Obrazowanie w czasie rzeczywistym bez etykiet i analizy ilościowej morfodynamiki makrofagów z wykorzystaniem tomografii dyfrakcyjnej optycznej

Podsumowanie

Ten protokół opisuje bezznacznikowy przepływ pracy oparty na optycznej tomografii dyfrakcyjnej do obrazowania w czasie rzeczywistym i ilościowej analizy morfodynamiki makrofagów. Metoda umożliwia ciągłe śledzenie morfologii pojedynczych komórek i ich migracji, zapewniając pomiary w czasie rzeczywistym powierzchni rzutowanych, obwodu i średniej prędkości migracji podczas długotrwałego obrazowania żywych komórek.

Streszczenie

To badanie ustanawia etykietowo-wolną metodę tomografii dyfrakcyjnej optycznej (ODT) do obrazowania i analizy żywych komórek w celu obserwacji zależnych od czasu zmian morfologicznych w makrofagach. Metoda ta umożliwia ciągłe rejestrowanie morfologii i ruchu pojedynczych komórek przez dłuższy czas w stabilnych warunkach środowiskowych i pozwala na wyodrębnienie parametrów ilościowych, w tym przekroju rzutowego, obwodzie i średniej prędkości migracji. Ten przepływ pracy zapewnia praktyczne podejście do rejestrowania dynamicznych zachowań komórkowych na poziomie pojedynczych komórek bez egzogennego znacznikowania. Używając makrofagów RAW264.7 jako modelu, wykonano zdjęcia time-lapse pod stymulacją lipopolisacharydem z wstępnym stosowaniem baikalin, aby uchwycić dynamiczne zmiany komórkowe w różnych warunkach. Wybrane reprezentatywne komórki zostały poddane śledzeniu i analizie ilościowej. Wyniki pokazują, że ten przepływ pracy wspiera stabilne długoterminowe śledzenie pojedynczych komórek i odzwierciedla zmiany czasowe w morfologii i ruchliwości komórek. To podejście zapewnia metodę bez znacznikowania do obserwacji dynamicznych zachowań komórkowych w odpowiedzi na różne bodźce i może służyć jako użyteczne uzupełnienie konwencjonalnych testów opartych na punkcie końcowym. Może być również stosowane do innych przylegających typów komórek w badaniach morfodynamiki komórkowej.

Wprowadzenie

Makrofagi odgrywają centralną rolę w odpowiedziach odpornościowych wrodzonych i homeostazie tkankowej, a ich stany funkcjonalne mogą dynamicznie zmieniać się w reakcji na bodźce mikrośrodowiskowe. Tradycyjnie makrofagi opisywano jako przyjmujące fenotypy prozapalne lub przeciwzapalne/związane z naprawą^1,2. Jednak rosnące dowody sugerują, że aktywacji makrofagów jest to proces ciągły i elastyczny, a nie dyskretny, binarny stan3,4. W różnych warunkach makrofagi ulegają stopniowym zmianom w czasie, towarzyszącym zmianom w morfologii komórek i zachowaniu migracyjnym⁵. Dlatego czasowo rozdzielona charakterystyka zmian morfologicznych i migracyjnych na poziomie pojedynczych komórek zapewnia ważne podejście do badania dynamicznych odpowiedzi komórkowych.

Obecne podejścia do badania stanów makrofagów polegają głównie na immunobarwieniu, cytomierzu przepływowym oraz analizach transkryptomowych i proteomicznych⁶. Metody te są zwykle oparte na fiksowanych próbkach lub dyskretnych punktach czasowych, co ogranicza ich zdolność do śledzenia ciągłych zmian w tej samej komórce w warunkach żywych⁷. Obrazowanie żywych komórek oparte na fluorescencji umożliwia dynamiczne obserwacje, ale może być ograniczone przez fototoksyczność i fotoblanszowanie podczas długotrwałych eksperymentów^8,9. Optyczna tomografia dyfrakcyjna (ODT) to bezznacznikowa technika obrazowania, która rekonstruuje trójwymiarową dystrybucję wskaźnika załamania światła w komórkach, dostarczając ilościowych informacji strukturalnych¹⁰. Ponieważ nie wymaga egzogennego znacznikowania, ODT nadaje się do długotrwałego obrazowania żywych komórek i zmniejsza zakłócenia w zachowaniu komórkowym. W ostatnich latach ODT został zastosowany do dynamicznych badań w różnych modelach komórkowych¹¹, przy czym wcześniejsze badania koncentrowały się głównie na zdolności obrazowania i charakterystyce strukturalnej. W przeciwieństwie do tego, obecne badanie ustanawia standaryzowany, bezznacznikowy przepływ do długotrwałej, czasowo rozdzielczej analizy pojedynczych komórek morfodynamiki makrofagów w warunkach zdefiniowanej in vitro stymulacji.

Przepływ jest demonstrowany za pomocą in vitro modelu makrofagów RAW264.7 z stymulacją lipopolisacharydem (LPS) i wstępnym stosowaniem Baicalin (BAI). BAI został użyty jako reprezentatywny modulator eksperymentalny do ustanowienia zdefiniowanych warunków do demonstracji przepływu. Ciągłe obrazowanie umożliwia wyodrębnienie ilościowych parametrów pojedynczych komórek, w tym rzutowanej powierzchni, obwodu i średniej prędkości migracji, pozwalając na czasowo rozdzieloną charakterystykę zmian morfologicznych i zachowań. To podejście ma na celu dostarczenie opisowej analizy dynamicznych zmian fenotypu, a nie definiowanie stanów funkcjonalnych lub polaryzacji, i może służyć jako uzupełniająca metoda do testów opartych na punkcie końcowym, dostarczając informacji czasowych. Przepływ jest zweryfikowany w tym systemie modelowym i jest potencjalnie stosowany do innych adhezywnych typów komórek.

Protokół

1. Makrofagowa kultura

UWAGA: Przeprowadź wszystkie procedury w szafie biobezpieczeństwa, nosząc rękawiczki laboratoryjne i fartuch laboratoryjny.

1. Przygotuj pełne medium kulturowe (modyfikowane medium Eagle Dulbecco z wysoką zawartością glukozy (DMEM) uzupełnione o 10% płodowe surowica wołowa (FBS) i 1% penicylinę-streptomycynę).
2. Rozmrażaj fiolkę komórek makrofagów RAW264.7 w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C przez mniej niż 1 min.
3. Przenieś zawiesinę komórek do DMEM z wysoką zawartością glukozy uzupełnionego o 10% FBS i 1% penicylinę-streptomycynę.
4. Wiruj przez 5 min z prędkością 300 x g.
5. Wyrzuć nadstan.
6. Resuspenduj komórki w świeżym pełnym medium.
7. Zasiej komórki do 60 mm naczyń w ilości 2-5 x 10⁵ komórek na naczynie.
8. Inkubatoruj komórki w temperaturze 37 °C z 5% CO₂.
9. Nie zmieniaj medium w ciągu 12-24 godzin po rozmrażaniu.
10. Wymieniaj medium co 2-3 dni.
11. Monitoruj morfologię komórek za pomocą mikroskopu inwertowanego.
12. Przeprowadź przesiewy komórek w 80-90% konfluencji przez delikatne pipetowanie.
    UWAGA: Unikaj używania trypsyny. Używaj komórek na przesiewach 6-18. Wybierz komórki o jednolitej morfologii i bez wakuolizacji do eksperymentów. Linia komórkowa została uwierzytelniona przez profilowanie STR i poddana testom kontroli jakości. Szczegółowe raporty i angielskie podsumowanie są dostępne w Plikach uzupełniających.

2. Leczenie komórek

1. Zbierz komórki w fazie wzrostu logarytmicznego przez delikatne pipetowanie.
2. Resuspenduj komórki w pełnym medium.
3. Zmierzyj gęstość komórek za pomocą licznika komórek.
4. Dostosuj gęstość komórek do 4 x 10⁴ komórek/mL.
5. Zasiej 2 mL zawiesiny komórek do każdego 35 mm naczynia.
6. Przypisz naczynia do dwóch grup: (i) grupa LPS, (ii) grupa BAI + LPS.
7. Inkubatoruj komórki w temperaturze 37 °C z 5% CO₂ przez 12-16 godzin.
8. Przygotuj 50 mM roztwór BAI w DMSO. Przechowuj roztwór BAI w temperaturze -20 °C.
9. Dodaj BAI do grupy BAI + LPS do końcowej koncentracji 100 μM. Rozcieńcz roztwór BAI bezpośrednio w medium kulturowym, aby osiągnąć końcową koncentrację roboczą.
10. Dodaj równą objętość DMSO do grupy LPS.
11. Przygotuj roztwór LPS (1 mg/mL) w pełnym medium.
12. Dodaj LPS do obu grup do końcowej koncentracji 1 μg/mL. Rozcieńcz roztwór LPS bezpośrednio w medium kulturowym, aby osiągnąć końcową koncentrację roboczą.
13. Natychmiast przystąp do obrazowania i nie zmieniaj medium podczas obrazowania.

3. Pozyskiwanie tomografii dyfrakcyjnej optycznej

1. Włącz system obrazowania ODT i uruchom moduł kontroli środowiska.
2. Ustaw temperaturę stołu na 37 °C.
3. Ustaw stężenie CO₂ na 5%.
4. Pozwól systemowi na równowagę przez co najmniej 20 min.
5. Otwórz oprogramowanie do pozyskiwania danych.
6. Umieść naczynie kulturowe na etapie obrazowania.
7. Użyj obiektywu 60x (NA = 1,42), aby zlokalizować komórki.
8. Wybierz izolowane komórki z jasnymi granicami do obrazowania.
9. Ustaw przedział obrazowania na 8 min.
10. Ustaw całkowitą liczbę klatek na 181.
11. Włącz funkcję automatycznego ustawiania ostrości, aby utrzymać ostrość podczas obrazowania time-lapse.
12. Rozpocznij pozyskiwanie time-lapse.
13. Monitoruj stabilność systemu podczas pozyskiwania.
    UWAGA: Stabilizacja automatycznego ustawiania ostrości była stosowana przez cały eksperyment, aby zminimalizować dryft ogniskowania.

4. Rekonstrukcja obrazu i analiza ilościowa

1. Po pozyskaniu obrazu, oprogramowanie automatycznie wykonuje rekonstrukcję obrazu.
2. Za pomocą wbudowanego standardowego algorytmu. 
3. Poczekaj, aż pasek postępu się zakończy.
4. Otwórz oprogramowanie analityczne (Intellyseg, v2.1.0).
5. Importuj zestaw danych surowych, wybierając Importuj dane surowe.
6. Przeglądaj docelową folder.
7. Wybierz docelowy plik i zaimportuj zestaw danych. 
8. Kliknij “Komórka” aby wykonać automatyczną segmentację przy użyciu spójnych ustawień między zestawami danych¹³.
9. Wybierz komórki na podstawie następujących kryteriów: (i) bez nakładania się na sąsiednie komórki, (ii) nie w kontakcie z granicami obrazu, (iii) ciągle śledzone przez całą serię czasową.
<

Wyniki

Aby ocenić wydajność przepływu opartego na ODT, wykonano zdjęcia time-lapse dla dwóch grup leczenia (LPS i BAI + LPS), z pięcioma niezależnymi próbkami na grupę. Wszystkie próbki zostały nabyte w identycznych warunkach obrazowania. Ze względu na duże obciążenie związane z długotrwałą obserwacją pojedynczych komórek i analizą ilościową, jedna reprezentatywna próbka z każdej grupy została wybrana do analizy pojedynczych komórek i wizualizacji. Wyniki są przedstawione opisowo i nie są przeznaczone do wnioskowania statystycz...

Dyskusja

To studium ustanawia bezznacznikową pracę przepływową opartą na ODT do ciągłego obrażania i ilościowej analizy morfodynamiki makrofagów na poziomie pojedynczej komórki. Podejście to umożliwia czasowo rozdzielcze pomiary przewidzianej powierzchni, obwodu i średniej prędkości migracji podczas długotrwałego obrażania żywych komórek. Gęstość wysiewu komórek jest kluczowym czynnikiem wpływającym na wydajność segmentacji i śledzenia. Wysoka gęstość prowadzi do nakładania się komórek, podczas gdy niska gęstość zmniejsza liczbę ...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
ODT imaging system	Pellucid Optics	MH-PanoView	Stosowane do obrazowania żywych komórek bez znaczników
Oprogramowanie do pozyskiwania	Pellucid Optics	Lucida-Pano v2.1.0	Stosowane do pozyskiwania obrazów
Oprogramowanie do analizy	Pellucid Optics	Intellyseg v2.1.0	Stosowane do rekonstrukcji obrazu, segmentacji i śledzenia
RAW264.7	Wuhan Zishan Biotechnology	STCC20020P	Murzyńska linia komórek makrofagów służąca do eksperymentów polaryzacji i obrazowania in vitro.
Baikalin (BAI)	Shanghai Yuanye	JB246114	Stosowane do pretretmentu komórek
Lipopolysacharyd (LPS)	Solarbio	L8880	Stosowane do stymulacji makrofagów
Środkowisko DMEM	Gibco	C11995500BT	Środowisko do hodowli komórek
Surowica łożyskowa bydlęca	Procell	164210	Suplement do hodowli komórek
Penicylina–Strepromicyny (100x)	Procell	PB180120	Antybiotyki do hodowli komórek
35 mm szklana podłoga do hodowli	Corning	CLS430166	Stosowane do hodowli komórek
35 mm szklana podłoga do obrazowania	Cellvis	D35-10-1.5-N	Stosowane do obrazowania ODT
Mikroskop odwrócony	OLYMPUS	CKX53	Stosowane do rutynowej obserwacji i monitorowania komórek podczas hodowli.
Licznik komórek	RWD Life Science	C100	Stosowane do określania gęstości komórek