Strategie wstawiania soczewek specyficzne dla regionu obrazowania wapnia in vivo u myszy w obwodach korowych i hipokampowych

Podsumowanie

Przedstawiamy szczegółowy protokół dotyczący wstawiania soczewki specyficznej dla regionu i stabilizacji, umożliwiającego niezawodne obrazowanie wapnia in vivo u myszy, poprawiające powtarzalność i ograniczające proces prób i błędów w obrazowaniu wapniowym.

Streszczenie

Obrazowanie wapnia in vivo populacji neuronalnych za pomocą chirurgicznie wszczepionych soczewek optycznych jest szeroko stosowane do monitorowania aktywności populacji neuronów podczas zachowania. Jednak skuteczność operacji i jakość obrazowania zależy w kluczowym stopniu od ograniczeń anatomicznych, które różnią się w zależności od regionów mózgu. Protokół ten zapewnia specyficzne dla regionu wskazówki chirurgiczne dotyczące wyboru i wszczepienia soczewek obrazujących w często celowanych obszarach kory i hipokampa. Konkretnie opisuje on workflow chirurgiczny obejmujący lokalizację celu i wyrównanie czaszki, kraniotomię specyficzną dla regionu, a w razie potrzeby usunięcie lub aspirację tkanki nadłożnej, a także selekcję, wstawianie i utrwalanie odpowiednich soczewek i uchwytów. W szczególności opisujemy trzy strategie implantacji: konwencjonalne wszczepienie soczewki dla hipokampa brzusznego, implantację soczewki z aspiracją tkankową hipokampa grzbietowego oraz implantację soczewki pryzmatowej do obrazowania korowego. Dodatkowo dostarczamy praktycznych wskazówek, jak różnice w głębokości tkanki, architekturze naczyniowej i organizacji obwodów wpływają na kluczowe parametry chirurgiczne, takie jak średnica soczewki, rozmiar kraniotomii, zakres usuwania tkanek, szybkość wprowadzania, procedury hemostatyczne oraz metody fiksacji. Poprzez wyraźne dokumentowanie rozważań chirurgicznych, które często są niedostatecznie opisywane w metodach pisemnych, protokół ten ma na celu zmniejszenie prób i błędów podczas implantacji soczewki oraz poprawę powtarzalności eksperymentów. Ogólnie rzecz biorąc, protokół ten stanowi praktyczny przewodnik po wyborze i niezawodnym wdrażaniu strategii implantacji soczewek odpowiednich do regionu w obwodach korowych i hipokampowych.

Wprowadzenie

Obrazowanie wapnia in vivo za pomocą wszczepionych soczewek optycznych stało się centralną techniką monitorowania aktywności neuronalnej na poziomie populacji u zachowujących się zwierząt 1,2,3,4,5,6. Umożliwiając podłużne nagrania z genetycznie zdefiniowanych zespołów neuronalnych, podejście to dostarczyło kluczowych informacji na temat dynamiki obwodów leżących u podstaw percepcji, uczenia się i podejmowania decyzji 2,6,7,8. Jednak sukces obrazowania opartego na soczewkach zależy nie tylko od dostępu optycznego, ale także od starannego uwzględnienia specyficznych dla regionu ograniczeń anatomicznych. Obszary korowe, takie jak kora przedczołowa (PFC), struktury średniej głębokości, takie jak hipokamp grzbietowy, oraz głębokie cele, takie jak hipokamp brzuszny, różnią się znacząco orientacją obwodu i tolerancją na przemieszczenie tkanek, między innymi. Te różnice anatomiczne wymagają specyficznych dla regionu strategii chirurgicznych dotyczących wyboru soczewki i implantacji. Wcześniejsze badania wykazały wiarygodne metody obrazowania neuronów CA1 grzbietowych u myszy z głową przy użyciu pionowo wszczepionych soczewek 6,9,10,11, a soczewki oparte na pryzmacie są szeroko stosowane do obrazowania korowego ^7,8, gdzie boczny dostęp optyczny umożliwia całkowite lub laminarne zapisy specyficzne dla całości lub laminarnie, w zależności od orientacji obwodu docelowego. Chociaż te podejścia łączą wspólną zasadę dostępu optycznego za pomocą wszczepionych soczewek, nakładają one odrębne ograniczenia chirurgiczne, które muszą być uwzględniane w sposób specyficzny dla danego regionu.

Pomimo rosnącego przyjęcia tej techniki, częstym źródłem niepowodzeń eksperymentalnych nie jest nieporozumienie koncepcyjne, lecz brak wystarczająco szczegółowych, regionalnie specyficznych wskazówek chirurgicznych. W praktyce nieudane wyniki rejestracji często wynikają z nieprecyzyjnej kraniotomii, nieoptymalnego usunięcia tkanek lub niewystarczającego uwzględnienia specyficznych dla regionu ograniczeń naczyniowych i strukturalnych. Chociaż ogólne procedury implantacji soczewek zostały opisane w poprzednich protokołach^{9, 10, 11, 12, praktyczne} niuanse chirurgiczne decydujące o skuteczności obrazowania, zwłaszcza te różniące się w zależności od regionów docelowych, pozostają niedo do końca udokumentowane.

Ten protokół wideo wypełnia tę lukę, dostarczając wyraźnych, specyficznych dla regionu wskazówek dotyczących wyboru i implantacji soczewek w celach korowych i hipokampowych, wykorzystując PFC oraz grzbietowe i brzuszne regiony CA1 hipokampa jako reprezentatywne przykłady. Konkretnie opisujemy trzy strategie implantacji, każdą dostosowaną do anatomicznych i chirurgicznych ograniczeń docelowego regionu, podkreślając kluczowe punkty decyzyjne i techniczne pułapki związane z każdym z tych podejść.

W obrazowaniu CA1 hipokampa grzbietowego, stosunkowo duża średnica konwencjonalnych soczewek często wymaga aspiracji tkanki, aby stworzyć wystarczającą przestrzeń do implantacji. Jeśli usunięcie tkanek jest niepełne lub niewłaściwie wykonane, otaczająca tkanka może zostać skompresowana zamiast przesunięta, co prowadzi do nagromadzenia neuronów w pobliżu powierzchni soczewki i powstawania gęsto upakowanych warstw komórkowych, które zasłaniają zamierzoną płaszczyznę obrazowania. W przypadku hipokampa brzusznego, który znajduje się głęboko w mózgu, precyzyjne celowanie wymaga precyzyjnej kontroli kąta włożenia, trajektorii i prędkości penetracji, aby zminimalizować uszkodzenia tkanek i zapewnić prawidłowe ustawienie. Natomiast implantacja soczewek pryzmatyczną w obrazowaniu PFC kładzie większy nacisk na minimalizację krwawienia i zachowanie integralności kory poprzez precyzyjną kraniotomię i staranne wstawianie soczewek, aby uniknąć uszkodzenia naczyń.

Protokół ten jest przeznaczony dla naukowców planujących wdrożenie obrazowania wapnia opartego na soczewce GRIN w celach korowych lub hipokampowych u gryzoni, szczególnie tych, którzy napotkali trudności z powtarzalnością chirurgiczną lub jakością obrazowania. Najlepiej sprawdza się przy celowaniu w grzbietową część CA1, brzuszną CA1 lub korę przedczołową oraz przy użyciu standardowych soczewek GRIN lub pryzmatów w połączeniu z miniskosem lub równoważnym systemem obrazowania na głowie. Badacze skupiający się na innych obszarach mózgu lub korzystający z różnych konfiguracji sprzętu powinni traktować opisane tutaj zasady specyficzne dla regionu jako elastyczne wytyczne, a nie jako stałe procedury. Poprzez wyraźne dokumentowanie tych praktycznych kwestii, ten film ma na celu ograniczenie metody prób i błędów, poprawę powtarzalności w laboratoriach oraz dostarczenie zasadniczych ram do wyboru odpowiednich strategii implantacji.

Protokół

Wszystkie procedury opieki nad zwierzętami i eksperymentów zostały zatwierdzone przez Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt Koreańskiego Zaawansowanego Instytutu Nauki i Technologii (KAIST) pod numerem zatwierdzenia KA2025-060-V3. Wszystkie eksperymenty były zgodne z Przewodnikiem Narodowych Instytutów Zdrowia dotyczącym opieki i wykorzystania zwierząt laboratoryjnych. Podjęto wszelkie wysiłki, aby zminimalizować cierpienie zwierząt i zmniejszyć liczbę wykorzystywanych zwierząt.

1. Etapy przygotowawcze do operacji

UWAGA: Protokół ten został opracowany na 8-tygodniowych dorosłych myszach C57BL/6J oraz VIP-Cre knock-in (RRID: IMSR_JAX:000664, IMSR_JAX:031628). To samo ogólne podejście można zastosować do innych szczepów; jednak mogą być konieczne pewne korekty w szczegółach, takich jak współrzędne celu.

1. Znieczulaj mysz 3% izofluranem podanym przez wdychanie z przepływem 1 L·^min-1 w komorze indukcyjnej.
2. Przymocuj mysz w stereotaksyjnej ramie za pomocą drążek nausznych i załóż maskę znieczuloną na pysk.
   UWAGA: Utrzymuj takie samo stężenie środka znieczulającego przez cały zabieg.
3. Ustaw układ homeotermiczny na 33,5 °C, aby utrzymać temperaturę ciała podczas operacji.
4. Ogol miejsce po operacji i usuń pozostałe włosy wacikiem namoczonym w roztworze chlorheksydyny glukonianu.
5. Nałóż na oczy myszy smar do oczu i przykryj je małymi kawałkami folii aluminiowej, aby chronić je podczas operacji.
6. Przed nacięciem wykonaj uszczypnięcie palca, aby upewnić się, że mysz jest całkowicie znieczulona.
7. Wstrzyknij roztwór lidokainy 1% (zmieszany z 0,5% bupivakainą) lokalnie w miejscu nacięcia i podaj 1% roztwór ketoprofenu przez wstrzyknięcie domięśniowe.
8. Nacinaj skórę w kształcie eliptycznym, dopasowanym do odpowiedniej przestrzeni na kolejne wszczepienie głowy. Uważaj, by nie przeciąć mięśni wokół czaszki.
   UWAGA: Nadmierne nacięcie może wywołać rozległy stan zapalny, który może zakłócać długotrwałe nagrania z tego samego obszaru.
9. Używając sterylnych patyczków watowych, delikatnie cofnij nacięcie na boki. Oczyść odsłoniętą powierzchnię czaszki sterylnymi patyczkami wacikami, a następnie lekko zeskrobaj skrobakiem.
   UWAGA: Ten krok usuwa zanieczyszczenia i lekko chropuje powierzchnię, aby ułatwić późniejsze zafiksowanie soczewki i płyty głowy.
10. Aby wyrównać wzdłuż osi anteroposteriornej (AP), użyj bregma i lambda jako punktów orientacyjnych. Zmierz różnice wysokości między punktami odniesienia za pomocą igły o średnicy 26.
11. Jeśli oś AP nie jest pozioma, poluzuj maskę znieczuloną i reguluj wysokość adaptera szczękowego na ramie stereotaksyjnej do momentu, gdy różnica wysokości między bregmą a lambda wyniesie 0,02 mm.
12. Aby wyrównać wzdłuż osi medialnej (ML), użyj punktów ± 3 mm od linii środkowej jako punktów orientacyjnych.
13. Jeśli oś ML nie jest pozioma, popraw poprawne ustawienie drążków nausznych, aż różnica wysokości w lewo-prawo mieści się w granicach 0,02 mm.

2. Kraniotomia

1. Zaznacz docelowe miejsca (np. PFC, hipokamp) na czaszce igłą zanurzoną w tuszu. Podczas oznaczania docelowego miejsca zaznacz również granice wiercenia w kierunku przednim, tylnym, przyśrodkowym i bocznym.
   UWAGA: W przypadku PFC, gdzie implantacja jest kierowana przez punkty orientacyjne naczynia, obiektyw 1 mm wymaga otworu 1,5 mm (rysunek 1A). Dla hipokampa brzusznego, czyli celu głębokiego, soczewka 0,6 mm wymaga otworu o średnicy 0,8 mm (Rysunek 1B). W hipokampie grzbietowym, gdzie wymagana jest aspiracja tkanek, soczewka o średnicy 1 mm wymaga otworu o średnicy 1,2 mm (rysunek 1C), aby zminimalizować niepodpartą przestrzeń wokół soczewki i zmniejszyć boczne przesunięcie podczas pozycjonowania przed zafiksowaniem kleju.
2. Stwórz otwór o zaokrąglonym kształcie kwadratowym, używając wiertarki ręcznej prowadzonej oznaczeniami.
3. Podczas pierwszego etapu wiercenie powinno być wykonywane jak najbardziej pionowo, aby uniknąć powstawania ukośnych krawędzi.
4. Wykonuj wiercenie w kilku krótkich krokach, aby zminimalizować ryzyko uszkodzenia mózgu.
   UWAGA: Unikaj narwania twardego podczas tego procesu.
5. Gdy pozostała czaszka stanie się bardzo cienka (co potwierdza się delikatnym naciskiem kleszczy), odłóż płat kostny za pomocą kleszczy, uważając, by nie uszkodzić powierzchni mózgu.
6. Wygładz krawędzie przy zmniejszonej prędkości wiertła (Rysunek 2A). Jeśli ostre fragmenty kości pozostaną wzdłuż krawędzi czaszki (Rysunek 2B), mogą uszkodzić soczewkę lub powierzchnię mózgu.
7. Ostrożnie usuń wszelkie zanieczyszczenia kostne powstałe podczas wiercenia. Przepłukaj miejsce solą fizjologiczną, aby usunąć pozostałe fragmenty kości.

Rysunek 1. Reprezentatywne przykłady wiercenia czaszki dla każdego regionu docelowego Reprezentatywne zdjęcia czaszek myszy po kraniotomii. (A) Kraniotomia ukierunkowana na korę przedczołową. (B) Kraniotomia ukierunkowana na hipokamp brzuszny. (C) Kraniotomia ukierunkowana na hipokamp grzbietowy. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.

Rysunek 2. Wiercenie czaszki i wykańczanie krawędzi Schematyczne ilustracje wiercenia czaszki i wykańczania krawędzi. (A) Przekrój poprzeczny prawidłowo wykonanej kraniotomii z gładko wypolerowaną dolną granicą. (B) Przykład pokazujący ostre pozostałości kości spowodowane niewystarczającym polerowaniem dolnej krawędzi. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.

3. Przygotowanie tkanek przed implantacją

Przed włożeniem soczewki przygotuj tkankę tak, aby umożliwić stabilne wstawienie. W zależności od celu można użyć metody 3.1 lub 3.2.

1. Usunięcie mięśnia twardego (hipokampa brzusznego, kory przedczołowej): Jeśli zostanie wykonana aspiracja tkanki mózgowej, usunięcie opona twardego nie jest konieczne. Jednak jeśli soczewka zostanie wszczepiona bez aspiracji tkanki, opona twarda musi zostać usunięta.
   1. Aby usunąć oponę twardą, lekko wygiń końcówkę igły strzykawki insulinowej i użyj jej jako narzędzia tnącego.
   2. Ostrożnie nacinaj oponę twardą w małych krokach. W razie potrzeby trzymaj naciętą tkankę drobnymi kleszczemi, krojąc pozostałe fragmenty. Uważaj, aby nie uszkodzić mózgu podczas tego procesu.
2. Aspiracja tkanki górnej (dla hipokampa grzbietowego): Stosując to podejście, wymagana jest minimalna dwutygodniowa przerwa między iniekcją wirusa a wszczepieniem soczewki, aby zapobiec utracie lub spadkowi ekspresji wirusa spowodowanej aspiracją.
   UWAGA: Nie zaleca się aspiracji tkanek przed podaniu wirusa, ponieważ wstrzyknięcie w świeżo uszkodzoną tkankę może zaburzyć stabilną ekspresję. Z kolei dłuższy okres rekonwalescencji po aspiracji również nie jest optymalny, ponieważ odrost tkanek może utrudniać późniejsze implantowanie soczewki.
   1. Podłącz pompę do węża o średnicy 8 mm, który następnie jest podłączony do końca strzykawki o pojemności 1 ml. Wszystkie połączenia są szczelnie uszczelnione taśmą, aby zapobiec wyciekowi powietrza.
      UWAGA: Użyj pompy aspiracyjnej zdolnej do wygenerowania maksymalnego ciśnienia ujemnego co najmniej 50 kPa. Ponieważ pompa może generować znaczne drgania, ustaw ją z dala od stołu chirurgicznego.
   2. Podłącz wygładzoną igłę 24 gauge do końca podłączonej strzykawki 1 mL (Rysunek 3).
   3. Zwiększ ciśnienie pompy aspiracyjnej do co najmniej 50 kPa.
   4. Ostrożnie przybliż końcówkę igły do tkanki, aby tkanka została zasysana wraz z solą fizjologiczną. Podczas tego etapu jedną ręką manipuluj igłą aspiracyjną, a drugą ręką nieprzerwanie aplikuj sól fizjologiczną strzykawką. Zapobiega to zasłanianiu widzenia przez krew i ułatwia płynne zadychanie.
      UWAGA: Chociaż podczas zachłysania przewiduje się krwawienie, nie wymaga to powtarzających się cykli aspiracji i hemostazy. Co ważne, należy unikać nadmiernego zachłaniania w miejscach aktywnego krwawienia, ponieważ może ono nasilać krwotok poprzez dodatkowe zakłócenia mechaniczne.
   5. Wykonuj aspirację tkanek w małych odstępach. W odstępach czasu płukaj pole operacyjne solą fizjologiczną, aby ocenić zakres i miejsce usuwania tkanek.
   6. Usuwaj tkankę mózgową powyżej celu w lejkowatym kształcie objętości, wyśrodkowanej wokół celu, zamiast usuwać tkankę przez całe otwarcie. Schematyczna ilustracja tego zabiegu znajduje się na rysunku 4.
      UWAGA: Aby to osiągnąć, nie podchodzić do tkanki tylko pod jednym kątem; zamiast tego dostosuj igłę pod różnymi kątami podczas aspiracji.
   7. Usuwanie tkanek powinno zakończyć się nieco powyżej docelowego obszaru, pozostawiając cienką warstwę nienaruszoną. W hipokampie grzbietowym aspiracja przebiega do poziomu korpusu modzelowatego; Aspiracja zostaje przerwana, gdy istota biała pod korą stanie się widoczna (nie usuwaj korpusu modzelowatego).
3. Jeśli krwawienie występuje po usunięciu twardej lub aspiracji tkanek, należy nałożyć gąbkę żelatynową (np. Cutanplast) namoczoną w schłodzonej soli fizjologicznej (4 °C), aby ograniczyć krwawienie przed krzepnięciem. Uważaj, aby krew nie pozostała w polu operacyjnym.
   UWAGA: Zamiast wycierać krew, delikatnie naciskaj gąbką.
4. Po odsłonięciu mózgu nałóż na to miejsce gąbkę nasączoną solą fizjologiczną, aby utrzymać wilgotność tkanek przez cały zabieg aż do implantacji soczewki.

Rysunek 3. Konfiguracja urządzenia aspiracyjnego Zdjęcie ukończonego zespołu urządzenia aspiracyjnego. Dalszy koniec rurki jest podłączony do pompy aspiracyjnej, a wszystkie złącza są szczelnie uszczelnione, aby zapewnić stabilne ssanie. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 4. Aspiracja tkanek podczas przygotowań do kraniotomii Schematyczna ilustracja przedstawiająca przybliżoną głębokość i zakres aspiracji tkanki wymaganej do implantacji soczewki ukierunkowanej na dCA1. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

4. Implantacja soczewki

Opisane zostaną tutaj dwie metody implantacji soczewek. Oba polegają na wstawianiu soczewki poprzez jej przesunięcie w tkankę, ale różnią się sposobem nakładania soczewki. Wybierz odpowiednią metodę z sekcji 4.1 i 4.2.

1. Implantacja soczewki z aluminiowym uchwytem (dla PFC i brzusznego CA1)
   1. Przed zabiegiem chirurgicznym upewnij się, że soczewka GRIN (lub pryzmat) jest trwale zamocowana w aluminiowym uchwytie^{soczewki nr 9} za pomocą superkleju.
   2. Bezpośrednio przed wszczepieniem sterylizuj wystającą soczewkę i uchwyt soczewki poprzez zanurzenie w roztworze 0,5% chlorheksydyny glukonianu. Przed włożeniem soczewki upewnij się, że roztwór całkowicie wyschł.
   3. Zamontuj gotową jednostkę uchwytu na obiektyw na manipulatorze stereotaksyjnego, dbając o mocne dokręcenie nakrętek, aby zapobiec przesunięciu podczas wstawiania.
   4. Ponieważ soczewka może nie być idealnie ortogonalna do uchwytu, najpierw ręcznie wyrównaj gwintowany pręt okiem, aby upewnić się, że jest poziomo wyrównany z ramą stereotaksyjną lub otaczającymi punktami orientacyjnymi.
   5. Po osiągnięciu wizualnego wyrównania użyj mikroskopu stereoskopowego, aby ustawić punkt odniesienia zerowego na bregma.
   6. Obniż obiektyw ze stałą częstotliwością 0,5 mm·^min-1 (dla PFC). W głębokich obszarach mózgu, takich jak hipokamp brzuszny, stosuj wolniejsze tempo wstawiania, aby zminimalizować uszkodzenia tkanek i zapewnić precyzyjne celowanie.
   7. Podczas implantacji soczewki w hipokamp brzuszny przesuwaj soczewkę o 0,2 mm co 2 minuty, aż osiągniesz głębokość 2,0 mm. Kontynuuj powolne obniżanie obiektywu z 2,0 mm do 3,0 mm.
   8. Etap przesunięcia jest zmniejszany do 0,1 mm co 2 minuty, przekraczając głębokość 3,0 mm.
   9. Obniżaj obiektyw stopniowo o 0,05 mm co 2 minuty, aż osiągniesz docelową głębokość celu.
   10. Ponieważ ten proces często powoduje znaczne krwawienie, należy nałożyć małe kawałki gąbki żelatynowej nasączonej w sterylnej soli fizjologicznej do miejsca kraniotomii, aby utrzymać wyraźne pole i kontrolować krwawienie podczas przesuwania soczewki.
   11. Gdy soczewka osiągnie docelową głębokość, odczekaj co najmniej 10 minut, aż miejsce operacji całkowicie wyschnie. Resztkowa wilgoć może ograniczyć przyczepność cementu dentystycznego.
   12. Po wyschnięciu nakładaj klej, aż cały zespół będzie pokryty, pozostawiając odsłoniętą tylko górną powierzchnię uchwytu na obiektyw.
   13. Po całkowitym utwardzeniu kleju, aby zminimalizować wstrząsy mechaniczne podczas odłączania uchwytu, częściowo poluzuj drążki nauszne.
   14. Przytnij mostek uchwytu szczypcami. Po zakończeniu cięcia ponownie dokręć nauszniki, zanim przejdziesz do kolejnych kroków.
2. 4.2. Implantacja soczewki z pompą aspiracyjną (dla grzbietowego CA1)
   1. Przygotowanie uchwytu na obiektyw: Podłącz wąski koniec końcówki P1000 do gumowego węża o średnicy 4 mm, a przeciwległy koniec węża podłączony jest do strzykawki o pojemności 1 mL. Wszystkie połączenia są uszczelniane taśmą teflonową, aby zapewnić szczelność połączenia.
   2. Zamontuj strzykawkę o pojemności 1 mL podłączoną do węża poziomo na uchwytie stereotaksyjnym.
   3. Zespół grotu: Zakończenie końcówki P1000 odciąć na odległość 2 i 27 mm od wąskiego końca, a segment o długości 2–27 mm zachować. Końcówkę P200 wytnij na 24,5, 27 i 45 mm od wąskiego końca, a segmenty o wymiarach 0–24,5 mm i 27–45 mm zachowaj (rysunek 5A).
   4. Włóż segment 0–24,5 mm końcówki P200 w segment o długości 27–45 mm i przymocuj superglue (np. Loctite, rysunek 5B). Włóż złożone segmenty P200 do segmentu końcówki P1000 i przymocuj je superglue. Wyrównaj osie centralne wszystkich segmentów końcówek. Ustaw odległość między końcem końcówki P1000 a wąskim końcem wewnętrznej końcówki P200 na 1 mm (rysunek 5C).
   5. Usuń igłę aspiracyjną przymocowaną do strzykawki i załóż uchwyt na soczewkę przymocowaną do uchwytu stereotaksyjnego (opisany powyżej).
   6. Sterylizuj soczewkę, zanurzając ją w roztworze 0,5% chlorheksydyny glukonianu przed załadowaniem do uchwytu.
   7. Zamontuj uchwyt obiektywu na systemie stereotaksyjnym i ustaw pompę próżniową na ≥ 50 kPa. Przymocuj zespół końcówki (opisany powyżej) do uchwytu za pomocą zacisku i załaduj obiektyw do zespołu końcówki za pomocą kleszczy.
   8. Ustawienie obiektywu: Po potwierdzeniu stabilnego przymocowania soczewki do zespołu końcówki, ustaw dolną krawędź obiektywu w pozycji bregmy jako punkt odniesienia, a następnie przesuń się do miejsca docelowego. Przesuń soczewkę o dodatkową odległość równą jej promieniowi (w tym przypadku 0,5 mm) wzdłuż osi przedniej (AP), aby wyrównać środek soczewki z celem.
   9. Ustaw czubek soczewki z przyśrodkową krawędzią kraniotomii.
   10. Obniż obiektyw o 1,7 mm wzdłuż osi grzbietowej (DV) (dla grzbietowej CA1). Jeśli podczas postępu pojawi się krwawienie, powoli cofnij soczewkę, zatrzymaj krwawienie, usuń krew z soczewki i ponownie zacznij wstawianie.
       UWAGA: Przesuwaj pierwsze 0,7 mm z prędkością 0,1 mm na 10 s i powoli przesuwaj pozostałe 1 mm z prędkością 0,2 mm na minutę.
   11. Gdy soczewka dotrze do celu, mocuj soczewkę (opisaną poniżej) za pomocą Superbond i cementu dentystycznego po całkowitym wyschnięciu powierzchni czaszki. Na tym etapie należy uważać, aby klej nie stykał się z interfejsem między soczewką a uchwytem.
   12. Aby zdjąć uchwyt po zafiksowaniu, wyłącz odkurzacz, a następnie odłącz uchwyt i wąż.
       UWAGA: Ta sekwencja zapewnia, że po wyłączeniu pompy nie pozostaje w systemie resztkowe ujemne ciśnienie.
   13. Podnieś uchwyt ostrożnie, aby nie upuścić zespołu końcówki.

Rysunek 5. Zespół końcówek (A) Segmenty końcówek pipet P1000 i P200 używane do konstrukcji zespołu końcówek. (B) Schemat konfiguracji złożonej. Włóż mniejszy segment końcówki P200 do większego segmentu końcówki P200, a następnie przyłóż segment końcówki P1000 na zewnątrz. (C) W pełni złożony zespół końcówki. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.

5. Cementowanie

1. Nałóż cement z żywicy dentystycznej (np. Super-Bond C&B), aby pokryć powierzchnię czaszki oraz boczną powierzchnię soczewki.
2. Po całkowitym utwardzeniu kleju usuń uchwyt na obiektyw, jak opisano powyżej.
3. Użyj cementu dentystycznego, aby pokryć odsłoniętą czaszkę kopułowatą warstwą. Upewnij się, że soczewka nie wystawa ponad poziom cementu dentystycznego.
4. Nałóż cement lub lakier do paznokci wokół soczewki, aby zapobiec zakłóceniom od światła otoczenia.
5. Aby chronić obiektyw, pokryj powierzchnię obiektywu silikonowym uszczelniaczem (np. Kwik-Cast). Po utwardzeniu silikonowego uszczelniacza nałóż klej silikonowy (np. Kwik-sil) na cement dentystyczny (rysunek 6).
   UWAGA: Protokół ten opiera się na wszczepieniu standardowej soczewki GRIN. Dlatego po powrocie do zdrowia konieczna jest wtórna operacja podstawy. Odczekaj 4-8 tygodni od podania na odpowiednią ekspresję wirusa, a następnie zidentyfikuj optymalną płaszczyznę ogniskową przed trwałym zamocowaniem płytki podstawowej.

Rysunek 6. Schematy cementowania i uszczelniania do utrwalania soczewek Schematyczne ilustracje fiksacji soczewki po implantacji. Superbond nakłada się na boczną powierzchnię soczewki i otaczającą czaszkę (szarą). Po całkowitym utwardzeniu superwiązania cement dentystyczny jest gromadzony w kształcie kopuły, aby odpowiadać wysokości soczewki (różowy). Po utwardzeniu cementu nakłada się silikonowy uszczelniacz pokrywający powierzchnię soczewki (zielony). Na koniec nakłada się klej silikonowy, aby pokryć i otoczyć cementową kopułę (jasnoniebieski). (A) Fiksacja soczewki skierowana na grzbietowy hipokamp. (B) Skupienie soczewki skierowane na PFC. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figury.

Wyniki

Analiza histologiczna po implantacji soczewki z wykorzystaniem powyższego protokołu potwierdziła dokładne umieszczenie zarówno soczewki GRIN, jak i pryzmatycznej soczewki GRIN. W obu przypadkach soczewki zostały prawidłowo ustawione, aby rejestrować aktywność nerwową z przyśrodkowej kory przedczołowej (rysunek 7A) oraz regionu CA1 hipokampa grzbietowego (rysunek 7B).

Dyskusja

Skuteczność obrazowania wapnia in vivo opartego na soczewce zależy od kilku etapów chirurgicznych, które różnią się w zależności od obszarów mózgu i geometrii soczewek, z których każdy bezpośrednio determinuje jakość i wiarygodność zarejestrowanych sygnałów. Rysunek 10 podsumowuje ogólny przebieg operacji dla każdej strategii implantacji. Dokładne dopasowanie rozmiarów po kraniotomii to krok podstawowy: otwór zbyt duży względem średnicy soczewki zmniejsza wsparcie strukturalne i zwi...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
8  mm (średnica zewnętrzna) węż	Tygon	E-3603
Pompa aspiracyjna	Cliq	VC-701
cement (Contemporary Ortho-Jet Liquid)	Lang Dental Mfg. Co.	1506, czarne
cement (Contemporary Ortho-Jet Powder)	Lang Dental Mfg. Co.	1530,
Ciężkie zastrzyki bupiwakainy HCl	Myungmoon	649801341
Roztwór chlorheksydyny glukozonianu 5%	Sungkwang	657400190
Cutanplast (dentystyczny	Mascia Brunelli	5610101
Cement dentystyczny	Wierzchołek	Typ 2, Klasa 2
Wiertło (średnica grotu: 0,5  mm)	Narzędzia Nauki Ścisłej	19007-05
Lubrykant do oczu (Optixcare Pet Eye Lube Plus)	Aventix Animal Health	OPX-4242
Kleszcze	Narzędzia Nauki Ścisłej	11254-20, 11051-10
Obiektyw GRIN (0,6  &razy;   7,3  mm)	Inscopix	1050-004597
Obiektyw GRIN (1,0  &razy;   4,0  mm)	Inscopix	1050-004595
System homeotermiczny do kontroli temperatury ciała u małych zwierząt	Aparat Harvarda	Model: HB101
Izofluran (Terrell)	Piramal	NDC 66794-011-25
Zastrzyk z ketoprofenu 100  mg/2  mL	Bukwang	642201001
Kwik-Cast	Światowe Precyzyjne Instrumenty	KWIK-CAST
Kwik-Sil	Światowe Precyzyjne Instrumenty	KWIK-SIL
Zastrzyk z hydratu lidokainy HCl 2%	Daihan	645104361
Lakier do paznokci ()	Wakemake	11
Obiektyw GRIN z pryzmatem (1,0 x 4,3 mm)	Inscopix	1050-004601
Roztwór soli fizjologicznej	JW Pharmaceutical Corporation	201703175
Stereo mikruzor	Olympus	SZ61
Uchwyt stereotaksowy (standardowy uchwyt elektrody)	KOPF	Model 1770
Super bond C& B (Katalizator)	Sun Medical	0334-0010
Super bond C& B (radioplastik typu L)	Sun Medical	0334-0020
Super bond C& B (Monomer)	Sun Medical	0334-0013
Nożyczki chirurgiczne	Narzędzia Nauki Ścisłej	14060-10
Klej UV (Norland Optical Adhesive)	Norland Products	NOA 63