reprezentatywne profile dla indeksowanej biblioteki CUT&Tag, amplifikowanego DNA używanego do ekspresji genów i przygotowania biblioteki kodów kreskowych przestrzennych, indeksowanej biblioteki ekspresji genów oraz indeksowanej biblioteki kodów kreskowych przestrzennych. (B) Biblioteka CUT&Tag jest analizowana przez qPCR w celu oceny wzbogacenia genomowego regionu H3K27ac-dodatniego (tj. ACTB) względem sygnału tła H3K27ac-ujemnego (tj. T1 i locus intergenowy). Różnica fałdów między obszarami dodatnimi i ujemnymi oblicza się jako wzbogacenie²¹. Wzbogacenie fałdów większe niż 10 jest uważane za idealne w tym assayie²⁰. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.

7. Kolejność bibliotek

1. Sekwencjonuj bibliotekę kodów kreskowych Trekkera na głębokości 5 000 par odczytów na każde przechwycone jądro.
2. Sekwencjonuj bibliotekę H3K27ac CUT&Tag na głębokości 25 000 par odczytów na każde przechwycone jądro.
3. Sekwencjonuj bibliotekę ekspresji genów na głębokości co najmniej 20 000 par odczytów na każde przechwycone jądro.

8. Bioinformatyka i analiza danych

1. Przetwarzaj ekspresję genów i odczyty CUT&Tag za pomocą Cell Ranger ARC v2.0.2 z --min-atac-count=100 i --min-gex-count=1000. Integruj wyjścia ARC Cell Ranger z informacjami o kodach kreskowych Trekkera za pomocą Trekker Pipeline v1.3.0 z domyślnymi parametrami do przypisywania pozycji przestrzennych.
2. Przeprowadzaj kontrolę jakości za pomocą Signac. Komórki spełniające któreś z następujących kryteriów zostały usunięte z analizy dalszej: dla CUT&Tag łączna liczba fragmentów ≥ 1 000 000 lub ≤ 100, a wzbogacenie TSS ≤ 2; dla ekspresji genów łączna liczba UMI ≥ 100 000 lub ≤ 1 000, a łączna liczba wykrytych genów ≥ 10 284 lub ≤ 200.
3. Usuń dublety za pomocą scDblFinder do ekspresji genów oraz AMULET do CUT&Tag. Komórki spełniające któreś z następujących kryteriów zostały sklasyfikowane jako dublety: (1) wynik scDblFinder ≥ 0,6; (2) wynik scDblFinder ≥ 0,3, a AMULET ≤ 0,01; oraz (3) w klastrach o wysokim odsetku dubletów.
4. Normalizuj dane o ekspresji genów za pomocą LogNormalize oraz danych CUT&Tag za pomocą TF-IDF. Oblicz zanurzenia RNA PCA i CUT&Tag LSI, używając wymiarów LSI 2–50 dla modalności chromatyny. Skonstruuj ważony graf najbliższych sąsiadów za pomocą FindMultiModalNeighbors i generuj osadzenia UMAP na podstawie grafu sąsiadów wielomodalnych.
5. Notuj dane po QC Trekkera za pomocą transferu etykiet Seurat opartego na FindTransferAnchors oraz strategii mapowania projekcji PCA z domyślnymi parametrami. dane scRNA-seq z ABC Atlas (wersja 20230630) zostały wykorzystane jako odniesienie. Przewidywania typów komórek niezgodne ze znaną anatomią tkanek zostały usunięte podczas ręcznej kuracji.
   UWAGA: Skrypty do analizy bioinformatycznej są dostępne na GitHub: https://github.com/Liuy12/Mouse_Brain_Trekker_Multiome_Cuttag

Results

Korzystając z przekroju koronalnego (grubość 25 μm, około 70% pokrycia płytki przestrzennej o średnicy 10 × 10 mm) świeżo zamrożonej tkanki mózgowej myszy, opisany tutaj workflow konsekwentnie dał 50 100 wysokiej jakości jąder (SD = 12 200, n = 8), co wystarcza do dalszego profilowania wielokomórkowego (Rysunek 1). Po przestrzennym kodowaniu przestrzennym sekcji tkankowej, jądra zostały wyizolowane za pomocą delikatnej dysocjacji tkankowej i dodatkowo oczyszczone zestawem izolacyjnym Invent do izolacji pojedynczego jądra. Procedura ta skutkowała minimalnym zanieczyszczeniem i niskim poziomem agregacji jądrowej, co dało przygotowania jąder odpowiednie do testów jednokomórkowych. Reprezentatywne obrazy izolowanych jąder przedstawiono na Rysunku 2.

Dla dalszych testów pojedynczych jąder, w tym profilowania wielojądrowego CUT&Tag (CUT&Tag + ekspresja genów), zazwyczaj przetwarzano tutaj około 50 000 jąder. Aby zmaksymalizować odzysk jądrowy, wdrożono uproszczony, uproszczony protokół CUT&Tag o niskim wejściu, stosując bezpośrednie celowanie i tagmentację przeciwciałami–pA/Tn5, minimalizując tym samym czas inkubacji i kroki płukania¹⁹. Przy tym podejściu odzyskano około 25 000 oznakowanych jąder, co odpowiada średniej wydajności 48,3% (SD = 6,1, n = 3). Jądra te zostały następnie wykorzystane do kodowania kreskowego pojedynczych komórek za pomocą żelowych koralików Genomics Chromium Multiome. Do generowania GEM celowano około 15 000 jąder z oczekiwaniem odzyskania ~10 000 jąder indeksowanych przestrzennie po jakościowym filtrowaniu. Na podstawie przestrzennego dekodowania kodów kreskowych Trekker, 81,3% jąder (SD = 9, n = 3) z pojedynczych komórek danych można było z pewnością przypisać do pozycji przestrzennych w kafelku.

Przestrzenny przepływ pracy Trekker–CUT&Tag multiome generuje trzy indeksowane biblioteki: CUT&Tag, ekspresję genów oraz biblioteki kodów kreskowych przestrzennych. Wstępnie amplifikowane DNA kodowane kreskowym dzielono na dwie frakcje, z których każda służy do przygotowania biblioteki zgodnie z chemią przechwytywania celów na kulkach żelowych. Biblioteki CUT&Tag zostały bezpośrednio amplifikowane z preamplifikowanego DNA i wykazały rozkłady wielkości fragmentów charakterystyczne dla tagmentacji CUT&Tag, odpowiadające DNA wolnym od nukleosomów i nukleosomowym (Rysunek 3A). Biblioteka wykazała dobre wzbogacenie locus Actb z H3K27ac-dodatnim względem genomowych locus H3K27ac-negatywnych ^20,21 (czyli różnica 68-krotna, przekraczająca 10-krotny próg wcześniej ustalony dla analizy sekwencjonowania immunoprecipitacji chromatyny H3K27ac²⁰) (Rysunek 3B). W bibliotekach ekspresji genów i przestrzennych kodów kreskowych, preamplifikowane DNA zostało najpierw amplifikowane według protokołu amplifikacji cDNA 10x Genomics, a następnie podzielone na dwie frakcje w zależności od wielkości fragmentu za pomocą paramagnetycznego oczyszczania kulek. Indeksowana biblioteka kodów kreskowych przestrzennych została przygotowana z ułamków wzbogaconych dla krótszych fragmentów i wykazywała wyraźny szczyt przy oczekiwanym rozmiarze fragmentu. Biblioteki ekspresji genów wykazywały charakterystyczny rozkład wielkości skoncentrowany wokół amplifikowanych fragmentów cDNA (Rysunek 3A).

Rysunek 4: Reprezentacja pojedynczych komórek i przestrzennych testów wielokomórkowych Trekker–CUT&Tag w tkance mózgowej myszy. (A) Identyfikacja typów komórek za pomocą analizy pojedynczych komórek. Wykresy aproksymacji i projekcji jednorodnych rozmaitości (UMAP) pokazują populacje komórek z adnotacjami pochodzące wyłącznie z H3K27ac CUT&Tag, wyłącznie ekspresji genów oraz zintegrowanego zbioru danych multiomowych (CUT&Tag + ekspresja genów). (B) Reprezentacja przestrzenna danych wieloprzestrzennych Trekker–CUT&Tag. Jądra z zintegrowanego zbioru danych multiomowych są przypisywane do współrzędnych przestrzennych za pomocą kodów kreskowych Trekker, co ujawnia anatomicznie zorganizowane rozkłady typów komórek w sekcji tkanki mózgowej myszy. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.

Sekwencjonowanie i mapowanie bibliotek CUT&Tag oraz ekspresji genów wykonywano przy użyciu Cell Ranger ARC v2.0.2 zgodnie z wytycznymi 10x Genomics, natomiast biblioteki kodów kreskowych przestrzennych przetwarzano za pomocą Trekker v1.3.0 zgodnie z zaleceniami Takary Trekker. Sugerowane opcje mapowania ATAC-seq dla pojedynczych komórek zostały zastosowane do bibliotek CUT&Tag. Zestawy danych pojedynczych jąder zostały wygenerowane wyłącznie dla CUT&Tag, wyłącznie ekspresji genów oraz połączonego multiomu (CUT&Tag + ekspresja genów). Komórki z łączną liczbą UMI dla CUT&Tag (≥ 1 000 000 lub ≤ 100) lub ekspresji genów (≥ 100 000 lub ≤ 1000) zostały przefiltrowane za pomocą Signac²². Predykcja podwójnego była wykonywana za pomocą kombinacji scDblFinder²³ do ekspresji genów oraz AMULET²⁴ do CUT&Tag. Usunięto komórki spełniające jedno z następujących kryteriów: 1) scDblFinder.score > 0,6; 2) scDblFinder.score od 0,3 do 0,6, a amulet.score < 0,01. Adnotacje typu komórek zostały wykonane za pomocą FindTransferAnchors²⁵ firmy Seurat, bazując na danych^{referencyjnych 26} z Allen Brain Cell Atlas. W bibliotece ekspresji genów w tym badaniu mediana liczby UMI na komórkę wynosiła 15 378, a mediana liczby genów na komórkę 4 378. W bibliotece CUT&Tag wykryto 11 860 komórek, z medianą 6 631 wysokiej jakości fragmentów na komórkę i oceną wzbogacenia TSS na poziomie 7,66. W bibliotece kodów kreskowych przestrzennych Trekkera 92,43% jąder otrzymało przypisane pozycje przestrzenne, a 51,54% jąder przypisano do jednego miejsca przestrzennego. Surowe dane sekwencjonowania oraz przetworzone dane z analiz wtórnych są dostępne przez GEO pod numerem przystąpienia GSE327406. Ostatni obiekt Seurat z adnotacjami po QC jest dostępny na Zenodo pod numerem akcesyjnym 19475899. Reprezentatywne osadzenia UMAP z adnotacjami typu komórek pokazano na Rysunku 4A. Łącząc kody kreskowe pojedynczej komórki z kodami kreskowymi przestrzennymi, poszczególne jądra zostały przypisane z powrotem do ich miejsc przestrzennych w tkance, aby wygenerować mapę przestrzenną (Rysunek 4B). Ta mapa ściśle odpowiada cechom anatomicznym obserwowanym w sąsiednich przekrojach i pokrywa się z przekrojem koronalnym mózgu w Allen Brain Atlas²⁷, standardowym odniesieniu do anatomii mózgu myszy. Wspólna analiza przestrzennej ekspresji genów i profili H3K27ac z rozdzielczością pojedynczych komórek umożliwiła identyfikację głównych typów komórek mózgowych oraz ujawniła anatomicznie zorganizowane wzorce rozkładu komórkowego w przekroju tkanki.

Discussion

Protokół ten opisuje przestrzenny workflow Trekker–CUT&Tag multiome, który integruje barcoding przestrzenny, niskowejściowe profilowanie CUT&Tag H3K27ac, jednoczesne przechwytywanie wielu celów molekularnych na 10x Genomics single-cell multiome kulkach żelowych oraz dalsze przygotowanie biblioteki do sekwencjonowania Illumina. Łącząc indeksowanie przestrzenne z odczytami epigenomicznymi i transkryptomicznych pojedynczych komórek, podejście to odpowiada na fundamentalne ograniczenie konwencjonalnych testów wielokomórkowych jednokomórkowych, które nie zawierają natywnego kontekstu tkankowego. Badanie to skutecznie demonstruje wykonalność przestrzennego profilowania wieloomowego CUT & Tag (H3K27ac CUT&Tag + ekspresja genów) oraz tworzy podstawy dla przestrzennego współprofilowania ekspresji genów oraz celów regulacyjnych, takich jak znaki histonowe i białka związane z chromatyną.

Rygorystyczna kontrola jakości na wielu etapach przepływu pracy jest niezbędna dla skutecznej realizacji tego procesu (Rysunek 1). Chociaż opisany tutaj zabieg rozpoczyna się od etapów po sekcji, jakość samego przekroju tkanki jest kluczowa dla optymalnych rezultatów. Grubość przekroju powinna być dostosowana do typu tkanki i oczekiwanej komórkowości. Podczas dysocjacji tkanek i izolacji jąder maksymalizacja wydajności jąder przy jednoczesnym zachowaniu integralności jądrowej jest kluczowa dla ogólnej wydajności testów wielokomórkowych opartych na Trekkerze. Niska wydajność jąder może wynikać z nieoptymalnej dysocjacji tkanek, nieefektywnej izolacji jąder lub niewystarczającej grubości przekroju. Zła integralność jądrowa może wynikać z nadmiernych zakłóceń mechanicznych, wydłużonych czasów przetwarzania lub nadmiernej lizy. Izolacja jąder stanowi kluczowy punkt rozwiązywania problemów dla pomyślnej implementacji workflow wielokomórkowego opartego na Trekkerze, jednokomórkowego multiomu. Dlatego zaleca się zdecydowanie optymalizację protokołu izolacji jąder specyficzną dla tkanek przed rozpoczęciem testu wielokomórkowego opartego na Trekkerze. Izolowane jądra powinny być oceniane ilościowo i jakościowo. Liczenie jąder za pomocą barwników jądrowych pozwala oszacować wydajność produkcji, natomiast badanie mikroskopowe pozwala ocenić integralność błony jądrowej, agregację oraz obecność odpadów niejądrowych. Po przygotowaniu biblioteki wszystkie biblioteki powinny zostać ocenione pod kątem rozkładów wielkości fragmentów oraz braku rozdzielaczy adapterowych. W bibliotekach CUT&Tag wzbogacenie docelowych regionów genomowych w tle powinno być oceniane za pomocą ilościowego PCR, co zapewnia wczesne wskazanie specyficzności testu i ogólnej jakości biblioteki przed sekwencjonowaniem. Kontrola jakości po sekwencjonowaniu jest równie ważna dla dokładnej interpretacji danych wieloprzestrzennych. Metryki takie jak wskaźniki mapowania, liczba fragmentów na jądro, wzbogacenie miejsca startu transkrypcji, wyniki fragmentów w szczytach dla CUT&Tag, złożoność genów oraz głębokość odczytu na komórkę powinny być oceniane zgodnie z zalecanymi wytycznymi 10x Genomics i Takara Trekker. Wspólna ocena tych wskaźników zarówno w modalnościach epigenomicznych, jak i transkryptomicznych umożliwia identyfikację artefaktów technicznych oraz zapewnia niezawodną integrację informacji przestrzennych, epigenomicznych i transkrypcyjnych.

Chociaż wykonalność podejścia opartego na Trekkerze z kodem kreskowym w połączeniu z jednokomórkowym testem CUT&Tag multiomowym jest wykazana w tym badaniu, opisane podejście ma również swoje ograniczenia. Na przykład metoda ta jest obecnie ograniczona do świeżo zamrożonej tkanki, a jej wykonalność została wykazana jedynie w profilowaniu pojedynczej modyfikacji histonowej (H3K27ac) w pojedynczym typie tkanki (mózg myszy) bez biologicznych replikacji. Ponadto podejście opiera się na dwóch komercyjnych platformach własnościowych (Takara Trekker oraz 10x Genomics Next GEM Chromium Single Cell Multiome). Dalsza ocena różnych typów tkanek oraz dodatkowych znaków epigenetycznych będzie konieczna, aby ocenić szerszą zastosowalność, wydajność, uogólnialność i powtarzalność tej technologii.

Podsumowując, przestrzenny protokół multiomowy Trekker–CUT&Tag przedstawiony tutaj demonstruje zdolność do przestrzennie rozdzielonego koprofilowania cech epigenomicznych i transkryptomicznych w pojedynczych komórkach. Łącząc przestrzenne kodowanie kreskowe z ugruntowaną chemią wielokomórkową jednokomórkową, umożliwia mechanistyczne badania regulacji genów w nienaruszonej architekturze tkanek i stanowi potężną platformę dla przyszłych zastosowań biologii przestrzennej. Znaczące potencjalne zastosowania obejmują ocenę wpływu różnych bodźców eksperymentalnych i środowiskowych na epigenetyczną kontrolę ekspresji genów w określonych typach komórek — na przykład efekty stymulacji nerwowych można analizować w określonych typach neuronów w ośrodkowym i obwodowym układzie nerwowym, a wpływ na pobliskie komórki infiltrujących komórki odpornościowe pro- i przeciwzapalne mogą być ujawnione w chorobach zapalnych i nowotworach.