Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Okno z optycznie przezroczystą czaszką (HOTS) na głowie do głębokiego obrazowania przezczaszkowego kory myszy

184 wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/71185

⸱

5 czerwca 2026

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Research Center for Biomedical Optics and Molecular Imaging, Shenzhen Key Laboratory for Molecular Imaging, Guangdong Provincial Key Laboratory of Biomedical Optical Imaging Technology, Shenzhen Institutes of Advanced Technology, Chinese Academy of Sciences, 2University of Chinese Academy of Sciences, 3Key Laboratory of Biomedical Imaging Science and System, Chinese Academy of Sciences, State Key Laboratory of Biomedical Imaging Science and System

W tym artykule

Podsumowanie

Protokół ten opisuje okno optycznie przezroczystej czaszki (HOTS) zamontowane na głowie, oparte na zoptymalizowanej, dwuetapowej procedurze oczyszczania czaszki. Takie podejście daje wysoce przezroczystą czaszkę, umożliwiającą dwufotonowe obrazowanie kory mózgowej dorosłej myszy na głębokości do ~800 μm.

Streszczenie

Dwufotonowe obrazowanie wysokorozdzielcze kory mózgowej dorosłej myszy jest poważnie ograniczone przez rozpraszanie światła z czaszki, które tłumi sygnały i ogranicza głębokość obrazowania in vivo. Chociaż opracowano metody oczyszczania czaszki, aby zapewnić optyczny dostęp do kory przez nienaruszoną czaszkę, ich praktyczna wydajność jest ograniczona przez ograniczony czas oczyszczania i nieoptymalne koktajle oczyszczania. Przedstawiamy tutaj szczegółowy protokół implementacji okna HOTS montowanego na głowie optycznie przezroczystego na głowie (HOTS). W tym podejściu używano nasady na głowie, aby utrzymać roztwory oczyszczające czaszkę, unikając tym samym długotrwałej znieczulenia lub fizycznego unieruchomienia oraz umożliwiając długotrwałe oczyszczanie czaszki (kilka godzin) u przytomnych, swobodnie zachowujących się myszy. Dodatkowo przeprowadzono dwustopniową procedurę oczyszczania z użyciem odczynników (HOTS-S1: 10% wt/v EDTA, 15% wt/v D-mannoza, 10% wt/v sulfolanu, 0,5% wt/v Tween 20; HOTS-S2: 70% wt/v D-mannoza, 5% wt/v sulfolanu, 0,5% wt/v Tween 20) zoptymalizowane poprzez systematyczne badania chemiczne. Oferujemy protokół krok po kroku, który obejmuje ekspozycję czaszki i stabilizację, tworzenie i montaż nasadki na głowie, podanie i odświeżanie odczynników oczyszczających oraz przygotowanie obrazowania. U myszy mających 6 tygodni (~20 g) protokół HOTS rutynowo tworzy wysoce przezroczystą czaszkę, która umożliwia obrazowanie dwufotonowe struktur korowych na głębokości do ~800 μm poniżej pia, co zbliża się do wydajności okien z otwartą czaszką. Okno HOTS umożliwia obrazowanie strukturalne u myszy Thy1-GFP-M oraz funkcjonalne obrazowanie wapnia u myszy Thy1-GCaMP6. Uważamy, że jako wygodne i minimalnie inwazyjne podejście, okno HOTS znacząco ułatwi głębokie obrazowanie przezczaszkowe oraz manipulacje optogenetyczne, fotofarmakologiczne i inne manipulacje oparte na świetle in vivo.

Wprowadzenie

Monitorowanie neuronów korowych wewnątrzżyciowych jest niezbędne do zrozumienia struktury i funkcji mózgu1. Mikroskopia dwufotonowa (TPM) jest kluczowym narzędziem w takich badaniach in vivo 2,3. Jednak jakość i głębokość obrazowania są poważnie ograniczone przez silne rozpraszanie światła z nieprzezroczystej czaszki leżącej nad korą 4,5.

Okna z otwartą czaszką6 i przecieńczoną czaszką 7,8 znacznie poprawiły optyczny dostęp do kory i są szeroko stosowane, jednak oba podejścia mają swoje ograniczenia. Otwarte okna czaszki mogą wywołać ostre uszkodzenia mózgu i reakcje zapalne 9,10, podczas gdy przerzedzenie czaszki jest technicznie wymagające i trudne do osiągnięcia jednolitej grubości11,12.

Techniki optycznego oczyszczania czaszki in vivo oferują minimalnie inwazyjną alternatywę, która umożliwia obrazowanie dwufotonowe w rozdzielczości aksonalnej u dorosłych myszy. Jednak osiągalna głębokość obrazowania pozostaje ograniczona (zazwyczaj 150–400 μm poniżej pia)12,13,14,15. W praktyce oczyszczanie czaszki zwykle ogranicza się do krótkiego okresu pod znieczuleniem przy sztywnym fiksowaniu głowy, a systematyczna optymalizacja koktajli oczyszczania dla składu kości czaszki pozostaje niedostatecznie zbadana 12,13,14,15.

Aby przezwyciężyć te ograniczenia, wcześniej opracowaliśmy na głowie zamontowane okno optycznie przezroczyste czaszki (HOTS), które umożliwia długotrwałe, wyłączone oczyszczanie czaszki u wolno zachowujących się myszy (Rysunek 1A)16. Podejście to wykorzystuje dwustopniową procedurę oczyszczania z użyciem odczynników (S1 i S2), które zostały zoptymalizowane poprzez systematyczne przesiewanie chemiczne w naszej poprzedniej pracy16. Systematyczna optymalizacja odczynników oczyszczających oraz charakterystyka skuteczności oczyszczania, odwracalności, biobezpieczeństwa i wydajności obrazowania in vivo okna HOTS zostały opisane w naszej poprzedniej pracy16, która również wykazała korzystną odpowiedź astroglialną po leczeniu HOTS. Przedstawiamy tutaj krok po kroku protokół ustanawiający okno HOTS, umożliwiające głębokie przezczaszkowe obrazowanie dwufotonowe u dorosłych myszy. W reprezentatywnych przygotowaniach głębokości obrazowania sięgają ~800 μm poniżej pia, niemal odpowiadając tym osiągalnym przy otwartych oknach. Okno HOTS umożliwia głębokie obrazowanie strukturalne u myszy Thy1-GFP-M oraz funkcjonalne obrazowanie wapnia u myszy Thy1-GCaMP6 w stanie obudzenia.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszystkie procedury opieki nad zwierzętami i eksperymenty zostały zatwierdzone przez Guangdong Provincial Animal Care and Use Committee i przeprowadzono je zgodnie z wytycznymi Animal Experimentation Ethics Committee of the Shenzhen Institute of Advanced Technology, Chinese Academy of Sciences. Odczynniki i sprzęt użyte w tym protokole wymieniono w Tabeli materiałów.

UWAGA: Niniejszy protokół został zoptymalizowany dla myszy w wieku 6 tygodni (masa ciała ~20 g), których grubość czaszki wynosi około 100 µm.

1. Przygotowanie roztworów do przejaśniania czaszki

  1. Przygotować roztwór do przejaśniania czaszki S1 (10% wt/v EDTA, 15% wt/v D-mannozy, 10% wt/v sulfolanu, 0,5% wt/v Tween 20; RI: 1,38; końcowe pH: 7,0-7,4)
    1. Odważyć 0,35 g wodorotlenku sodu (NaOH). Dodać go do 20 mL wody dejonizowanej w zlewce i mieszać do całkowitego rozpuszczenia. Podnosi to pH roztworu, co ułatwia późniejsze rozpuszczenie EDTA.
      ​UWAGA: NaOH jest substancją żrącą. Należy stosować odpowiednie środki ochrony osobistej (rękawiczki, fartuch laboratoryjny, ochronę oczu) i pracować pod dygestorium chemicznym.
    2. Do roztworu NaOH dodać 4 g kwasu etylenodiaminooctowego (EDTA). Zlewkę umieścić w łaźni wodnej o temperaturze 40 °C i mieszać nieprzerwanie do całkowitego rozpuszczenia EDTA.
    3. Ostudzić mieszaninę do temperatury pokojowej. Do roztworu dodać 6 g D-mannozy, 4 g sulfolanu i 0,2 g Tween 20. Mieszać w temperaturze pokojowej do całkowitego rozpuszczenia wszystkich składników.
    4. Dodać wodę dejonizowaną do uzyskania końcowej objętości 40 mL. Dokładnie wymieszać, aby otrzymać S1.
      UWAGA: S1 można przechowywać w temperaturze pokojowej przez kilka miesięcy.
  2. Przygotować roztwór do przejaśniania czaszki S2 (70% wt/v D-mannozy, 5% wt/v sulfolanu, 0,5% wt/v Tween 20; końcowe RI: 1,44; końcowe pH: 7,0-7,4)
    1. Odważyć 28 g D-mannozy, 2 g sulfolanu i 0,2 g Tween 20, a następnie przenieść je do czystej zlewki.
    2. Dodać około 30 mL wody dejonizowanej i mieszać w temperaturze pokojowej do całkowitego rozpuszczenia wszystkich składników.
    3. Dodać wodę dejonizowaną do uzyskania końcowej objętości 40 mL i dokładnie wymieszać, aby otrzymać S2.
      ​UWAGA: Delikatne podgrzewanie (25–30 °C) i ciągłe mieszanie przyspieszają rozpuszczanie D-mannozy. S2 można przechowywać w temperaturze pokojowej przez kilka miesięcy.

2. Przygotowanie do operacji

  1. Wszystkie instrumenty chirurgiczne należy poddać autoklawowaniu, a przestrzeń roboczą dokładnie zdezynfekować 75% alkoholem.
  2. Myszy należy znieczulić poprzez podanie dootrzewnowe 1% (w/v) pentobarbitalu sodu (150–200 µL na 20 g masy ciała).
    UWAGA: Jako alternatywę dla pentobarbitalu sodu można zastosować inne odwracalne środki znieczulające lub odpowiednie schematy znieczulania i przeciwbólowe.
  3. Głębokość znieczulenia należy monitorować za pomocą testu odruchu na uciśnięcie palca u nogi, aby upewnić się, że mysz jest w pełni znieczulona przed rozpoczęciem operacji.
  4. Myszy należy umieścić w aparacie stereotaktycznym i unieruchomić głowę za pomocą prętów usznych.
  5. Temperaturę ciała należy utrzymać na poziomie 37 °C, korzystając z maty grzewczej.
  6. Na oba oczy należy nałożyć maść oftalmiczną, aby zapobiec wysychaniu rogówki.
    UWAGA: Przez cały czas trwania procedury należy stale monitorować oddychanie, głębokość znieczulenia oraz reakcje odruchowe. W przypadku zaobserwowania oznak niewystarczającej głębokości znieczulenia należy przerwać procedurę i upewnić się, że osiągnięto odpowiedni poziom znieczulenia przed kontynuacją. W razie potrzeby, szczególnie przy wystąpieniu depresji oddechowej, można podać tlen wspomagający.

3. Operacja i montaż płytki głownej

  1. Odsłonięcie i oczyszczenie czaszki (Rycina 1Ba)
    1. Usunąć skórę głowy z całej grzbietowej powierzchni czaszki, używając precyzyjnej pęsety i nożyczek chirurgicznych. Przyciąć skórę bocznie, aby odsłonić brzegi mięśni skroniowych oraz tylnie w kierunku mięśni szyjnych.
    2. Delikatnie usunąć okostną z powierzchni czaszki za pomocą precyzyjnej pęsety.
    3. Oczyścić powierzchnię czaszki wilgotnym aplikatorem z bawełnianym końcem i osuszyć czaszkę łagodnym strumieniem powietrza.
    4. Jeśli wymagana jest precyzyjna lokalizacja obszarów funkcjonalnych kory mózgowej, zaznaczyć na powierzchni czaszki punkty odniesienia w odstępach 1 mm za pomocą aparatu stereotaktycznego.
  2. Aplikacja cementu dentystycznego i płytki głowowej (Rycina 1Bb)
    1. Przygotować cement dentystyczny zgodnie z instrukcjami producenta. W celu zapewnienia stabilnego mocowania zaleca się stosowanie cementów dentystycznych o silnej adhezji i dobrej trwałości, odpowiednich do długotrwałej fiksacji.
    2. Nanieść cienką warstwę cementu dentystycznego na odsłoniętą powierzchnię czaszki oraz sąsiednie tkanki w celu ich ochrony, pozostawiając niepokrytym obszar przeznaczony na okno optyczne.
      UWAGA: Po zmieszaniu proszku i składnika płynnego cementu dentystycznego w stosunku objętościowym 1:1, odczekać około 10 s, aż cement przywrze do końcówki wykałaczki przed aplikacją. Zmniejsza to jego płynność i ułatwia manipulację. Podczas aplikacji nanosić cement od peryferii w kierunku wyznaczonego okna optycznego, dbając o to, aby obszar okna pozostał całkowicie wolny od cementu. Oczyszczony obszar jest definiowany przez granicę uszczelniacza dentystycznego (cementu dentystycznego i materiału podkładowego) na powierzchni czaszki. Zatem jego rozmiar może być dostosowany, lecz jest on ograniczony przez szwy czaszkowe lub rozmiar nakładki. W typowej aplikacji w jednej półkuli oczyszczony obszar ma zazwyczaj średnicę ~3–5 mm.
    3. Przymocować do czaszki małą tytanową płytkę głowową (służącą do fiksacji głowy w specjalnym uchwycie podczas późniejszego obrazowania) za pomocą cementu dentystycznego.
      UWAGA: Do fiksacji głowy można stosować różne konstrukcje płytek głowowych. W niniejszym badaniu z powodzeniem zastosowano zarówno płytki dostępne w handlu, jak i wykonane na zamówienie dwuotworowe płytki tytanowe. Niezależnie od konstrukcji, płytka głowowa powinna zapewniać wystarczającą stabilność mechaniczną do późniejszego obrazowania i nie może zasłaniać planowanego okna optycznego/obrazowania.

4. Tworzenie okna HOTS

  1. Uszczelnienie czaszki za pomocą samoutwardzalnego materiału do wyścielania protez denturowych (Rycina 1Bc)
    1. Po pełnym utwardzeniu cementu dentystycznego, co trwa około 5 min, pokryć warstwę cementu (z wyjątkiem obszaru okna do utleniania) cienką warstwą samoutwardzalnego materiału do wyścielania protez, aby stworzyć ciągłą uszczelkę na czaszce.
      ​UWAGA: Materiał do wyścielania poprawia uszczelnienie i ogranicza wycieki podczas długotrwałego kontaktu z odczynnikami do utleniania.
    2. Wygładzić samoutwardzalny materiał do wyścielania wokół planowanego brzegu okna do utleniania, tworząc płaską powierzchnię uszczelniającą dla nakładki.
  2. Montaż nakładki (Rycina 1Bd)
    1. Odciąć końcówkę jednorazowej plastikowej pipety (polietylen, PE), aby stworzyć małą cylindryczną nakładkę z zamkniętą górą i otwartym dołem. PE wykazuje dobrą stabilność chemiczną i nie ulega widocznej degradacji ani nie reaguje z roztworami utleniającymi S1 lub S2 podczas procedury utleniania.
      UWAGA: Nakładka wycięta z końcówki pipety transferowej o pojemności 1 mL ma zazwyczaj średnicę ok. 12 mm i wysokość ok. 10–14 mm.
    2. Umieścić nakładkę nad wyznaczonym obszarem okna do utleniania i delikatnie wcisnąć ją w materiał do wyścielania.
      ​UWAGA: Nakładka jest większa niż obszar utleniania; część czaszki pod nakładką, która nie jest wykorzystywana jako okno, można pokryć uszczelniaczem dentystycznym, aby chronić ją przed utlenianiem.
    3. Utrwalić nakładkę w miejscu, stosując dodatkowy materiał do wyścielania wokół jej podstawy, upewniając się, że połączenie między nakładką a czaszką jest całkowicie szczelne.
    4. Za pomocą strzykawki 1 mL z igłą 26 G wykonać jeden lub więcej małych otworów w ściance nakładki, które będą służyć jako porty do wstrzykiwania i odsysania roztworów utleniających.
    5. Odczekać do pełnego utwardzenia materiału do wyścielania. Sprawdzić, czy nakładka jest mocno przymocowana i czy na styku nie pozostały widoczne szczeliny.
    6. Zdjąć mysz z aparatu stereotaktycznego i umieścić ją w ogrzewanej klatce do czasu pełnego wybudzenia z narkozy.
      UWAGA: Podczas wybudzania z narkozy należy trzymać mysz w ogrzewanej klatce i monitorować oddychanie, powrót odruchu prostowania, ruchy spontaniczne oraz zdolność poruszania się. W razie wskazań klinicznych można podać podskórnie 0,2 mL sterylnego roztworu soli fizjologicznej jako wspomagającą terapię płynową. Monitorowanie pooperacyjne należy kontynuować po wybudzeniu z narkozy i zapewnić dodatkową opiekę wspomagającą w razie wskazań klinicznych. Jest to odpowiedni moment na przerwanie procedury HOTS. Fazę utleniania należy rozpocząć dopiero po pełnym utwardzeniu cementu dentystycznego i materiału do wyścielania oraz po odpowiednim wybudzeniu myszy z pierwotnej narkozy. W rutynowej praktyce okno HOTS można zainstalować po południu, a fazę utleniania rozpocząć następnego ranka. Monitorowanie pooperacyjne powinno trwać przez cały ten okres.

5. Prześwietlanie czaszki u budzących się myszy swobodnie poruszających się

UWAGA: Podczas fazy utrwalania (clearing) mysz pozostaje świadoma i wykazuje naturalne zachowania w swojej klatce. Krótkotrwałą anestezję izofluranem stosuje się wyłącznie podczas wstrzykiwania i wymiany roztworu poprzez zamocowaną na głowie nasadkę.

  1. Wstępne aplikowanie S1
    1. Umieścić mysz w komorze indukcyjnej i wprowadzić w krótkotrwałą narkozę za pomocą 3–4% izofluranu w powietrzu przy przepływie 300–500 mL/min, aż mysz stanie się nieruchoma. Nie stosowano narkozy podtrzymującej.
    2. Delikatnie unieruchomić mysz i ustabilizować ręką zamocowaną na głowie nakładkę.
    3. Za pomocą strzykawki 1 mL z igłą 26 G powoli wstrzyknąć około 1 mL S1 do nakładki na głowę.
    4. Przenieść mysz do klatki macierzystej i pozwolić S1 działać na czaszkę przez 2 h.
      ​UWAGA: Podczas inkubacji w S1 i S2 utrzymywać mysz pojedynczo w standardowej klatce.
  2. Odświeżanie S1
    1. Po 2 h od wstępnego aplikowania S1 ponownie krótko znieczulić mysz izofluranem.
    2. Odssać S1 z nakładki za pomocą strzykawki 1 mL.
    3. Napełnić nakładkę świeżym S1 za pomocą strzykawki 1 mL.
    4. Przenieść mysz do klatki i pozwolić S1 działać przez kolejne 2 h.
    5. Powtórzyć kroki 5.2.1–5.2.4 po 4 h od wstępnego aplikowania w celu przeprowadzenia drugiej wymiany S1.
    6. Po drugiej wymianie pozwolić S1 działać dalej, aż całkowity czas ekspozycji na S1 wyniesie 6 h.
      ​UWAGA: Niniejszy protokół (1 mL S1 przez 6 h) jest zoptymalizowany dla myszy w wieku 6 tygodni (~20 g). W przypadku starszych zwierząt z grubszą czaszką czas inkubacji w S1 można stopniowo wydłużać. Każda korekta musi być powiązana z uważnym monitorowaniem stanu dobrostanu zwierzęcia oraz końcowej jakości obrazowania, aby uniknąć nadmiernego rozmiękczenia czaszki.
  3. Aplikowanie S2
    1. Po 6 h traktowania S1 krótko znieczulić mysz izofluranem.
    2. Odssać S1 z nakładki strzykawką 1 mL i zastąpić go 0,7 mL S2.
    3. Przenieść mysz do klatki i pozwolić S2 działać na czaszkę przez 1 h, aby dodatkowo zwiększyć przezroczystość i zapewnić dopasowanie współczynnika załamania światła.
      UWAGA: W tych warunkach łączna faza klarowania S1 i S2 jest zazwyczaj kończona w ciągu 7 h (6 h S1 + 1 h S2). Prawidłowe klarowanie objawia się widocznie przezroczystą powierzchnią czaszki bez krwawień. Czaszka może stać się lekko rozmiękła po klarowaniu; przy delikatnym dotyku cienką pęsetą powinna wykazywać niewielką podatność, ale pozostać nienaruszona strukturalnie. Należy unikać wywierania nadmiernego nacisku na powierzchnię czaszki.

6. Przygotowanie do obrazowania

  1. Znieczulenie i stabilizacja głowy do obrazowania
    1. Po zakończeniu inkubacji w roztworze S2 znieczul mysz poprzez doszpikowe wstrzyknięcie 1% (w/v) pentobarbitalu sodu w dawce 150–200 µL na 20 g masy ciała.
    2. Potwierdź odpowiedni poziom znieczulenia, wykonując test odruchu uciskania palca.
    3. Ustabilizuj głowę myszy, przykręcając tytanową płytkę do specjalnie zaprojektowanego uchwytu głowy.
    4. Nałóż maść oftalmiczną na oba oczy, aby zapobiec ich wysychaniu podczas obrazowania.
    5. Utrzymuj temperaturę ciała na poziomie ~37 °C, korzystając z maty grzewczej.
  2. Odsłonięcie oczyszczonej powierzchni czaszki (Rysunek 1Be,Bf)
    1. Odssać roztwór S2 z nakrętki za pomocą strzykawki.
    2. Ostrożnie odciąć plastikową nakrętkę małymi nożyczkami i usunąć ją pęsetą, unikając nadmiernego nacisku na czaszkę.
    3. Delikatnie odkleić miękką wyściółkę otaczającą okno przejrzystości, aby w pełni odsłonić oczyszczony obszar czaszki.
    4. Nałożyć małą kroplę roztworu S2 bezpośrednio na oczyszczoną czaszkę, aby służyła jako ośrodek immersyjny dopasowany pod względem współczynnika załamania światła podczas obrazowania.
      UWAGA: W niniejszym badaniu zastosowano standardowe obiektywy immersyjne w wodzie, w tym obiektyw 16×/NA 0,8 (N16XLWD-PF, Nikon) oraz obiektyw 25×/NA 1,1 (N25X-APO-MP, Nikon). Podczas stosowania S2 jako ośrodka immersyjnego należy dostosować pierścień korekcyjny obiektywu (jeśli jest dostępny) do odpowiedniego ustawienia dla współczynnika załamania światła S2, aby zredukować aberracje sferyczne. W przeprowadzonych eksperymentach oczyszczona czaszka utrzymywała wystarczającą przejrzystość optyczną przez około 2 h obrazowania dwufotonowego, bez wyraźnego pogorszenia jakości obrazu podczas obserwacji kolców dendrytycznych. Po około 2 dniach wymagane było ponowne przejrzystowanie do dalszego obrazowania; czas ponownego przejrzystowania był znacznie krótszy niż początkowy, co umożliwiło efektywne powtórne obrazowanie u tego samego zwierzęcia.
  3. Obrazowanie u budzących się zwierząt z ustabilizowaną głową (opcjonalnie)
    ​UWAGA: W przypadku obrazowania u zwierząt w stanie czuwania należy przyzwyczaić mysz do stabilizacji głowy przed eksperymentem. Krótko znieczul mysz izofluranem, a następnie przymocuj wszczepioną płytkę do uchwytu na 15–30 min na sesję; powtarzaj tę procedurę przez 2–3 dni.
    1. Zastosuj krótkie znieczulenie izofluranem, aby ułatwić manipulację. Przymocuj do uchwytu wyłącznie wszczepioną płytkę, pozwalając ciału zwierzęcia na swobodny ruch na kołowrotku lub platformie.
    2. Postępuj zgodnie z krokami 6.2.1–6.2.4, aby odsłonić oczyszczoną powierzchnię czaszki i nałożyć S2 przed obrazowaniem.

7. Odzyskiwanie

  1. Po obrazowaniu ostrożnie odessać i usunąć wszelki pozostały roztwór S2 z powierzchni czaszki.
  2. Kilkakrotnie przepłukać przejaśniony obszar czaszki roztworem soli fizjologicznej z buforem fosforanowym (PBS), aby wspomóc stopniowy powrót czaszki do jej naturalnego, nieprzezroczystego stanu.
  3. Delikatnie osuszyć pozostałą ciecz z czaszki i otaczających tkanek za pomocą sterylnych patyczków bawełnianych, unikając mechanicznego uszkodzenia kości.
  4. Jeśli zwierzę ma pozostać żywe na potrzeby kolejnych eksperymentów, nałożyć warstwę biokompatybilnego uszczelniacza Kwik-Cast (WPI) na okno czaszki, aby chronić kość w okresie przeżycia.
  5. Pozostawić warstwę ochronną do całkowitego utwardzenia.
  6. Odpiąć mysz od uchwytu głowy i umieścić ją w ciepłej klatce. Monitorować zwierzę do pełnego wybudzenia z narkozy, a następnie przenieść je do klatki macierzystej.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Zgodnie z protokołem, okno optycznie przezroczystej czaszki montowane na głowie (HOTS) umożliwia głębokie transkranialne obrazowanie dwufotonowe u dorosłych myszy przy jednoczesnym zachowaniu integralności czaszki. Poprawność preparacji potwierdzają dwa kluczowe rezultaty: (1) naczynia krwionośne kory stają się wyraźnie widoczne przez czaszkę po przeprowadzeniu procesu klarowania (Rycina 1Bf) oraz (2) sklarowana czaszka wykazuje lekkie wgłębienie pod wpływem delikatnego naci...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Metoda HOTS wykorzystuje na głowie optycznie przezroczyste okno czaszki (HOTS), które łączy kapsułkę zawierającą odczynniki oczyszczające z dwustopniowym procesem oczyszczania czaszki, aby zwiększyć przezroczystość czaszki u dorosłych myszy, jednocześnie zachowując jej integralność. Zgodnie ze standardowym protokołem (6 h w S1 i 1 h w S2 dla myszy 6-tygodniowych), powstałe okno niezawodnie umożliwiało głębokie przezczaszkowe obrazowanie dwufotonowe i pozwalało na wizualizację struktur do ~800 μm poniżej pia.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Podziękowania

Prace te były wspierane przez Kluczowy Program R&D w dziedzinie innowacji naukowych i technologicznych w Chongqing (CSTB2024TIAD-STX0004), Shenzhen Medical Research Fund (D2404004), National Natural Science Foundation of China (62475278, 62305369, 62405351, 92359303); Podstawowa i Stosowana Fundacja Badań Podstawowych prowincji Guangdong (2024A1515012517, 2020B121201010); Stowarzyszenie Promocji Innowacji Młodzieży Chińskiej Akademii Nauk (2023377); Program Badań Podstawowych w Shenzhen (RCJC20200714114433058, RCYX20210609104445093, JCYJ20241202124924033, ZDSY20130401165820357). Dziękujemy prof. Yang Zhanowi (Instytut Poznania Mózgu i Chorób Mózgu, Instytuty Zaawansowanych Technologii w Shenzhen, Chińska Akademia Nauk, Shenzhen, Chiny) za dostarczenie myszy Thy1-GFP-M.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
1 mL jednorazowa pipetaBeijing Biotopped  Science
  & Technologia  Co., Ltd.		Nie ma
Cement dentystycznyShanghai Rongxiang Dental Materials Co., Ltd.Nie ma
D-mannozaMacklinD813082
EDTAAladynEl 16428
IzofluranNapęd na tylne kołaNie ma
Kwik-CastWPINie maBiokompatybilny uszczelniacz
NaOHMacklinS832169
Samoutwardzanie        dental          Miękki materiał podszewkiYangmahu Biotechnology (Hebi) Co., Ltd.Nie ma
Pentobarbital soduBiopikeNie ma
Aparat stereotaksowyNapęd na tylne kołaNie ma
Sterylna jednorazowa strzykawkaMinankNie ma1 mL; Igła 26 G
SulfolanMacklinS817950
Myszy Thy1-GFP-MNie maPod warunkiem  autor: prof. Yang Zhan
Thyl-GCaMP6s  myszyLaboratorium Jacksona
Tween 20Sigma-VetecV900548
Cel zanurzenia w wodzie NikonN25X-APO-MP25&razy;/NA 1.1 cel  
Cel zanurzenia w wodzie NikonN16XLWD-PF16&razy;/NA 0,8 cel  

Bibliografia

  1. Lee, J., et al. Longitudinal intravital imaging of cerebral microinfarction reveals a dynamic astrocyte reaction leading to glial scar formation. Glia. 70 (5), 975-988 (2022).
  2. Hierro-Bujalance, C., Bacskai, B. J., Garcia-Alloza, M. In vivo imaging of microglia with multiphoton microscopy. Front Aging Neurosci. 10, 218 (2018).
  3. Fan, J. L., et al. High-speed volumetric two-photon fluorescence imaging of neurovascular dynamics. Nat Commun. 11 (1), 6020 (2020).
  4. Fan, X., Zheng, W., Singh, D. J. Light scattering and surface plasmons on small spherical particles. Light Sci Appl. 3 (6), e179 (2014).
  5. Kneipp, M., et al. Effects of the murine skull in optoacoustic brain microscopy. J Biophotonics. 9 (1-2), 117-123 (2016).
  6. Holtmaat, A., et al. Long-term, high-resolution imaging in the mouse neocortex through a chronic cranial window. Nat Protoc. 4 (8), 1128-1144 (2009).
  7. Drew, P. J., et al. Chronic optical access through a polished and reinforced thinned skull. Nat Methods. 7 (12), 981-984 (2010).
  8. Yang, G., et al. Thinned-skull cranial window technique for long-term imaging of the cortex in live mice. Nat Protoc. 5 (2), 201-208 (2010).
  9. Xu, H. T., Pan, F., Yang, G., Gan, W. B. Choice of cranial window type for in vivo imaging affects dendritic spine turnover in the cortex. Nat Neurosci. 10 (5), 549-551 (2007).
  10. Roth, T. L., et al. Transcranial amelioration of inflammation and cell death after brain injury. Nature. 505 (7482), 223-228 (2014).
  11. Dorand, R. D., et al. Comparison of intravital thinned skull and cranial window approaches to study CNS immunobiology in the mouse cortex. Intravital. 3 (2), e29728 (2014).
  12. Zhang, C., et al. A large, switchable optical clearing skull window for cerebrovascular imaging. Theranostics. 8 (10), 2696-2708 (2018).
  13. Zhao, Y. J., et al. Skull optical clearing window for in vivo imaging of the mouse cortex at synaptic resolution. Light Sci Appl. 7, 17153 (2018).
  14. Li, D. Y., et al. A through-intact-skull (TIS) chronic window technique for cortical structure and function observation in mice. eLight. 2 (1), 15 (2022).
  15. Liu, X., et al. SeeThrough: a rationally designed skull clearing technique for in vivo brain imaging. Nat Commun. 16 (1), 7584 (2025).
  16. Liu, L. N., et al. Structural and functional mouse brain imaging facilitated by a head-mounted optically transparent skull (HOTS) window allowing offline clearing. Optica. 12 (12), 1946-1960 (2025).
  17. Li, H., et al. Multidimensional dynamic optical imaging unveils anesthetic-driven hemispheric lateralization in blood-brain barrier homeostasis. Sci Adv. 11 (49), eady6275 (2025).
  18. Qin, W., et al. Amphiphilic hemicyanine molecular probes crossing the blood-brain barrier for intracranial optical imaging of glioblastoma. Sci Adv. 11 (3), eadq5816 (2025).
  19. Pang, W., et al. Direct monitoring of whole-brain electrodynamics via high-spatiotemporal-resolution photoacoustics with voltage-sensitive dye. Laser Photonics Rev. 18 (10), 2400165 (2024).
  20. Paoletti, P., Ellis-Davies, G. C. R., Mourot, A. Optical control of neuronal ion channels and receptors. Nat Rev Neurosci. 20 (9), 514-532 (2019).
  21. Deisseroth, K. Optogenetics: 10 years of microbial opsins in neuroscience. Nat Neurosci. 18 (9), 1213-1225 (2015).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Przeglądaj więcej artykułów

Obrazowanie dwufotonoweobrazowanie kory mysiejutrudnianie przejrzystości czaszkiokno zamontowane na głowieobrazowanie in vivostruktury koroweobrazowanie wapniaobrazowanie u budzącej się myszydostęp optyczny

Ten artykuł został opublikowany

Film wkrótce dostępny

Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.