Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł badawczy
Badanie to integruje farmakologię sieciową oraz eksperymenty in vivo , aby zbadać potencjalne efekty tabletki Yougui w leczeniu zapalenia prostaty. Analiza farmakologii sieciowej i leczenie YGP w modelu zapalenia prostaty u szczurów sugerowały, że terapeutyczne efekty YGP mogą być powiązane z regulacją odpowiedzi zapalnych, co wskazuje, że YGP wywiera działanie przeciwzapalne w zapaleniu prostaty.
Zapalenie prostaty to powszechne zaburzenie urologiczne z ograniczonymi opcjami leczenia. Pigułka Yougui (YGP) wykazała potencjalną wartość terapeutyczną, szczególnie w stanach związanych ze stanem zapalnym. Celem tego badania było ocenę jego skutków oraz zbadanie możliwych mechanizmów leżących u podstaw. Aktywne składniki YGP zostały przesiewowe z TCMSP według kryteriów biodostępności doustnej (OB ≥ 30%) oraz podobności do leku (DL ≥ 0,18), a także zebrano odpowiednie cele. Cele związane z zapaleniem prostaty uzyskano z GeneCards, a nakładające się cele analizowano za pomocą sieci interakcji białko-białko (PPI) oraz wzbogacenia encyklopedii genów i genomów z Kioto (KEGG). Zidentyfikowano łącznie 126 aktywnych związków i 208 potencjalnych celów, z czego 180 nakładających się celów związanych z zapaleniem prostaty. Analiza inhibitorów protonowych (IPP) wykazała TP53, IL6, AKT1, TNF i IL1B jako kluczowe geny hubów. Wzbogacenie KEGG sugerowało zaangażowanie szlaków związanych ze stanem zapalnym, w tym szlaków sygnalizacyjnych IL-17, TNF, MAPK i PI3K-Akt. Model zapalenia prostaty u szczurów został ustalony przez wstrzyknięcie karagenanu wewnątrz prostaty. Przeprowadzono badanie histologiczne oraz pomiar czynnika martwicy nowotworów-alfa (TNF-α) oraz interleukiny-6 (IL-6) w celu oceny efektów terapeutycznych. Leczenie YGP poprawiło histopatologię prostaty oraz obniżyło poziomy TNF-α i IL-6 zarówno na poziomie białka, jak i mRNA. Wyniki te sugerują, że YGP wywiera działanie przeciwzapalne w zapaleniu prostaty, podczas gdy konkretne mechanizmy molekularne pozostają do dalszej weryfikacji.
Zapalenie prostaty to stan, w którym gruczoł krokowy ulega zapaleniu, powodując obrzęk i podrażnienie1. Stanowi około 25% globalnych spotkań klinicznych urologicznych2. National Institutes of Health (NIH) podzieliły zapalenie prostaty na cztery kategorie: ostre bakteryjne, przewlekłe bakteryjne, przewlekłe zapalenie prostaty/przewlekły zespół bólu miednicy (CP/CPPS) oraz bezobjawowe zapalenie prostaty3. Spośród nich CP/CPPS jest najczęstszą formą i ściśle wiąże się z utrzymującym się stanem zapalnym oraz zaburzeniami odporności. Pomimo postępów w zrozumieniu zapalnej natury zapalenia prostaty, obecne strategie terapeutyczne pozostają ograniczone, szczególnie dla podtypów niebakteryjnych 4,5. Antybiotyki są powszechnie stosowane w praktyce klinicznej; jednak ich skuteczność w niebakteryjnym zapaleniu prostaty budzi duże spory6. Inne terapie, od blokerów α po niesteroidowe leki przeciwzapalne (NLPZ), koncentrują się głównie na łagodzeniu objawów, ale często wykazują efekty poniżej optymalnych, z niepomijalnym ryzykiem zaburzeń przewodu pokarmowego, niedociśnienia ortostatycznego i tak dalej 7,8,9,10. Te ograniczenia podkreślają potrzebę alternatywnych metod terapeutycznych, które skutecznie modulują stan zapalny w zapaleniu prostaty.
Tradycyjna medycyna chińska (TCM) może oferować szerszy zakres korzyści terapeutycznych z korzystniejszym profilem bezpieczeństwa i tolerancji11. Pigułka Yougui (YGP), klasyczna formuła udokumentowana w Jingyue Quanshu, była empirycznie stosowana od wieków do uzupełniania nerkowego jangu i łagodzenia powiązanych zaburzeń12. Poprzednie badania wykazały, że niektóre z jego składników wykazują działanie przeciwzapalne 13,14,15,16. Dowody kliniczne sugerują, że YGP może skutecznie łagodzić objawy zapalenia prostaty, choć mechanizm podstawowy pozostaje niejasny17. Farmakologia sieciowa stanowi potężne, integracyjne podejście, które łączy biologię systemów i farmakologię, aby odkryć złożone mechanizmy medycyny tradycyjnej18. Postawiono hipotezę, że YGP może wywierać działanie przeciwzapalne poprzez modulację wielu celów i szlaków związanych ze stanem zapalnym. Te przewidywania zostały dalej ocenione za pomocą modelu in vivo zapalenia prostaty, w którym zapalenie prostaty wywoływano przez zastrzyk karagenanu. Po wzorcowym ustanowieniu zwierzęta były traktowane metodą YGP. Tkanki prostaty zostały pobrane do badań histopatologicznych za pomocą barwienia hematoksyliny i eozyny (HE), a także do ilościowej oceny markerów zapalnych za pomocą enzymatycznego testu immunosorbentnego (ELISA) oraz ilościowej reakcji łańcuchowej polimerazy w czasie rzeczywistym (qRT-PCR).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wszystkie eksperymenty na zwierzętach zostały zatwierdzone przez Komitet ds. Opieki i Wykorzystania Zwierząt Uniwersytetu Chińskiego w Pekinie (BUCM-2024110107-4103).
Zbieranie aktywnych składników i celów
YGP składa się z Rehmannia glutinosa, Aconitum carmichaelii, Cinnamomum cassia, Dioscorea opposita, Cornus officinalis, Cuscuta chinensis, Angelica sinensis, Eucommia ulmoides, Cervi cornus colla oraz Lycium barbarum. Nazwy tych ziół zostały wprowadzone do tradycyjnej bazy danych farmakologii i analiz medycyny chińskiej (TCMSP), aby odzyskać ich związki. Związki aktywne były badane według biodostępności doustnej (OB ≥ 30%) oraz podobności do leku (DL ≥ 0,18) według kryteriów19, 20, 21. Odpowiadające cele każdego związku zostały uzyskane z TCMSP i ustandaryzowane do symboli genów przy użyciu bazy UniProt. Cele związane z zapaleniem prostaty zostały pobrane z bazy GeneCards przy użyciu słowa kluczowego "zapalenie prostaty", a do badania wybrano geny o wyższym wskaźniku relewancji niż średnia.
Budowa sieci regulacyjnej YGP przeciwko zapaleniu prostaty
Zidentyfikowano i zdefiniowano przecięcie celów związanych z YGP a zapaleniem prostaty jako zestaw potencjalnych celów terapeutycznych. Cele te zostały zaimportowane do Cytoscape (wersja 3.9.1), aby stworzyć sieć złożoną-cel-choroba. Analiza topologii sieci została przeprowadzona za pomocą wtyczki CytoHubba, a kluczowe komponenty zidentyfikowano na podstawie maksymalnej centralności kliki (MCC)22.
Analiza sieci interakcji białko-białko (PPI)
Nakładające się cele zostały zaimportowane do bazy danych STRING (wersja 11.5), z organizmem ustawionym na Homo sapiens. Minimalny wymagany wynik interakcji został ustawiony na ≥ 0,7, a niepołączone węzły były ukrytena 23. Dane interakcji zostały wyeksportowane w formacie TSV i zwizualizowane w Cytoscape. Geny hubów zostały dalej zidentyfikowane za pomocą wtyczki CytoHubba na podstawie centralności stopni.
Analiza wzbogacenia ścieżki KEGG i GO
Wspólne cele zostały przesłane na platformę Metascape do analizy szlaków Kyoto encyclopedia of genes and genomes (KEGG). Gatunki wejściowe i analizowe zostały ustawione na Homo sapiens. Przeprowadzono analizę wzbogacenia szlaku KEGG. Szlaki były dodatkowo filtrowane na podstawie ich związku z zapaleniem prostaty, co określano na podstawie opublikowanej literatury i adnotacji baz danych. Pozostałe ścieżki zostały uszeregowane według wartości Log P. Wzbogacone szlaki KEGG zostały zwizualizowane za pomocą wykresów bąbelkowych.
Dokowanie molekularne
Kluczowe cele zostały wybrane z sieci PPI na podstawie centralności stopnia, a związki aktywne zidentyfikowano z sieci regulacyjnej YGP-prostatitis na podstawie wartości MCC do późniejszej analizy dokowania. Struktury białek zostały uzyskane z bazy danych AlphaFold Protein Structure Database w formacie PDB, a struktury ligandów pobrano z TCMSP w formacie mol224. Dokowanie molekularne przeprowadzono za pomocą platformy onlineCB-Dock2 25. Przed dokowaniem struktury białek były automatycznie wstępnie przetwarzane poprzez usuwanie cząsteczek wody, dodawanie atomów wodoru oraz uzupełnianie brakujących reszt. Rejestrowano powinowactwa wiązania, a mapy ciepła generowano za pomocą GraphPad Prism (wersja 10.1.2). Trójwymiarowe struktury kompleksów ligand-białko o najniższych wynikach Vina zostały zwizualizowane za pomocą ChimeraX, a dwuwymiarowe diagramy interakcji wygenerowano za pomocą LigPlus.
Przygotowanie ekstraktu wodnego YGP
Składniki ziołowe YGP przygotowywano według tradycyjnego stosunku formułowania, w tym 24 g przetworzonego korzenia Rehmannia glutinosa (Shudihuang), 6 g przetworzonego bocznego korzenia Aconitum carmichaelii (Fuzi), 6 g kory Cinnamomum cassia (Rougui), 12 g kłącza Dioscorea przeciwległego (Shanyao), 9 g owocu Cornus officinalis (Shanzhuyu), 12 g nasion Cuscuta chinensis (Tusizi), 12 g przetworzonej żelatyny z poroża Cervi Cornus Colla (Lujiaojiao), 12 g owocu Lycium barbarum (Gouqi), 9 g korzenia Angelica sinensis (Danggui) oraz 12 g kory Eucommia ulmoides (Duzhong). Wszystkie zioła oprócz Aconitum carmichaelii i Cervi Cornus Colla były moczone w 6-krotnie większej masie wody destylowanej przez 30 minut, podczas gdy Aconitum carmichaelii było moczone osobno w 6 razy większej ilości wody destylowanej niż ona. Aconitum carmichaelii był najpierw wydekowany za pomocą elektrycznego urządzenia grzewczego przez 1 godzinę, po czym dodawano pozostałe zioła, z wyjątkiem Cervi Cornus Cola, i wydekowano je dwukrotnie przez 1 godzinę w każdym cyklu. Cervi Cornus Colla był następnie topiony w kąpieli wodnej w temperaturze 60–70 °C, aż do całkowitego rozpuszczenia i włączenia do ekstraktu. Po ostygnięciu wywar był filtrowany przez gazę dwuwarstwową, alicytatowany, zamrażany w -20 °C przez 48 godzin i liofilizowany, aby uzyskać ekstrakt w proszku.
Model zwierzęcy i projektowanie eksperymentalne
Samce szczurów Sprague-Dawley (8 tygodni, 200–220 g) były trzymane w określonych warunkach wolnych od patogenów, z 12-godzinnym cyklem światła/ciemności oraz swobodnym dostępem do jedzenia i wody. Po tygodniu aklimatyzacji szczury zostały losowo podzielone na trzy grupy (n = 6 na grupę): grupę kontrolną, modelową i YGP. Przewlekłe zapalenie prostaty wywołało wstrzyknięcie roztworu 3% karagenanu26 wewnątrzprostaty. Krótko szczury były znieczulone izofluranem (3–4% podczas indukcji i 1,5–2% w trybie utrzymywania), a następnie wykonano nacięcie środkowe brzucha, aby odsłonić prostatę. Do każdego płata brzusznego prostaty wstrzykiwano łącznie 25 μL roztworu 3% karagenu. Grupa kontrolna otrzymała jedynie zastrzyk soli fizjologicznej (roztwór fizjologiczny) wyłącznie wewnątrzprostaty. Penicylina pooperacyjna (2,5 × 10 5 U/kg) była podawana domięśniowo przez 3 dni.
Z wywaru przygotowano proszek z ekstraktu liofilizowanego YGP i zrekonstytuowano w 0,9% sterylnej soli fizjologicznej, aby uzyskać jednolitą zawiesinę do doustnej dawki (10,54 g/kg/dzień). Szczury z grupy YGP otrzymały doustne podawanie ekstraktu YGP (10 mL/kg), natomiast grupy kontrolne i modelowe otrzymały równoważną ilość 0,9% bezpłodnej soli fizjologicznej. Po 4 tygodniach szczury były znieczulone pentobarbitalem sodowym (50 mg/kg, zastrzyk dootrzewnowkowy), a tkanki prostaty pobierano po poświęceniu zgodnie z wytycznymi etycznymi.
Badanie histopatologiczne
Tkanki prostaty były utrwalane w 4% paraformaldehydu przez 24 godziny, odwodnione przez etanol klasyfikowany (75% alkoholu przez 4 godziny, 85% alkoholu przez 2 godziny, 90% alkoholu przez 2 godziny, 95% alkoholu przez 1 godzinę, absolutny etanol przez 1 godzinę), oczyszczane w ksylenie i osadzane w parafinie. Sekcje (4–5 μm) były następnie poddawane barwieniu HE zgodnie ze standardowymi procedurami27. Krótko przekroje były deparafinizowane, nawilżane, barwione hematoksyliną, zróżnicowane i przeciwbarwione eozyną. Po odwodnieniu i zamontowaniu cięcia obserwano pod mikroskopem świetlnym w celu oceny histopatologicznej.
Histopatologiczne zapalenie oceniano za pomocą półilościowego systemu punktacji opartego na infiltracji komórek zapalnych, proliferacji fibroblastów, morfologii acynaru oraz stanie wydzielania. Infiltracja komórek zapalnych została oceniona jako 0 (brak infiltracji), 2 (łagodne przeniknięcie), 4 (umiarkowane przeniknięcie) oraz 6 (ciężka infiltracja). Proliferacja fibroblastów oceniono jako 0 (nieobecna), 1 (łagodna), 2 (umiarkowana) i 3 (ciężka). Morfologia acjarów oceniono jako 0 (duży lumen acinarny), 1 (umiarkowanie zmniejszony rozmiar lumenu), 2 (wyraźnie zmniejszony rozmiar lumenu) oraz 3 (zatkanie lub zniknięcie acynary). Status wydzieliny ocenzono jako 0 (obfita wydzielina), 1 (umiarkowana wydzielina), 2 (niewielka wydzielina) i 3 (brak wydzieliny). Całkowity wynik histopatologiczny został obliczony jako suma wszystkich czterech parametrów, przy czym wyższe wyniki wskazują na poważniejsze uszkodzenie tkanki brzuszowej i stan zapalny28.
ELISA
Tkanki prostaty (100 mg) były płukane lodowato solą fizjologiczną z buforem fosforanowym (PBS) i homogenizowane w buforze lizy uzupełnionej inhibitorami proteazy. Homogenity były inkubowane w temperaturze 4 °C przez 30–120 minut i wirowane w 5000 × g przez 15 minut w 4 °C, aby zebrać supernatanty. Poziomy białka TNF-α i IL-6 mierzono za pomocą zestawów ELISA zgodnie z instrukcjami producenta. Standardy i próbki dodawano do płytek 96-dołkowych i inkubowano w temperaturze 37 °C, po czym następowała sekwencyjna inkubacja z biotinylowanymi przeciwciałami i sprzężonymi enzymami. Po umyciu dodawano roztwór podłoża do wywoływania koloru, a reakcję kończyno roztworem stopowym. Absorpcję zmierzono na 450 nm za pomocą czytnika mikropłyt. Stężenia cytokin były obliczane na podstawie standardowych krzywych.
qRT-PCR
Całkowite RNA zostało wyekstrahowane z tkanek prostaty metodą opartą na kolumnie i zmierzone przez pomiar absorpcji na 260 i 280 nm w celu oceny czystości. Próbki RNA zostały przepisane odwrotnie do cDNA w temperaturze 42 °C przez 15 minut przy użyciu zestawu do transkrypcji odwróconej. qRT-PCR wykonano za pomocą termocyklera w następujących warunkach: początkowa denaturacja w 95 °C przez 3 minuty, następnie 40 cykli 95 °C przez 10 s i 60 °C przez 30 s. Sekwencje pierwsze użyte w tym badaniu są wymienione w Tabeli Uzupełniającej 1. Sygnały fluorescencji zbierano podczas etapu wyżarzania/przedłużania. Poziomy ekspresji TNF-α i IL-6 zostały znormalizowane do wewnętrznego genu referencyjnego GAPDH. Relatywną ekspresję genów obliczono metodą 2−ΔΔCt .
Analiza statystyczna
Wszystkie dane prezentowane są jako średnia ± odchylenie standardowe (SD). Analizy statystyczne przeprowadzano za pomocą oprogramowania GraphPad Prism (wersja 10.1.2). Rozkład danych został oceniony pod kątem prawidłowości przed analizą. Różnice między wieloma grupami analizowano za pomocą jednokierunkowej analizy wariancji (ANOVA), a następnie testu post hoc Tukeya dla wielu porównań. Wartość p < 0,05 uznano za statystycznie istotną.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Identyfikacja składników bioaktywnych i genów docelowych
Zidentyfikowano łącznie 126 bioaktywnych składników w YGP spełniających kryteria (OB ≥ 30% oraz DL ≥ 0,18). odpowiadające 208 przewidywanym genom docelowym. Baza danych GeneCards wykazała 9 845 genów związanych z zapaleniem prostaty. Analiza Venna wykazała 180 nakładających się genów pomiędzy przewidywanymi celami YGP a genami związanymi z zapaleniem prostaty, co sugeruje, że te wspólne cele mogą pośredniczyć w leczeniu leczenia YGP przeciwko ...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Zapalenie prostaty jest patologicznie definiowane przez zwiększoną obecność komórek zapalnych w obrębie miąższa grucha brzuchowego, czyli mezenchymu28,29. W badaniu obejmującym ponad 5 milionów koreańskich mężczyzn śledzonym przez dziewięć lat, Kim i in. potwierdzili za pomocą analizy wielowymiarowej, że zapalenie prostaty znacząco zwiększa ryzyko rozwoju raka prostaty30. Jednak obecne leczenie kliniczne pozostaje ograniczone, szczególnie ...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Autorzy nie zgłaszają konfliktów interesów w tej pracy.
Autorzy z wdzięcznością dziękują za wsparcie finansowe z Fundamentalnych Funduszy Badań Badawczych dla Uniwersytetów Centralnych (2022-JYB-JBZR-037).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| 4% paradehydu i nbsp; | Beyotime | P0099-3L | |
| Baza danych o strukturze białek alfafałdowych | Baza danych o strukturze białek alfafałdowych | https://alphafold.ebi.ac.uk/ | |
| BeyoFast SYBR Green qPCR Mix (2X) | Beyotime | D7260 | |
| Platforma online bioinformatyki | Platforma online bioinformatyki | http://www.bioinformatics.com.cn/ | |
| Carrageenan | OriLeaf | S30559 | |
| CB-DOCK2 | CB-DOCK2 | http://183.56.231.194:8001/cb-dock2/php/blinddock.php | |
| Cytoscape | Cytoscape | https://cytoscape.org/ | |
| GeneCards | GeneCards | https://www.genecards.org/ | |
| Hematoksylina i eozyna (H& E) Zestaw do bejcowania | Beyotime | C0105S | |
| Metascape | Metascape | https://metascape.org/gp/index.html#/main/step1 | |
| Neutralny Balsam | Servicebio | WG10004160 | |
| Wosk parafinowy (do osadzania) | Servicebio | RP-15 | |
| Koktajl inhibitorów proteazy (100X) | Epizyme | GRF101 | |
| Zestaw Rat IL-6 ELISA | Beyotime | PI328 | |
| Rat TNF i alfa; Zestaw | Pekin 4A Biotech Co., Ltd | CRE0003 | |
| RNAeasy Animal Long RNA Isolation Kit z kolumną spinową | Beyotime | R0026 | |
| STRING | STRING | https://string-db.org/ | |
| TCMSP | TCMSP | https://www.tcmsp-e.com/#/database | |
| Uniprot | Uniprot | https://www.uniprot.org/ |