Transfer mitochondrialny zewnętrznego pochodzenia w różnicujących się brązowych adipocyteach i preadipocytach z niedoborem AGPAT2

Podsumowanie

Eksogenousne mitochondria pochodzenia ludzkiego i mysiego mogą być internalizowane przez różnicujące się preadipocyty i śledzone podczas różnicowania adipogennego za pomocą narzędzi obrazowania i genetycznych. Chociaż mitochondria te fizycznie wchodzą w interakcje z endogenną siecią mitochondriów, nie zwiększają ekspresji markerów związanych z dojrzałymi brązowymi adipocytami.

Streszczenie

Mitochondria są kluczowymi punktami sygnałowymi; jednak, czy ekspansja masy mitochondrialnej jest mechanistycznie wymagana dla różnicowania pozostaje otwartym pytaniem. AGPAT2 katalizuje przemianę kwasu lizofosfatidowego w kwas fosfatidynowy, a jego niedobór prowadzi do niedoboru tkanki tłuszczowej i upośledzonej adypogenezy związanej ze zmniejszoną masą mitochondrialną. Wpływ ekspansji masy mitochondrialnej na adypogenezę został oceniony poprzez transfer egzogennych mitochondriów do różnicujących się brązowych adipocyteów. Zbadano również, czy transfer mitochondrialny mógłby uratować upośledzoną adypogenezę komórek z niedoborem AGPAT2. Ludzkie i mysie mitochondria zostały pomyślnie przeniesione i włączone do endogennej sieci mitochondrialnej różnicujących się myszych preadipocytów i utrzymały się przez cały okres brązowej adypogenezy. Różnicowanie adypogeniczne było wymagane do utrzymania przeniesionych mitochondriów. Transfer mitochondrialny nie modyfikował ekspresji molekularnych markerów dojrzałych brązowych adipocyteów ani zawartości kropel lipidowych, chociaż wpływał na względny rozkład wielkości kropel lipidowych w sposób zależny od gatunku. W przypadku preadipocytów Agpat2^-/- transfer mitochondrialny nie uratował adypogenezy, co wskazuje, że sama ekspansja masy mitochondrialnej nie jest wystarczająca, aby odwrócić mechanizmy prowadzące do lipodistrofii w tym modelu. Wyniki te wskazują, że chociaż egzogenne ludzkie i mysie mitochondria mogą być włączone do sieci mitochondrialnej różnicujących się adipocyteów, nie wpływają one bezpośrednio na program adypogeniczny.

Wprowadzenie

Poza ich głównymi rolami bioenergetycznymi, mitochondria służą jako centra sygnałowe w wielu procesach komórkowych, w tym w różnicowaniu komórek^1,2,3,4. Brązowa tkanka tłuszczowa (BAT) posiada znacznie wyższą masę mitochondrialną, aby wspierać jej aktywność termogeniczną, co podkreśla jej rolę w bilansie energetycznym całego ciała i w patogenezie otyłości⁵. Podczas gdy masa mitochondrialna jest regulowana przez równowagę między biogenezą a mitofagią, nie jest jasne, czy ekspansja masy mitochondrialnej podczas różnicowania brązowych adipocytek jest funkcjonalnie wymagana dla adipogenezy czy jest jedynie konsekwencją tego procesu.

Fizjologiczny transfer mitochondrialny między komórkami został udokumentowany zarówno in vitro, jak i in vivo, gdzie przyczynia się do adaptacji tkankowej w warunkach patologicznych, w tym do dysfunkcji tkanki tłuszczowej związanej z otyłością i opornością na insulinę^6,7. Ponadto, sztuczny transfer mitochondrialny in vitro wykazał się zwiększeniem pojemności oddechowej komórek odbiorczych⁸. Razem, te odkrycia wspierają koncepcję, że transfer mitochondrialny może modyfikować funkcję metaboliczną komórek i może przyczyniać się do adaptacji tkankowej w warunkach stresu bioenergetycznego^9,10,11. W porównaniu z strategiami farmakologicznymi lub genetycznymi, które stymulują endogenną biogenezę mitochondrialną poprzez aktywację programów transkrypcyjnych jądrowych i mitochondrialnych, transfer mitochondrialny bezpośrednio dostarcza organelle do komórek odbiorczych, umożliwiając szybką modyfikację masy mitochondrialnej niezależnie od manipulacji transkrypcyjnych^12,13. Takie podejście jest kluczowe dla korygowania defektów w chorobach mitochondrialnych, ale również umożliwia badanie działań mitochondrialnych bez potencjalnych efektów ubocznych podejść farmakologicznych lub genetycznych¹⁴.

W niniejszym badaniu zbadaliśmy wpływ sztucznego zwiększenia masy mitochondrialnej poprzez egzogenny transfer mitochondrialny w różnicujących się brązowych adipocytech. Takie podejście umożliwiło bezpośrednią ocenę wpływu masy mitochondrialnej na program adipogenny. Aby to osiągnąć, protokoły transferu mitochondrialnego oryginalnie opracowane dla komórek mezenchymalnych zostały zaadaptowane¹⁵ z wykorzystaniem zarówno ludzkich komórek wątroby, jak i mysich preadipocytów jako donorów mitochondrialnych. Metoda śledzenia ludzkich mitochondria w różnicujących się mysich komórkach została opracowana przy użyciu narzędzi genetycznych w połączeniu z technikami obrazowania, co wykazało, że mitochondria pochodzące z obu źródeł są inkorporowane do endogennej sieci mitochondrialnej i utrzymują się przez cały okres różnicowania adipogennego.

Aby zamodelować defektem adipogenezę związaną z niską masą mitochondrialną, zastosowano różnicujące się brązowe adipocyte wywodzące się od myszy z niedoborem 1-acyloglicerol-3-fosfat-O-acylotransferazy 2 (AGPAT2) (AGPAT2^-/-). AGPAT2 jest wysoko ekspresowany w tkance tłuszczowej, gdzie katalizuje tworzenie kwasu fosfatydowego w szlaku biosyntezy glicerolipidów. Niedobór AGPAT2 powoduje ciężką lipodystrofiję zarówno u ludzi, jak i u myszy i upośledza adipogenezę w modelach białych i brązowych adipocytek w związku ze zmniejszoną masą mitochondrialną^16,17,18. Włączenie egzogennych mitochondria do różnicujących się preadipocytów nieznacznie zmieniło rozkład wielkości kropel lipidowych, ale nie zwiększyło ekspresji markerów dojrzałych brązowych adipocytek ani nie odratowało upośledzenia adipogenezy preadipocytów AGPAT2^-/-.

Protokół

Zabiegi z użyciem zwierząt zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki nad Zwierzętami w Pontificia Universidad Católica de Chile, protokół 210609003. W badaniu wykorzystano myszy noworodków obu płci o genotypie dzikiego typu i Agpat2^-/- P0.5, pochodzących z mieszanego tła genetycznego C57BL/6J i 129J. Osobisty sprzęt ochronny (PPE): Nosić labradorkę laboratoryjną, gogle ochronne i rękawiczki nitrylowe. Zobacz Dodatek plik 1 dla dodatkowych szczegółów protokołu i Tabela 1 dla buforów wymaganych dla tego protokołu.

Wszystkie toksyczne odpady chemiczne generowane podczas przygotowania do mikroskopii elektronowej, fiksacji paraformaldehydem i ekstrakcji kwasu nukleinowego muszą być ściśle rozdzielone na wyznaczone, jasno oznakowane strumienie zgodnie z instytucjonalnymi przepisami dotyczącymi zdrowia i bezpieczeństwa środowiska (EHS). Pod żadnym pozorem żaden z tych reagentów nie powinien być wlewan do zlewozmywaka laboratoryjnego lub publicznego systemu kanalizacyjnego. Wszystkie wygenerowane niebezpieczne odpady chemiczne muszą być rozdzielone zgodnie z instytucjonalnymi klasyfikacjami EHS.

1. Kultura komórek

1. Izolacja, różnicowanie i utrzymanie pierwotnych adipocytów (iBAT)
   UWAGA: Zobacz Dodatek plik 1 dla krótkiej opisu procedur i Tabela 1 dla składu wymaganych roztworów. Pełne i szczegółowe wyjaśnienie naszego in vitro protokołu różnicowania brązowych adipocytów można znaleźć w Figueroa i in.¹⁹.
   1. Izoluj preadipocyty z międzylopatkowego brązowego tkanki tłuszczowej (iBAT) noworodków (P0.5) zgodnie z procedurami chirurgicznymi i enzymatycznej digestii opisanych przez Figueroa i in.¹⁹.
   2. Różnicuj i utrzymuj kulturę adipocytów brązowych zgodnie z koktajlem różnicującym i harmonogramem wymiany pożywki.
      UWAGA: Dla sukcesu różnicowania adipogennego, krytycznie ważne jest, aby kultury osiągnęły 90-100% konfluencji przed rozpoczęciem indukcji adipogennej.
2. Kultura HepG2
   1. Kultivouj komórki HepG2 w DMEM uzupełnionym o 10% surowicy wołowej płodowej, 100 U/mL penicyliny, 100 µg/mL streptomycyny i 0,25 µg/mL amfoterycyny B. Utrzymuj komórki w 37 °C w inkubatorze skraplanym z 5% CO₂.
      UWAGA: Te komórki rosną w klastrach i mogą wydawać się subkonfluencyjne, mimo wysokiej gęstości, ze względu na wielowarstwowy wzrost.

2. Izolacja i transfer mitochondriów

1. Izolacja mitochondriów
   UWAGA: Wykonuj wszystkie kroki w szafce biobezpieczeństwa w 4 °C lub na lodzie. Używaj preparatu w ciągu 2 godzin.
   1. Zasiej 2 × 10⁶ komórek donora (HepG2 lub preadipocytów) w 100 mm naczyniach kulturowych. Utrzymuj komórki do osiągnięcia 80% (HepG2) lub 100% (preadipocytów) konfluencji.
   2. Przybarw komórki donora 100 nM MitoTracker Deep Red FM w medium bez FBS przez 30 min w 37 °C w inkubatorze z 5% CO₂.
   3. Wypłukuj komórki 2x środkiem wzrostowym, aby usunąć nadmiar barwnika.
   4. Odłącz komórki za pomocą trypsyny, zebraj zawiesinę i wyśrodkuj w 300 × g przez 5 min w 4 °C.
   5. Resuspenduj pellet w 1 mL buforu izolacji mitochondriów (MIB) uzupełnionego o BSA, inhibitory proteaz i inhibitory fosfataz. Zniszcz membranę plazmatyczną, przepuszczając zawiesinę przez strzykawkę tuberculinową 5x. Homogenizuj zawiesinę, przepuszczając ją przez strzykawkę do insuliny co najmniej 10x, aż roztwór stanie się jasnobrązowy i pozbawiony widocznych kępek.
      UWAGA: Dla analizy western blot, wydzielaj 50 µL całkowitego lizatu i przechowuj w -20 °C.
2. Wyśrodkuj homogenat w 900 × g przez 11 min w 4 °C.
   UWAGA: Jeśli nadstan po wyśrodkowaniu w 900 × g nie jest mętny, lizys komórkowa jest prawdopodobnie niekompletna.
   1. Zbierz nadstan i wyśrodkuj w 10.000 × g przez 10 min w 4 °C, aby wysrodkować mitochondria. Wypłukuj pellet mitochondrialny 3x w MIB uzupełnionym o BSA.
   2. Przeprowadź końcowe resuspendowanie w 100 µL MIB bez BSA. Określ stężenie białka za pomocą testu BCA.
3. Asekurat transferu mitochondriów (MTA) w preadipocytach
   1. Zasiej preadipocyty odbiorcze w 5 × 10⁵ komórek/dołku w 12-dołkowych naczyniach (z 18 mm pokrywkami szklanymi do mikroskopii) 24 h przed badaniem.
   2. Dodaj izolowane mitochondria donora

Wyniki

Ekstrakcja mitochondriów i integralność strukturalna i oddechowa

Aby ocenić wpływ zwiększonej masy mitochondriów na adypogenezę brązową, przeprowadzono test transferu mitochondrialnego (MTA) w niezróżnicowanych preadipocytach (Rysunek 1A). Mitochondria zostały wyizolowane z pierwotnych myszych preadipocytów (mMito) i z ludzkiej linii komórek wątrobowych HepG2 (hMito). Analiza Western blot wykazała, że obie preparaty były wysoce wzbogacone w mitoch...

Dyskusja

Biologiczne implikacje transferu mitochondriów w adipogenesie

Nasze wyniki pokazują, że choć egzogenne mitochondrium z zarówno ludzkich jak i mysiej źródeł może być włączone do endogennej sieci mitochondrialnej różnicujących się preadipocytów, sztuczne zwiększenie masy mitochondrialnej nie jest wystarczające do wprowadzenia brązowego programu adipogenicznego. Te wyniki sugerują, że ekspansja mitochondrialna charakterystyczna dla brązowej adipogenesy jest konsekwencją różnicowa...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
100 mm plate	SPL Life Science	10101SPL
10x Tris/Glycine Buffer	BioRad	1610734
12 mm glass coverslips	Marienfeld	111520
12-well plate	SPL Life Science	30012SPL
16% Paraformaldehyde Aqueous Solution	Invitrogen	28908
18 mm glass coverslips	HART	-
24-well plate	SPL Life Science	30024SPL
3,3',5-Triiodo-L-thyronine sodium salt (T3)	Sigma	T6397
3-Isobutyl-1-methylxanthine (IBMX)	Calbiochem	410957
30% Acrylamide/Bis Solution, 37.5:1	BioRad	1610158
35 mm plate	SPL Life Science	20035SPL
6-well plate	SPL Life Science	30006SPL
60 mm culture dish	SPL Life Science	20060SPL	Używano do eksperymentów z pierwotnymi preadipocytami i DNA/qPCR; dostawca/katalog nie podano
AccuRuler RGB Plus Pre-stained Protein Ladder	Maestrogen	02102-250
ACK lysing buffer	Gibco	A10492-01
Actrapid 100 UI/mL (Insulin)	Novo Nordisk	A10AB01
ADP	Merck	117105
Agarose	FERMELO BIOTEC	FER00AL200G	Używano do weryfikacji integralności RNA; dostawca/katalog nie podano
Ammonium Persulfate	BioRad	1610700
Anti-rabbit IgG, HRP-linked Antibody	Cell Signaling	7074
Anti-rat IgG, HRP-linked Antibody	Cell Signaling	7077
Antibiotic-antimycotic	Gibco	15240062
Axio Observer inverted microscope stand	Carl Zeiss	431007-9901-000	Dodano z Suplementarnych Metod
BCA Protein Assay Kit	Thermo Scientific	D49328
BD Cytometer Setup and Tracking beads	BD Biosciences	-	Dodano z Suplementarnych Metod; katalog nie podano
BD FACSDiva Software v8.0.3	BD Biosciences	-	Dodano z Suplementarnych Metod
BD LSRFortessa X-20 cell analyzer	BD Biosciences	-	Istniejący wpis standaryzowany, aby pasował do dodatkowego pliku
BioRender	BioRender	-	Używano do stworzenia przepływu pracy w Figurze 1
Blotting-grade blocker	BioRad	170-6404
BODIPY 493/503	Invitrogen	D3922
Bovine Serum Albumin (BSA)	Sigma	A1470
CaCl2	Calbiochem	208291
cDNA Reverse Transcription Kit	Invitrogen	4374966
Cell Strainer 100 μm, nylon	Falcon	352360
Cell Strainer 40 μm, nylon	Falcon	352340
Collagenase type II	Gibco	17101-015
Dexamethasone	Sigma	D4902
DMEM Powder, High Glucose, Pyruvate	Thermo Scientific	12800017
DMEM/F-12, no phenol red	Thermo Scientific	21041025
DMEM/F-12, powder	Gibco	12500062
DMSO	Sigma	D8418	Rozpuszczalnik do medium indukcyjnego; dostawca/katalog nie podano
EMBed-812 EMBEDDING KIT (Epon)	Electron Microscopy Sciences	14120
Ethanol absolute	Merck	100983
Ethylene glycol-bis(β-aminoethyl ether)-N,N,N',N'-tetraacetic acid tetrasodium salt (EGTA)	Merck	324626
FAST SYBR MASTER MIX	Thermo Scientific	4385612
FCCP	Sigma	C2920
Fetal bovine serum	Capricorn Scientific	BS-16A
Floreada.io	Floreada.io	-	Oprogramowanie do analizy cytometrii przepływowej
Fluoromount-G	Thermo Scientific	7984-25
GAPDH Antibody	Santa Cruz	sc-32233
Glucose	Gibco	15023-021
Glutamate	Sigma	G1626
Glutaraldehyde 25% Aqueous Solution	Electron Microscopy Sciences	16210
Goat anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, HRP	Invitrogen	62-6520
GraphPad Prism v10.6.1	GraphPad Software	-	Oprogramowanie do analizy statystycznej/regresji logarytmicznej
Halt Protease and Phosphatase Inhibitor Cocktail 100X	Thermo Scientific	78442
HEPES	Biological Industries	41-122-100
Histone H3 (1G1)	Santa Cruz	sc-517576
Hoechst 33342	Life Technologies	H3570
ImageJ v1.54s	NIH	-	Oprogramowanie do analizy obrazów kropel lipidowych
Immun-Blot PVDF Membrane	BioRad	1620177
Indomethacin	Sigma	I7378
Insulin syringe	Cranberry	AAJECIN3	Używano do homogenizacji komórek; dostawca/katalog nie podano
KCl	Calbiochem	529552
KH2PO4	Calbiochem	529568
KHCO3	Sigma	60339
LAMP-1 Antibody	Abcam	ab25245
Lane Marker Reducing Sample Buffer	Thermo Scientific	39000
Malate