Artykuł badawczy

Zintegrowana analiza bioinformatyczna danych transkryptomiki ludzkich tkanek identyfikuje trzy kluczowe biomarkery diagnostyczne i prognostyczne w raku gruczołowym płuc

DOI:

10.3791/71214

⸱

30 czerwca 2026

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Laboratory Medicine, The Affiliated People's Hospital of Fujian University of Traditional Chinese Medicine, 2School of Medical Technology and Information Engineering, Zhejiang Chinese Medical University, 3Department of Laboratory Medicine, Fujian Nan'an Hospital, 4Department of Laboratory Medicine, Pujiang Tianxian Orthopedic Hospital, 5Department of Laboratory Medicine, People's Hospital of Dafang, 6Department of Laboratory Medicine, Fujian Medical University Union Hospital, 7Department of Laboratory Medicine, Fujian Pingtan Comprehensive Experimental Area Hospital, 8Medical Laboratory Center, Jinjiang Municipal Hospital, Shanghai Sixth People's Hospital, 9Medical Laboratory Center, Jinjiang Municipal Hospital, Teaching Hospital of Huaqiao University

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

To badanie zidentyfikowało biomarkery diagnostyczne i prognostyczne dla raka płuca typu grudkowego za pomocą danych transkryptomowych TCGA-LUAD i GEO GSE115002. B3GNT3, FERMT1 i SPP1 były wysoko eksponowane, odróżniając guzy od normalnego tkanki. Te geny są powiązane z przejściem nabłonkowo-mezenchymalnym i supresją odpornościową. Nomogramma łącząca ekspresję genów ze stopniem TNM wykazała wiarygodną wartość predykcyjną.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Rak płuc typu grudkowego (LUAD) jest główną przyczyną zgonów związanych z rakiem na całym świecie. Pomimo postępu w chirurgii, terapii ukierunkowanej i immunoterapii, 5-letnia przeżywalność zaawansowanego LUAD pozostaje poniżej 20%, co wskazuje na pilną potrzebę wiarygodnych biomarkerów molekularnych do wczesnego wykrywania i prognozowania. W niniejszym badaniu autorzy założyli, że trzy konsekwentnie nadmiernie eksponowane geny mogą działać jako skuteczne biomarkery diagnostyczne i prognostyczne dla LUAD. Autorzy przeanalizowali dane transkryptomiczne z dwóch niezależnych kohortach, TCGA-LUAD (535 nowotworów, 59 normalnych próbek) i GSE115002 (52 nowotwory, 52 dopasowane normalne próbki), aby przesiewać geny o zróżnicowanej ekspresji. Trzy rdzeniowe geny—B3GNT3, FERMT1 i SPP1—były konsekwentnie nadmiernie eksponowane w nowotworach LUAD w obu zbiorach danych. Geny te wykazały doskonałą wydajność diagnostyczną, z wartościami AUC powyżej 0,95 w TCGA-LUAD i wysoką dokładnością w GSE115002. Analiza przeżycia wykazała, że wysokie wystąpienie każdego genu było istotnie związane z krótszym ogólnym przeżyciem i przeżyciem wolnym od choroby, a wielowarstwowa regresja Cox potwierdziła ich niezależną wartość prognostyczną. Analiza wzbogacenia funkcjonalnego wskazała, że te trzy geny biorą udział w przejściu nabłonkowo-mezenchymalnym, przebudowie macierzy zewnątrzkomórkowej i supresji immunologicznej, które są ściśle związane z inwazją i przerzutami LUAD. Autorzy dodatkowo zbudowali nomogram prognostyczny łączący te trzy geny i stadiowanie TNM, osiągając indeks zgodności 0,743 i wykazując dobrą wydajność predykcyjną. Te odkrycia potwierdzają, że B3GNT3, FERMT1 i SPP1 są obiecującymi biomarkerami diagnostycznymi i prognostycznymi dla LUAD, wspierającymi zastosowanie kliniczne w stratyfikacji i zarządzaniu ryzykiem.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Rak płuc jest główną przyczyną globalnej śmiertelności z powodu raka, odpowiadając za około 1,8 miliona zgonów w 2020 roku1. Gruczolakorak płuca (LUAD) stanowi prawie 40% wszystkich przypadków raka płuca2. Pomimo postępu w chirurgii, terapii ukierunkowanej i immunoterapii, 5-letnie wskaźniki przeżywalności w przypadku zaawansowanego LUAD pozostają poniżej 20%3,4. Potrzebne są pilnie niezawodne biomarkery molekularne do wczesnego wykrywania i precyzyjnego prognozowania. Sekwencjonowanie dużej liczby próbek i publiczne bazy danych, takie jak The Cancer Genome Atlas (TCGA) i Gene Expression Omnibus (GEO), umożliwiają systematyczne profilowanie transkryptomu nowotworów5,6. Integracyjne narzędzie bioinformatyczne zwiększa niezawodność odkrywania kandydatów do biomarkerów5.

Wiele genów i ścieżek zostało związanych z LUAD, w tym proliferacja komórek, sygnałowanie EGFR i ucieczka immunologiczna7. Jednak niewiele z nich zostało przekształconych na zastosowania kliniczne. Modele ryzyka łączące sygnatury genów i cechy kliniczno-patologiczne—zwłaszcza nomogramy—poprawiają dokładność prognozowania w LUAD8. Podczas gdy B3GNT3, FERMT1 i SPP1 były indywidualnie powiązane z progresją raka, ich łączne wartości diagnostyczne, prognostyczne i regulacyjne w środowisku odpornościowym w LUAD nie zostały systematycznie zweryfikowane w niezależnych kohortach. To badanie dostarcza pierwszej zintegrowanej analizy tych trzech genów jako scalonych biomarkerów panelu dla LUAD, z klinicznie przydatnym nomogramem prognostycznym.

B3GNT3 koduje glikozylotransferazę, która stabilizuje PD‑L1 i wspomaga unikanie odpowiedzi odpornościowej9,10. FERMT1 (kindlin‑1) reguluje aktywację integrin i napędza przerzuty w rak płuca niedrobnokomórkowym (NSCLC)11,12. SPP1 (osteoponcina) pośredniczy w remodelacji macierzy pozakomórkowej, przejściu nabłonkowo-mezenchymalnym (EMT) i oporności na chemioterapię13,14,15. Geny związane z zegarem biologicznym również zostały wykazane jako przewidujące rokowanie i diagnozę LUAD16, podczas gdy różnice płciowe w LUAD zostały odkryte poprzez wielo-omiczne sieci sygnalizacyjne białek17. B3GNT3 i SPP1 są wydzielane lub umiejscowione na błonie, co sugeruje ich potencjalne zastosowanie jako minimalnie inwazyjnych biomarkerów. Skuteczną klasyfikację LUAD i identyfikację biomarkerów można również osiągnąć poprzez metody selekcji nakładających się cech18, a wielo-omiczne interakcje odgrywają ważne funkcje w progresji raka płuca19. Sygnatury genów mitochondrialnych, zidentyfikowane poprzez kompleksową integrację wielo-omików, mają również wartość dla rokowania i personalizowanej terapii LUAD20. B3GNT3 i SPP1 są wydzielane lub umiejscowione na błonie, co sugeruje ich potencjalne zastosowanie jako minimalnie inwazyjnych biomarkerów. To badanie miało na celu zidentyfikowanie solidnych biomarkerów LUAD za pomocą integracyjnej bioinformatyki, ocenę ich wydajności diagnostycznej i prognostycznej, zbadanie ich funkcji biologicznych i asocjacji odpornościowych oraz stworzenie klinicznie przydatnego nomogramu prognostycznego.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Źródła danych i przetwarzanie wstępne

  1. Przetwarzanie danych surowych w R (wersja 4.1.3; Windows 10 Pro).
  2. Dla GSE115002 zastosuj normalizację kwantylową używając limma (wersja 3.52.3).
  3. Filtruj geny o niskim wyrażeniu dla TCGA: zachowaj geny z CPM > 0,5 w ≥50% próbek.
  4. Filtruj geny o niskim wyrażeniu dla GSE115002: zachowaj geny ze średnim sygnałem >50.
  5. Zastosuj log2 transformację wartości ekspresji z pseudocountem +1.
    UWAGA: Dane dotyczące ekspresji genów LUAD i dane kliniczne zostały uzyskane z TCGA-LUAD (wersja 33.0, GDC Portal, pobrane 7 sierpnia 2025) oraz GSE115002 (mikromacierz Agilent, GEO, pobrane 7 sierpnia 2025). TCGA-LUAD obejmował 535 guzów i 59 normalnych próbek. GSE115002 obejmował 52 guzy i 52 dopasowane normalne próbki.

2. Identyfikacja różnic w ekspresji genów

  1. Użyj DESeq2 (wersja 1.36.0) dla TCGA RNA-seq oraz limma (wersja 3.52.3) dla GSE115002 do analizy różnic w ekspresji. Oblicz skorigowane wartości P (FDR) używając metody Benjamini-Hochberg.
  2. Aby zapewnić porównywalność między zbiorami danych, zastosowano jednolity |log₂FC| ≥ 1,0 dla obu kohorta. DEGs zdefiniowano jako FDR < 0,05 i |log₂FC| ≥ 1,0. Nakładające się DEGs zidentyfikowano za pomocą VennDiagram (wersja 1.7.3). B3GNT3, FERMT1 i SPP1 zostały wybrane jako konsekwentnie nadekspresyjne kandydaci o znanym znaczeniu dla raka.

3. Ocena wartości diagnostycznej

  1. Skonstruuj krzywe ROC dla każdego kandydatowego genu.
  2. Wyznacz optymalne wartości progowe używając indeksu Youdena.
  3. Oblicz AUC, czułość i swoistość dla każdego genu.
  4. Zbuduj połączony panel diagnostyczny używając wielowymiarowej regresji logistycznej.
    UWAGA: Do analizy ROC użyto pakietu pROC v1.18.0. Funkcja glm z rodziną binomialną została użyta do zbudowania modelu diagnostycznego.

4. Analiza przeżywalności

  1. Stratyfikuj pacjentów na grupy wysokiej i niskiej ekspresji używając mediany ekspresji.
  2. Generuj krzywe przeżywalności Kaplana-Meiera dla każdego genu.
  3. Przeprowadź testy log-ranka aby porównać różnice w przeżywalności.
  4. Przeprowadź jednowarstwową analizę regresji Coxa.
  5. Przeprowadź wielowartściową analizę regresji Coxa.
  6. Uwzględnij zmienne kliniczne w modelach regresji.
  7. Weryfikuj założenie proporcjonalnych zagrożeń używając reszty Schoenfelda.
  8. Oblicz trójgenowy wynik ryzyka.
    UWAGA: Do analizy przeżywalności użyto Survival v3.3.1 i survminer v0.4.9. Zmienne uwzględnione to wiek, płeć, stadium T, stadium N i stadium M. Wynik ryzyka został obliczony jako:
    Wynik ryzyka = (0,328 × B3GNT3) + (0,331 × FERMT1) + (0,321 × SPP1). (1)

5. Analiza wzbogacenia zestawów genów i adnotacji funkcjonalnej

  1. Przeprowadź analizę wzbogacenia GO używając DEGs.
  2. Przeprowadź analizę wzbogacenia ścieżek KEGG używając DEGs.
  3. Przeprowadź analizę wzbogacenia zestawów genów (GSEA).
  4. Przeprowadź rangowanie genów według korelacji Pearson z wyrażeniem kandydatowego genu.
  5. Identyfikuj istotne terminy używając skorigowanej wartości P < 0,05.
    UWAGA: Do analizy GO i KEGG użyto clusterProfiler v4.6.2. Do GSEA użyto FGSEA v1.22.0 i MSigDB Hallmark v7.5.

6. Analiza korelacji i sieci

UWAGA: Korelację Pearson zastosowano dla normalnie rozłożonej ekspresji genów; korelacja Spearman dla ułamków komórek odpornościowych. Sieci PPI zostały wygenerowane za pomocą STRING (wersja 11.5, pewność > 0,7) i zwizualizowano w Cytoscape (wersja 3.9.1). Przenikanie odpornościowe oszacowano używając CIBERSORT (tryb bezwzględny, 100 permutacji). Sekwencjonowanie RNA z pojedynczych komórek wykazało, że ujawnia przejścia nisz w mikrośrodowisku NSCLC, co jest istotne dla analizy przenikania odpornościowego21,22, a integracyjna analiza z pojedynczych komórek może dodatkowo rozdzielić role komórek odpornościowych, takich jak komórki pamięci CD8+, w LUAD23,24,25.

7. Budowa i walidacja nomogramu

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Globalne zmiany ekspresji genów w LUAD

Transkryptomiczne porównania między tkankami raka gruczołowego płuc a normalnymi tkankami płuc wykazały rozpowszechnione zmiany ekspresji genów. Rycina 1A przedstawia wykresy wulkanowe genów o zróżnicowanej ekspresji w zbiorze TCGA-LUAD, a Rycina 1B przedstawia je w zbiorze GSE115002. W kohorcie TCGA-LUAD (Rycina 1A) 1865 genów było znacząco wzmacnia...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nomograf został skonstruowany przy użyciu wielowymiarowej analizy regresji Cox na podstawie kohorty TCGA-LUAD. Wskaźniki obejmują patologiczny etap T, patologiczny etap N oraz status ekspresji genów B3GNT3, FERMT1 i SPP1 (sklasyfikowane jako Wysoki vs. Niski na podstawie średniej ekspresji). Dla każdego pacjenta, indywidualne wyniki dla każdej zmiennej są summowane, aby wygenerować wartość „Punkty łączne”, która odpowiada oszacowanym prawdopodobieństwom łącznej przeżywalności na 1, 2 i 3 lata. ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy deklarują, że nie mają żadnych konfliktów interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

To dzieło zostało wspierane przez projekt Uniwersytetu Tradycyjnej Medycyny Chin z Fuzhou na poziomie uczelni za rok 2024 (Numer grantu: XB2024012), prowadzony przez Yuhui Lin z Filii Szpitala Uniwersytetu Tradycyjnej Medycyny Chin z Fuzhou. oraz Wspólne fundusze na innowacje w dziedzinie nauki i technologii, prowincja Fujian (Numer grantu:2025Y9530)， prowadzone przez Xiaoting Chen z Municipalnego Szpitala Jinjiang (Szósty Szpital Ludowy w Szanghaju, Fujian).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Publicznie dostępne zestawy danychZestaw danych TCGA-LUADThe Cancer Genome Atlas (TCGA) Portal (https://portal.gdc.cancer.gov/); 535 próbek nowotworów LUAD, 59 sąsiednich próbek normalnej tkanki płucnej (ilości sekwencjonowania RNA/wartości FPKM + dane kliniczne: przeżycie, stadium TNM)Dane transkryptomiczne i kliniczne do analizy różnicowej ekspresji, przeżycia i analizy nomogramowej; główna kohorta badawcza
Zestaw danych GSE115002Gene Expression Omnibus (GEO) (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE115002); mikroarray Agilent, 52 tkanki nowotworowe LUAD, 52 dopasowane sąsiednie normalne tkanki płucne (pierwotne guzy nieleczone)Niezależna kohorta walidacji do analizy różnicowej ekspresji, wydajności diagnostycznej i analizy infiltracji immunologicznej
Oprogramowanie i środowisko programistyczne bioinformatyczneJęzyk programowania RWersja 4.1Podstawowa platforma dla wszystkich analiz transkryptomicznych, statystycznych i graficznych
Pakiety R (Analiza różnicowej ekspresji)DESeq2, limmaDESeq2: Analiza różnicowej ekspresji surowych danych RNA-seq TCGA; limma: Normalizacja mikroarray GSE115002 i analiza różnicowej ekspresji (korekta FDR Benjamini–Hochberg)
Pakiety R (Analiza diagnostyczna)pROCKonstrukcja krzywych ROC, obliczenie AUC (95% CI), określenie optymalnego progu (wskaźnik Youdena) do oceny wydajności diagnostycznej
Pakiety R (Analiza przeżycia)survival, survminerGenerowanie krzywych przeżycia Kaplana–Meiera, test log-rank, regresja proporcjonalnego zagrożenia Cox (HR + 95% CI) jedno- i wielowymiarowa; stratyfikacja pacjentów według mediany ekspresji genu
Pakiety R (Analiza funkcjonalna)clusterProfiler, fgseaclusterProfiler: Analiza wzbogacenia ścieżek GO (BP/CC/MF) i KEGG (skorygowany P < 0,05); fgsea: GSEA dla zestawów genów MSigDB Hallmark/KEGG (FDR < 0,25)
Pakiety R (Konstrukcja i walidacja nomogramu)rmsOpracowanie nomogramu prognostycznego (integracja ekspresji genu + stadiowania TNM); obliczenie indeksu C Harrella, przeliczanie bootstrap (1000 powtórzeń) w celu korekcji błędów, generowanie wykresu kalibracji
Pakiety R (Statystyka i wizualizacja)ggplot2, ComplexHeatmap, corrplotGenerowanie wykresów wulkanu, wykresów bąbelkowych (wzbogacenie), wykresów cieplnych (korelacja infiltracji immunologicznej), wykresów rozproszonych (współwystępowanie genów); Analiza korelacji Pearsona/Spearmana
Bazy danych i narzędzia bioinformatyczne (Analiza sieciowa/immunologiczna)Baza danych STRINGWynik pewności > 0,7Konstrukcja sieci oddziaływań białko-białko (PPI) dla B3GNT3/FERMT1/SPP1 i interaktorów pierwszego stopnia
Cytoscape-Wizualizacja sieci PPI i współwystępowania genów (ważenie krawędzi według siły korelacji, identyfikacja genu centralnego)
Algorytm dekonwolucji immunologicznejCIBERSORTEstymacja obfitości infiltracji komórek odpornościowych (makrofagi M2, komórki T CD8+, neutrofile, komórki NK itp.) w próbkach LUAD; korelacja z ekspresją genów kandydatów
Inne narzędziaMicrosoft Office/LaTeX-Przygotowanie rękopisu, zestawienie figur i formatowanie tabel; kompilacja wyników statystycznych

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Cancer ResearchB3GNT3FERMT1SPP1biomarkerprognosisgene expressionnomogram

Powiązane artykuły