Okno z optycznie przezroczystą czaszką (HOTS) na głowie do głębokiego obrazowania przezczaszkowego kory myszy

Podsumowanie

Protokół ten opisuje okno optycznie przezroczystej czaszki (HOTS) zamontowane na głowie, oparte na zoptymalizowanej, dwuetapowej procedurze oczyszczania czaszki. Takie podejście daje wysoce przezroczystą czaszkę, umożliwiającą dwufotonowe obrazowanie kory mózgowej dorosłej myszy na głębokości do ~800 μm.

Streszczenie

Dwufotonowe obrazowanie wysokorozdzielcze kory mózgowej dorosłej myszy jest poważnie ograniczone przez rozpraszanie światła z czaszki, które tłumi sygnały i ogranicza głębokość obrazowania in vivo. Chociaż opracowano metody oczyszczania czaszki, aby zapewnić optyczny dostęp do kory przez nienaruszoną czaszkę, ich praktyczna wydajność jest ograniczona przez ograniczony czas oczyszczania i nieoptymalne koktajle oczyszczania. Przedstawiamy tutaj szczegółowy protokół implementacji okna HOTS montowanego na głowie optycznie przezroczystego na głowie (HOTS). W tym podejściu używano nasady na głowie, aby utrzymać roztwory oczyszczające czaszkę, unikając tym samym długotrwałej znieczulenia lub fizycznego unieruchomienia oraz umożliwiając długotrwałe oczyszczanie czaszki (kilka godzin) u przytomnych, swobodnie zachowujących się myszy. Dodatkowo przeprowadzono dwustopniową procedurę oczyszczania z użyciem odczynników (HOTS-S1: 10% wt/v EDTA, 15% wt/v D-mannoza, 10% wt/v sulfolanu, 0,5% wt/v Tween 20; HOTS-S2: 70% wt/v D-mannoza, 5% wt/v sulfolanu, 0,5% wt/v Tween 20) zoptymalizowane poprzez systematyczne badania chemiczne. Oferujemy protokół krok po kroku, który obejmuje ekspozycję czaszki i stabilizację, tworzenie i montaż nasadki na głowie, podanie i odświeżanie odczynników oczyszczających oraz przygotowanie obrazowania. U myszy mających 6 tygodni (~20 g) protokół HOTS rutynowo tworzy wysoce przezroczystą czaszkę, która umożliwia obrazowanie dwufotonowe struktur korowych na głębokości do ~800 μm poniżej pia, co zbliża się do wydajności okien z otwartą czaszką. Okno HOTS umożliwia obrazowanie strukturalne u myszy Thy1-GFP-M oraz funkcjonalne obrazowanie wapnia u myszy Thy1-GCaMP6. Uważamy, że jako wygodne i minimalnie inwazyjne podejście, okno HOTS znacząco ułatwi głębokie obrazowanie przezczaszkowe oraz manipulacje optogenetyczne, fotofarmakologiczne i inne manipulacje oparte na świetle in vivo.

Wprowadzenie

Monitorowanie neuronów korowych wewnątrzżyciowych jest niezbędne do zrozumienia struktury i funkcji mózgu¹. Mikroskopia dwufotonowa (TPM) jest kluczowym narzędziem w takich badaniach in vivo ^2,3. Jednak jakość i głębokość obrazowania są poważnie ograniczone przez silne rozpraszanie światła z nieprzezroczystej czaszki leżącej nad korą ^4,5.

Okna z otwartą czaszką⁶ i przecieńczoną czaszką ^7,8 znacznie poprawiły optyczny dostęp do kory i są szeroko stosowane, jednak oba podejścia mają swoje ograniczenia. Otwarte okna czaszki mogą wywołać ostre uszkodzenia mózgu i reakcje zapalne ^9,10, podczas gdy przerzedzenie czaszki jest technicznie wymagające i trudne do osiągnięcia jednolitej grubości^11,12.

Techniki optycznego oczyszczania czaszki in vivo oferują minimalnie inwazyjną alternatywę, która umożliwia obrazowanie dwufotonowe w rozdzielczości aksonalnej u dorosłych myszy. Jednak osiągalna głębokość obrazowania pozostaje ograniczona (zazwyczaj 150–400 μm poniżej pia)12,13,14,15. W praktyce oczyszczanie czaszki zwykle ogranicza się do krótkiego okresu pod znieczuleniem przy sztywnym fiksowaniu głowy, a systematyczna optymalizacja koktajli oczyszczania dla składu kości czaszki pozostaje niedostatecznie zbadana 12,13,14,15.

Aby przezwyciężyć te ograniczenia, wcześniej opracowaliśmy na głowie zamontowane okno optycznie przezroczyste czaszki (HOTS), które umożliwia długotrwałe, wyłączone oczyszczanie czaszki u wolno zachowujących się myszy (Rysunek 1A)¹⁶. Podejście to wykorzystuje dwustopniową procedurę oczyszczania z użyciem odczynników (S1 i S2), które zostały zoptymalizowane poprzez systematyczne przesiewanie chemiczne w naszej poprzedniej pracy¹⁶. Systematyczna optymalizacja odczynników oczyszczających oraz charakterystyka skuteczności oczyszczania, odwracalności, biobezpieczeństwa i wydajności obrazowania in vivo okna HOTS zostały opisane w naszej poprzedniej pracy¹⁶, która również wykazała korzystną odpowiedź astroglialną po leczeniu HOTS. Przedstawiamy tutaj krok po kroku protokół ustanawiający okno HOTS, umożliwiające głębokie przezczaszkowe obrazowanie dwufotonowe u dorosłych myszy. W reprezentatywnych przygotowaniach głębokości obrazowania sięgają ~800 μm poniżej pia, niemal odpowiadając tym osiągalnym przy otwartych oknach. Okno HOTS umożliwia głębokie obrazowanie strukturalne u myszy Thy1-GFP-M oraz funkcjonalne obrazowanie wapnia u myszy Thy1-GCaMP6 w stanie obudzenia.

Protokół

Wszystkie procedury opieki nad zwierzętami i eksperymentów zostały zatwierdzone przez Prowincjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt Guangdong i przeprowadzane zgodnie z wytycznymi Komitetu Etyki Eksperymentów na Zwierzętach Instytutu Zaawansowanych Technologii w Shenzhen, Chińskiej Akademii Nauk. Odczynniki i sprzęt używany w tym protokole są wymienione w Tabeli Materiałów.

UWAGA: Protokół ten jest zoptimizowany dla myszy w wieku 6 tygodni (masa ciała ~20 g), których grubość czaszki wynosi około 100 μm.

1. Przygotowanie roztworów oczyszczających czaszkę

1. Przygotuj roztwór oczyszczający czaszkę S1 (10% wt/v EDTA, 15% wt/v D-mannoza, 10% wt/v sulfolanu, 0,5% wt/v Tw. 20; RI: 1,38; pH: 7,0-7,4)
   1. Waż 0,35 g wodorotlenku sodu (NaOH). Dodaj do 20 ml wody dejonizowanej w zlewce i mieszaj, aż całkowicie się rozpuści. To podnosi pH roztworu, ułatwiając późniejsze rozpuszczanie EDTA.
      UWAGA: NaOH jest żrący. Noś odpowiedni sprzęt ochrony osobistej (rękawice, fartuch laboratoryjny, ochronę oczu) i załóż okap chemiczny.
   2. Dodaj 4 g etylendiaminetetraoctowego kwasu octowego (EDTA) do roztworu NaOH. Włóż zlewkę do kąpieli wodnej o temperaturze 40 °C i mieszaj ciągle, aż EDTA całkowicie się rozpuści.
   3. Ostygaj mieszankę do temperatury pokojowej. Do roztworu dodaj 6 g D-mannozy, 4 g siarki i 0,2 g Tween 20. Mieszaj w temperaturze pokojowej, aż wszystkie składniki całkowicie się rozpuszczą.
   4. Dodaj wodę dejonizowaną, aby uzyskać końcową objętość do 40 mL. Dokładnie wymieszaj, aby uzyskać S1.
      UWAGA: S1 można przechowywać w temperaturze pokojowej przez kilka miesięcy.
2. Przygotuj roztwór oczyszczający czaszkę S2 (70% masowo/v-mannoza D-mannoza, 5% masowo-v-sulfolanu, 0,5% masa/v Tydzień 20; końcowe stężenie (RI): 1,44; końcowe pH: 7,0-7,4)
   1. Waż 28 g D-mannozy, 2 g sulfolanu i 0,2 g Tween 20 i przelej je do czystej zlewki.
   2. Dodaj wodę dejonizowaną do około 30 ml i mieszaj w temperaturze pokojowej, aż wszystkie składniki całkowicie się rozpuszczą.
   3. Dodaj wodę dejonizowaną, aby uzyskać ostateczną objętość do 40 mL i dokładnie wymieszaj, aby uzyskać S2.
      UWAGA: Delikatne podgrzewanie (25–30 °C) i ciągłe mieszanie przyspieszają rozpuszczanie D-mannozy. S2 można przechowywać w temperaturze pokojowej przez kilka miesięcy.

2. Przygotowanie do operacji

1. Autoklawuj wszystkie narzędzia chirurgiczne i dokładnie sterylizuj miejsce pracy 75% alkoholem.
2. Znieczulony mysz poprzez podanie 1% (w/v) pentobarbitalu sodu (150–200 μL na 20 g masy ciała).
   UWAGA: Inne odwracalne środki znieczulające mogą być stosowane jako alternatywy dla pentobarbitalu sodu.
3. Monitoruj głębokość znieczulenia za pomocą testu odruchu zaciskania palców u stóp i upewnij się, że mysz jest całkowicie znieczulona przed rozpoczęciem operacji.
4. Umieść mysz w stereotaksyjnej ramce i zabezpiecz głowę za pomocą drążek na uszach.
5. Utrzymuj temperaturę ciała na poziomie 37 °C za pomocą termoforu.
6. Nakładaj maść okulistyczną na oba oczy, aby zapobiec wysuszaniu rogówki.
   UWAGA: Uważnie monitoruj oddychanie i odruchy, aby uniknąć przedawkowania znieczulenia i depresji oddechowej.

3. Operacja i montaż płyty głowowej

1. Odsłonięcie czaszki i czyszczenie (Rysunek 1Ba)
   1. Usuń skórę głowy z całej grzbietowej powierzchni czaszki za pomocą cienkich kleszczy i nożyczek chirurgicznych. Przycinaj skórę bocznie, aby odsłonić krawędzie mięśni skroniowych i z tyłu, w kierunku mięśni szyi.
   2. Delikatnie usuń okost z powierzchni czaszki za pomocą cienkich kleszczy.
   3. Oczyść powierzchnię czaszki wilgotnym aplikatorem z bawełnianą końcówką i wysuszyć ją delikatnym strumieniem powietrza.
   4. Jeśli wymagana jest precyzyjna lokalizacja obszarów funkcjonalnych kory mózgowej, należy zaznaczyć punkty odniesienia rozmieszczone w odstępach 1 mm na powierzchni czaszki za pomocą aparatu stereotaktycznego.
2. Nakładanie cementu dentystycznego i płyty głowowej (Rysunek 1Bb)
   1. Przygotuj cement dentystyczny zgodnie z instrukcjami producenta. Zaleca się stosowanie cementów stomatologicznych o silnej przyczepności i dobrej trwałości, odpowiednich do długotrwałego utrwalenia, aby zapewnić stabilne przymocowanie.
   2. Nałóż cienką warstwę cementu dentystycznego na odsłoniętą powierzchnię czaszki i otaczające tkanki dla ochrony, pozostawiając obszar wyznaczony na okno oczyszczania niepokryty.
      UWAGA: Po wymieszaniu składników proszkowych i płynnych cementu dentystycznego w stosunku objętościowym 1:1, odczekaj około 10 sekund, aż cement przylega do czubka wykałaczki przed aplikacją. Zmniejsza to płynność i poprawia prowadzenie. Podczas aplikacji nakładaj cement od obwodu w kierunku wyznaczonego okna oczyszczającego i utrzymuj całkowitą wolność od cementu. Obszar oczyszczony jest wyznaczony przez granicę uszczelniacza dentystycznego (cement dentystyczny i miękki materiał wyściółki) na powierzchni czaszki. Dlatego jego rozmiar można regulować, ale jest ograniczony przez szwy czaszkowe lub rozmiar kapsuły. W powszechnym zastosowaniu na jednej półkuli obszar oczyszczony ma zwykle średnicę ~3–5 mm.
   3. Przymocuj małą tytanową płytę głowy (do mocowania głowy do specjalnego uchwytu podczas kolejnych obrazów) do czaszki za pomocą cementu dentystycznego.
      UWAGA: Do mocowania głowicy można stosować różne konstrukcje płyt głowicowych. W tym badaniu z powodzeniem wykorzystano zarówno komercyjnie dostępne płyty głowicowe, jak i niestandardowe dwuotworowe płyty tytanowe. Niezależnie od konstrukcji, płyta głowowa powinna zapewniać wystarczającą stabilność mechaniczną do kolejnych obrazów i nie zasłaniać zamierzonego okna wyczyszczenia/obrazowania.

4. Tworzenie okna HOTS

1. Uszczelnij czaszkę samoutwardzającym się materiałem miękkiej wyściełki dentystycznej (rysunek 1Bc)
   1. Po całkowitym utwardzeniu cementu dentystycznego przez około 5 minut, pokryj warstwę cementu, z wyłączeniem obszaru okna oczyszczającego, cienką warstwą samoutwardzającego się miękkiego materiału wycieńczającego się, aby utworzyć ciągłe uszczelnienie czaszki.
      UWAGA: Miękki materiał okładziny poprawia uszczelnianie i zmniejsza przecieki podczas długotrwałej ekspozycji na odczynniki klarujące.
   2. Ukształtuj samoutwardzający się miękki materiał podszewki dentystycznej gładko wokół planowanego marginesu okna oczyszczającego, tworząc płaską powierzchnię uszczelniającą dla nakrętki.
2. Montaż pokrywy (Rysunek 1Bd)
   1. Wytnij główkę jednorazowej plastikowej pipety (polietylen, PE), aby stworzyć małą cylindryczną nakrętkę z zamkniętą górą i otwartym dnem. PE wykazuje dobrą stabilność chemiczną i nie wykazuje widocznej degradacji ani reakcji z roztworami klarującymi S1 lub S2 podczas procesu oczyszczania.
      UWAGA: Pokrywka wycięta z głowicy żarówki pipety transferowej o pojemności 1 mL ma zazwyczaj ~12 mm średnicy i ~10–14 mm wysokości.
   2. Załóż pokrywkę nad wyznaczonym obszarem okna i delikatnie wciśnij ją w miękką warstwę wyściełki.
      UWAGA: Kaptura jest większa niż oczyszczony obszar, a część czaszki pod czapką, która nie jest używana na oczyszczonym obszarze, może być nałożona z uszczelniaczem dentystycznym, aby chronić czaszkę przed oczyszczaniem.
   3. Przymocuj pokrywkę dodatkowym miękkim materiałem wokół podstawy, zapewniając pełne uszczelnienie połączenia między nakrążkiem a czaszką.
   4. Użyj strzykawki o pojemności 1 ml z igłą 26 G, aby przebić jeden lub więcej małych otworów w ścianie kapsla, aby służyć jako otwory do wstrzykiwania i wyciągania roztworów oczyszczających.
   5. Pozwól, aby miękki materiał podszewki był całkowicie utwardzony. Sprawdź, czy kondensator jest mocno przymocowany i czy na interfejsie nie ma widocznych szczelin.
   6. Wyjmij mysz z ramki stereotaksyjnej i umieść ją w ciepłej klatce do całkowitego wyzdrowienia z znieczulenia.
      UWAGA: To jest odpowiedni punkt zatrzymania. Procedurę oczyszczania czaszki wykonaj po pełnym utwardzeniu cementu dentystycznego i miękkiego materiału podszewki. W naszej praktyce okno HOTS można zamontować po południu, a następnego ranka wykonać oczyszczanie czaszki, gdy mysz całkowicie wyzdrowieje po operacji. Alternatywnie, oczyszczanie czaszek można rozpocząć około 15 minut po instalacji okna HOTS. Podczas montażu okna HOTS czaszka pozostaje nienaruszona strukturalnie, choć okost zostaje usunięta.

5. Oczyszczanie czaszki u obudzonych, swobodnie zachowujących się myszy

UWAGA: Podczas fazy oczyszczania mysz pozostaje przytomna i swobodnie zachowuje się w swojej klatce domowej. Krótka anestezja izofluranowa stosuje się tylko do wstrzykiwania roztworu i wymiany przez nasadkę zamontowaną na głowie.

1. Początkowe załadowanie S1
   1. Umieść mysz w komorze indukcyjnej i wprowadź krótką znieczulenie przy użyciu 3–4% izofluranu w powietrzu z przepływem 300–500 mL/min, aż mysz stanie się nieruchoma. Nie zastosowano znieczulenia podtrzymującego podtrzymujące.
   2. Delikatnie unieruchom mysz i ustabilizuj nakrętkę na głowie ręką.
   3. Użyj strzykawki o pojemności 1 ml z igłą 26 G, aby powoli wstrzyknąć około 1 ml S1 do nasadki na głowie.
   4. Wróć mysz do domowej klatki i pozwól S1 działać na czaszce przez 2 godziny.
      UWAGA: Podczas inkubacji S1 i S2 trzymaj mysz indywidualnie w standardowej klatce.
2. Odświeżający S1
   1. Po 2 godzinach po początkowym załadowaniu S1 krótko ponownie znieczulaj mysz izofluranem.
   2. Aspiruj S1 z kapsla za pomocą strzykawki o pojemności 1 mL.
   3. Uzupełnij kapsel świeżym S1 za pomocą strzykawki o pojemności 1 mL.
   4. Wróć mysz do klatki i pozwól S1 działać przez kolejne 2 godziny.
   5. Powtórz kroki 5.2.1–5.2.4 po 4 godzinach po początkowym załadowaniu, aby wykonać drugą wymianę S1.
   6. Po drugiej wymianie pozwól S1 kontynuować działalność, aż osiągnie łączny czas ekspozycji S1 wynoszący 6 godzin.
      UWAGA: Ten protokół (1 mL S1 przez 6 godzin) jest zoptymalizowany dla myszy w wieku 6 tygodni (~20 g). U starszych zwierząt o grubszej czaszce czas inkubacji S1 może być stopniowo wydłużany. Każda korekta musi być uzupełniona ścisłym monitorowaniem dobrostanu zwierząt oraz ostateczną jakością obrazowania, aby uniknąć nadmiernego miękczenia czaszki.
3. Zastosowanie S2
   1. Po 6 godzinach leczenia S1 krótko znieczulaj mysz izofluranem.
   2. Aspiruj S1 z kapsla strzykawką o pojemności 1 mL i zastąp ją 0,7 mL S2.
   3. Wróć mysz do klatki i pozwól S2 działać na czaszkę przez godzinę, aby jeszcze bardziej zwiększyć przezroczystość i zapewnić dopasowanie współczynnika załamania.
      UWAGA: W tych warunkach połączona faza oczyszczania S1 i S2 zazwyczaj kończy się w ciągu 7 godzin (6 h S1 + 1 h S2). Pomyślne oczyszczenie jest widocznie przezroczystą powierzchnią czaszki bez krwawienia. Czaszka może nieco zmiękczyć po oczyszczeniu; przy delikatnym dotyku drobnymi kleszczami powinna wykazywać łagodną elastyczność, ale pozostać nienaruszona strukturalnie. Unikaj nadmiernego nacisku na powierzchnię czaszki.

6. Przygotowanie obrazowania

1. Znieczulenie i fiksacja głowy do obrazowania
   1. Na końcu inkubacji S2 znieczulać mysz, podając dootrzewnowkowy 1% (w/w) pentobarbitalu sodu w dawce 150–200 μL na 20 g masy ciała.
   2. Potwierdz odpowiednią znieczulenie za pomocą testu odruchu szczypania palców.
   3. Przymocuj głowicę myszy, przykręcając tytanową płytę głowy do specjalnie zaprojektowanego uchwytu na głowę.
   4. Nałóż maść okulistyczną na oba oczy, aby zapobiec wysuszaniu podczas badań obrazowych.
   5. Utrzymuj temperaturę ciała na poziomie ~37 °C za pomocą termoforu.
2. Odsłonięcie oczyszczonej powierzchni czaszki (Rysunek 1Be,Bf)
   1. Sprząsaj roztwór S2 z kapsułki za pomocą strzykawki.
   2. Ostrożnie wytnij plastikową nakrętkę cienkimi nożyczkami i usuń ją kleszczemi, unikając nadmiernego nacisku na czaszkę.
   3. Delikatnie zdejmij miękką warstwę wycieńczeniową otaczającą okno polany, aby całkowicie odsłonić oczyszczoną część czaszki.
   4. Nałóż niewielką kroplę roztworu S2 bezpośrednio na oczyszczoną czaszkę, aby służyła jako ośrodek zanurzeniowy dopasowany do współczynnika załamania podczas obrazowania.
      UWAGA: W tym badaniu zastosowano standardowe obiektywy do zanurzenia w wodzie, w tym obiektyw 16×/NA 0,8 (N16XLWD-PF, Nikon) oraz obiektyw 25×/NA 1,1 (N25X-APO-MP, Nikon). Używając S2 jako ośrodka immersyjnego, dostosuj kołnierz korekcyjny obiektywu, jeśli jest dostępny, do odpowiedniego ustawienia współczynnika załamania S2, aby zmniejszyć aberracje sferyczne. W eksperymentach tutaj oczyszczona czaszka zachowała wystarczającą przejrzystość optyczną na około 2 godziny obrazowania dwufotonowego, bez widocznej degradacji jakości obrazu podczas obserwacji kolca dendrytycznego. Po około 2 dniach konieczne było ponowne oczyszczanie obrazowania do dalszych obrazów, a czas ponownego oczyszczania był znacznie krótszy niż początkowy, co umożliwiło efektywne powtarzane obrazowanie tego samego zwierzęcia.
3. Obrazowanie z głową w stanie czucia (opcjonalnie)
   UWAGA: Do obrazowania czuwania przyzwyczaj mysz do fiksacji głowy przed eksperymentem. Krótko znieczulaj mysz izofluranem, następnie przymocuj wszczepioną płytkę głowy do uchwytu na 15–30 minut na sesję i powtarzaj to przez 2–3 dni.
   1. Stosuj krótką anestezję izofluranową, aby ułatwić jej obsługę. Przymocuj do uchwytu tylko wbudowaną płytę głowy, co pozwala ciału swobodnie poruszać się po kole lub platformie.
   2. Postępuj zgodnie z krokami 6.2.1–6.2.4, aby odsłonić oczyszczoną powierzchnię czaszki i nałożyć S2 przed obrazowaniem.

7. Odbudowa

1. Po zdjęciu delikatnie aspiruj i usuń resztki roztworu S2 z powierzchni czaszki.
2. Płucz oczyszczony obszar czaszki kilkakrotnie solą fizjologiczną z buforem fosforanowym (PBS), aby stopniowo przywrócić pierwotny stan nieprzezroczystości czaszki.
3. Delikatnie wysusz płyn z czaszki i otaczających tkanek sterylnymi patyczkami watowymi, unikając mechanicznych uszkodzeń kości.
4. Jeśli zwierzę jest utrzymywane przy życiu na kolejne eksperymenty, nałóż warstwę biokompatybilnego uszczelniacza Kwik-Cast (WPI) na okno czaszki, aby chronić kość w okresie przeżycia.
5. Pozwól warstwie ochronnej całkowicie się utwardzić.
6. Odłącz mysz od uchwytu na głowę i umieść ją w ciepłej klatce. Obserwuj zwierzę, aż całkowicie wyjdzie z znieczulenia, a następnie odłóż je do klatki domowej.

Wyniki

Zgodnie z protokołem, okno optycznie przezroczystej czaszki (HOTS) na głowie umożliwia głębokie przezczaszkowe obrazowanie dwufotonowe u dorosłych myszy, zachowując jednocześnie integralność czaszki. Udane przygotowanie wynika z dwóch kluczowych efektów: (1) naczynia korowe stają się wyraźnie widoczne przez czaszkę po oczyszczeniu (rysunek 1Bf) oraz (2) oczyszczona czaszka wykazuje lekkie wgniecenie pod delikatnym naciskiem, co wskazuje na skuteczną dewaccyfikację i rozluźni...

Dyskusja

Metoda HOTS wykorzystuje na głowie optycznie przezroczyste okno czaszki (HOTS), które łączy kapsułkę zawierającą odczynniki oczyszczające z dwustopniowym procesem oczyszczania czaszki, aby zwiększyć przezroczystość czaszki u dorosłych myszy, jednocześnie zachowując jej integralność. Zgodnie ze standardowym protokołem (6 h w S1 i 1 h w S2 dla myszy 6-tygodniowych), powstałe okno niezawodnie umożliwiało głębokie przezczaszkowe obrazowanie dwufotonowe i pozwalało na wizualizację struktur do ~800 μm poniżej pia.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
1 mL jednorazowa pipeta	Beijing Biotopped  Science   & Technologia  Co., Ltd.	Nie ma
Cement dentystyczny	Shanghai Rongxiang Dental Materials Co., Ltd.	Nie ma
D-mannoza	Macklin	D813082
EDTA	Aladyn	El 16428
Izofluran	Napęd na tylne koła	Nie ma
Kwik-Cast	WPI	Nie ma	Biokompatybilny uszczelniacz
NaOH	Macklin	S832169
Samoutwardzanie        dental          Miękki materiał podszewki	Yangmahu Biotechnology (Hebi) Co., Ltd.	Nie ma
Pentobarbital sodu	Biopike	Nie ma
Aparat stereotaksowy	Napęd na tylne koła	Nie ma
Sterylna jednorazowa strzykawka	Minank	Nie ma	1 mL; Igła 26 G
Sulfolan	Macklin	S817950
Myszy Thy1-GFP-M		Nie ma	Pod warunkiem  autor: prof. Yang Zhan
Thyl-GCaMP6s  myszy	Laboratorium Jacksona
Tween 20	Sigma-Vetec	V900548
Cel zanurzenia w wodzie	Nikon	N25X-APO-MP	25&razy;/NA 1.1 cel
Cel zanurzenia w wodzie	Nikon	N16XLWD-PF	16&razy;/NA 0,8 cel