Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł badawczy
Sesquiterpene lakton XTT skutecznie osłabia spowodowane lipopolisacharydem (LPS) reakcje zapalne w makrofagach. XTT działa na IKKα/β aby hamować sygnalizację NF-κB bez wpływu na aktywację MAPK, wywierając tym samym silne działanie przeciwzapalne in vitro.
Deregulacja kaskady czynnika jądrowego-κB (NF-κB) jest ściśle związana z progresją chorób zapalnych. Kinazy IκB (IKKs) są uznawane za centralne modulatory aktywności NF-κB, co sprawia, że są atrakcyjnymi kandydatami terapeutycznymi w leczeniu patologii zapalnych. Sesquiterpene lakton 1β-hydroksyl-5α-chloro-8-epi-xanthatin (XTT) ma udokumentowane działanie przeciwnowotworowe. Jednak jego działanie przeciwzapalne i leżące mu pod tym podwaliny mechanizmy molekularne pozostają niejasne. W niniejszej pracy XTT znacznie hamowało syntezę tlenku azotu (NO) i prostaglandyny E2 (PGE2) w aktywowanych lipopolisacharydem (LPS) makrofagach RAW264.7. XTT znacznie obniżył również poziomy mRNA syntazy tlenku azotu (iNOS), cyklooksygenazy-2 (COX2), czynnika nekrozującego guzów-α (TNF-α), interleukiny-1β (IL-1β) i interleukiny-6 (IL-6) wywołane przez LPS. Co więcej, XTT obniżył poziomy białek iNOS i COX2 wywołane przez leczenie LPS. Na poziomie mechanistycznym, XTT nie zmienił znacząco aktywności kaskady białka aktywowanego kinazami MAP (MAPK). Z drugiej strony, XTT mocno blokował fosforylację i rozkład hamującego κBα (IκBα) wywołane przez LPS poprzez interakcję z IKKα/β, co uniemożliwia translokację jądrową NF-κB. Łącznie dane te pokazują, że XTT wywiera znaczne działanie przeciwzapalne in vitro poprzez dotarcie do IKKα/β i blokowanie sygnalizacji NF-κB. Wyniki te sugerują, że XTT może służyć jako obiecująca związek prowadzący do opracowania środków przeciwzapalnych. Dalsze badania biochemiczne i in vivo są potrzebne, aby potwierdzić bezpośrednie hamowanie IKKα/β i potencjał terapeutyczny.
Zapalanie jest ściśle regulowanym procesem biologicznym, który umożliwia organizmom reagowanie na infekcję, uszkodzenie tkanki i inne wyzwania środowiskowe1. Chociaż ostre reakcje zapalne są ogólnie ochronne, trwałe aktywowanie ścieżek zapalnych może zakłócić homeostazę tkanki i przyczyniać się do wystąpienia i progresji przewlekłych chorób, w tym chorób zapalnych jelit (IBD) i reumatoidalnego zapalenia stawów (RA)2. Liczne wewnątrzkomórkowe sieci sygnałowe biorą udział w regulacji zapalenia, wśród których ścieżka czynnika nuklearnego-κB (NF-κB) jest jedną z najbardziej dogłębnie badanych3.
Członkowie rodziny NF-κB, w tym p50, p52, p65 (RelA), RelB i c-Rel, funkcjonują jako dimeryczne czynniki transkrypcyjne, które regulują ekspresję genów zaangażowanych w odporność i stan zapalny4,5. W warunkach podstawowych, dimer NF-κB pozostają nieaktywne w cytoplazmie poprzez wiązanie z białkami inhibitora κB (IκB). Po stymulacji przez czynniki zapalne takie jak lipopolisacharyd (LPS) lub czynnik nekrozujący guz-α (TNF-α), zespół kinazy IκB (IKK) zostaje aktywowany i fosforyluje IκBα, co skutkuje jego ubiquitinacją i degradacją. Proces ten umożliwia akumulację kompleksów NF-κB w jądrze i inicjuje transkrypcję czynników zapalnych i cytokin6. Ponieważ nadmierna lub trwała aktywność NF-κB jest ściśle związana z różnorodnymi chorobami zapalnymi i autoimmunologicznymi, farmakologiczne interwencje na poziomie sygnałowym IKK przyciągnęły znaczne zainteresowanie7,8,9.
Produkty naturalne od dawna są ważnymi źródłami dla rozwoju leków, w tym leków przeciwzapalnych10. 1β-hydroksyl-5α-chloro-8-epi-xanthatyna (XTT) to lakton seskwiterpenowy izolowany z Xanthium sibiricum11,12. Poprzednie badania wykazały, że XTT hamuje proliferację komórek i wyzwala apoptozę w ludzkich komórkach raka wątrobowkomórkowego poprzez ROS-pośredniczoną aktywację ERK/p38 MAPK i hamowanie JAK2/STAT3 spowodowane wyczerpaniem glutationu13. Jednak przeciwzapalny potencjał XTT i związane z nim mechanizmy molekularne są nadal słabo rozumiane.
Obecne wyniki wskazują, że XTT wykazuje znaczne działanie przeciwzapalne in vitro. Badania mechanistyczne wskazują, że XTT wchodzi w interakcje z IKKα/β i hamuje sygnał NF-κB, zatem hamuje reakcje zapalne w aktywowanych makrofagach. Te wyniki sugerują, że XTT może stanowić obiecujące związki prowadzące do opracowania środków przeciwzapalnych.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
To badania obejmowały tylko udokumentowane komórki komercyjne i nie obejmowały udziału ludzi, próbek klinicznych ani eksperymentów na zwierzętach. Dlatego nie była wymagana zgoda instytucjonalnego komitetu etycznego ani zgoda na udział. Wszystkie eksperymenty przeprowadzono zgodnie z instytucjonalnymi wytycznymi dotyczącymi bezpieczeństwa laboratorium. Niebezpieczne odczynniki były obsługiwane w wyznaczonych kapturach wentylacyjnych, stosując odpowiednie środki ochrony osobistej (PPE). Odpady chemiczne i biologiczne były niszczone zgodnie z instytucjonalnymi regulacjami. Substancje chemiczne, zestawy i odczynniki użyte w protokołach są wymienione w Tabeli Materiałów.
1. Hodowla komórek
Komórki makrofagów muryny RAW264.7, ludzkie komórki raka szyjki macicy HeLa i ludzkie komórki nerki zarodkowej HEK293T zostały zakupione od Banku Komórek Chińskiej Akademii Nauk (Szanghaj, Chiny). Wszystkie komórki były utrzymywane w pożywce Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) zawierającej 10% fetalnego surowicy bydlęcej (FBS) i 1% penicyliny-streptomycyny. Środowisko hodowlane było ustawione na 37 °C z 5% CO₂ i nasyconą wilgotnością.
2. Ocena żywotności komórek
Żywotność komórek została oszacowana za pomocą zestawu Cell Counting Kit-8 (CCK-8). Komórki RAW264.7 (2,5 × 104 komórek/dołkiem) zostały zasadowe na 96-dołkowych płytkach i hodowane przez noc w 37 °C. Następnie komórki były traktowane różnymi stężeniami XTT przez 24 h z lub bez LPS (0,5 µg/mL). Stężenie LPS i czas trwania leczenia zostały zoptymalizowane w wstępnych eksperymentach, aby wywołać umiarkowaną reakcję zapalną bez wywoływania istotnej cytotoksyczności. Następnie do każdego dołka dodano 10 µL odczynnika CCK-8, a płytka była utrzymywana w 37 °C przez 2 h. Absorbancję mierzono przy 540 nm za pomocą czytnika płytek.
3. Oznaczanie stężeń NO i PGE₂ w pożywce hodowlowej
Komórki RAW264.7 zostały zasadowe na 24-dołkowych płytkach z gęstością 2,5 × 105 komórek/dołkiem i hodowane przez noc w 37 °C. Komórki były wstępnie traktowane XTT przez 2 h przed stymulacją LPS lub TNF-α (15 ng/mL) przez kolejne 24 h. 2-godzinny okres wstępnego traktowania został wybrany, aby umożliwić odpowiednią interakcję XTT z celami komórkowymi przed wyzwaniem zapalnym. Stężenia tlenku azotu (NO) i prostaglandyny E₂ (PGE₂) w pożywce hodowlowej zostały określone zgodnie z protokołami producenta.
4. Ilościowa czasoprzestrzenna reakcja łańcuchowa polimerazy (qRT-PCR)
Komórki RAW264.7 (2 × 106 komórek) zostały zasadowe na 6-dołkowych płytkach przez noc i wstępnie traktowane różnymi dawkami XTT przez 2 h przed wyzwaniem LPS (0,5 µg/mL) przez 24 h. Łączna ilość RNA została wyizolowana za pomocą odczynnika TRIzol zgodnie z instrukcjami producenta. Stężenie RNA i czystość zostały oceniane za pomocą spektrofotometru, a próbki z współczynnikami A260/A280 >1,8 zostały wykorzystane do dalszych analiz.
Łączna ilość RNA (2 µg) została odwrotnie transkrybowana na cDNA w końcowej objętości reakcji 20 µL za pomocą zestawu do syntezy cDNA. Ilościowa czasoprzestrzenna PCR została przeprowadzona z zastosowaniem chemii SYBR Green na systemie wykrywania PCR czasoprzestrzennej. Sekwencje primerów przedstawiały się następująco:
iNOS do przodu: 5′-GGA TCT TCC CAG GCA ACC A-3′
iNOS wspak: 5′-AAT CCA CAA CTC GCT CCA AGA TT-3′
COX2 do przodu: 5′-CAA CAC CTG AGC GGT TAC-3′
COX2 wspak: 5′-GTT CCA GGA GGA TGG AGT-3′
IL-1β do przodu: 5′-GCC TTG GGC CTC AAA GGA AAG AAT C-3′
IL-1β wspak: 5′-GGA AGA CAC AGA TTC CAT GGT GAA G-3′
IL-6 do przodu: 5′-TGG AGT CAC AGA AGG AGT GGC TAA G-3′
IL-6 wspak: 5′-TCT GAC CAC AGT GAG GAA TGT CCA C-3′
TNF-α do przodu: 5′-CAC CAC GCT CTT CTG TCT-3′
TNF-α wspak: 5′-GGC TAC AGG CTT GTC ACT C-3′
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
XTT hamowało produkcję NO i PGE₂ w makrofagach RAW264.7 stymulowanych LPS lub TNF-α
Aby określić, czy przeciwzapalne działanie XTT było niezależne od cytotoksyczności, oceniano żywotność komórek RAW264.7 po leczeniu XTT w obecności lub w nieobecności LPS. Nie stwierdzono znaczącego zmniejszenia żywotności komórek w stężeniach od 0,5 do 8 µM, co wskazuje, że związek był dobrze tolerowany w warunkach eksperymentu (Rycina 1). Na podstawie tych wyników wybrano stężenia 2–8...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Laktatony seskwiterpenowe są klasą naturalnych produktów o różnorodnych działaniach farmakologicznych, w tym o działaniach antyseptycznych, przeciwzapalnych, przeciwgorączkowych i detoksykacyjnych15. Poprzednie badania wykazały, że XTT, lakton seskwiterpenowy typu ksantanolidu izolowany z Xanthium sibiricum, wykazuje silne działanie przeciwrozrostowe i pro-apoptotyczne w ludzkich komórkach rakowych wątroby13. Niniejsza praca oceniła właściwości przeciwzapalne XTT w...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Autorzy nie deklarują żadnych konfliktów interesów.
Praca ta została wsparta przez Narodowe Fundusz Nauki Przyrodniczej Chin (nr 82004031), Prowincjonalną Administrację Tradycyjnej Medycyny Chińskiej w Syczuanie w ramach projektu badawczego (nr 2024MS566) oraz Narodowy Kluczowy Program Badań i Rozwoju Chin (nr 2023YFC3504402).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Enhanced chemiluminescence reagent D20A2:D21A2:D22A2:D23A2: D24A2:D25A2:D26A2:D27A2:D28A2: D29A2:D30A2:D29 | Beyotime Biotechnology Co., Ltd | P90720 | luminescent signal detection |
| Horseradish peroxidase (HRP)-conjugated secondary antibodies | Signalway Antibody (Nanjing) | L30118 | specifically binds to the primary antibody |
| p65 primary antibody | Bioworld | BS4139 | specifically recognizes NF-κB p65 subunit protein |
| Spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | NanoDrop 2000 | SCR_018042 |
| 0.45 μM Ployvinylidence fluoride membrane | Millipore | PR05509 | adsorb protein molecules |
| 1β-hydroxyl-5α-chloro-8-epi-xanthatin | Chengdu Institute of Biology | natural monomeric compounds | |
| All-in-One cDNA Synthesis SuperMix | Bimake (Shanghai) | B24408 | reverse-transcribe |
| BAY11-7082 | Beyotime Biotechnology Co., Ltd | SF0011 | IκB/IKK inhibitor |
| Bcl2 antibody | Signalway Antibody (Nanjing) | 32012 | AB_3751037 |
| Bicinchoninic Acid (BCA) kit | Beyotime Biotechnology Co., Ltd | P0010S | total protein quantification |
| CCK-8 agent | Beyotime Biotechnology Co., Ltd | C0038 | cell viability measurement |
| Chemiluminescence detection system | Millipore, Bedford, USA | P90720 | acquire and process luminesence signals |
| COX-2 antibody | Signalway Antibody (Nanjing) | 33345 | AB_3676692 |
| DMSO | Sangon Biotech(Shanghai)Co.,Ltd. | A100231-0500 | solubilize compounds |
| GAPDH antibody | Signalway Antibody (Nanjing) | 41549 | AB_3751036 |
| Gel Imaging Instrument | E-BLOT | Touch Imager Pro | image acquisition and analysis |
| Gradient PCR instrument | Biometra TADVANCED | Biometra Tadvanced 96SG | gradient annealing temperature |
| Griess agent | Beyotime Biotechnology Co., Ltd | S0021S | NO quantification |
| Human cervical carcinoma HeLa cells | The Cell Bank of Chinese Academy of Sciences | SCSP-504 | Human-derived cells |
| Human TNF-α | Novus Biologicals | 210-TA | pro-inflammatory cytokines |
| iNOS antibody | Signalway Antibody (Nanjing) | 48309 | AB_2943634 |
| Laser Confocal Inverted Microscope | Olympus | FV1000 | SCR_016840 |
| LPS ( E.coli 055:B5) | Sigma-Aldrich (Shanghai) Trading Co., Ltd | L6529 | establish inflammatory models |
| Murine macrophage RAW264.7 cells | The Cell Bank of Chinese Academy of Sciences | SCSP-5036 | Mouse-derived cells |
| Nuclear and Cytoplasmic Protein Extraction Kit | Beyotime Biotechnology Co., Ltd | P0027 | separate cytoplasmic and nuclear proteins |
| PD98059 | Selleck Chemicals (Shanghai) | S1177 | MEK inhibitor |
| P-ERK (Thr202/Thr185) antibody | Signalway Antibody (Nanjing) | 12548 | detect the phosphorylation level of ERK protein |
| p-IKKα/β (Ser176/Ser177) antibody | Signalway Antibody (Nanjing) | 11931 | AB_3751034 |
| p-IκBα (phospho-Ser32)antibody | Signalway Antibody (Nanjing) | 13776 | AB_3751033 |
| p-JNK (T183/T221) antibody | Signalway Antibody (Nanjing) | 13371 | AB_3718662 |
| p-p38 MAPK (Thr180) antibody | Signalway Antibody (Nanjing) | 11581 | AB_3751032 |
| Prostaglandin E2 Parameter Assay Kit | R&D Systems | KGE004B | AB_2894942 |
| PS1145 | Selleck Chemicals (Shanghai) | S7691 | specific IKK inhibitor |
| Rapid SDS-PAGE Gel Preparation Kit | Beyotime Biotechnology Co., Ltd | P0018S | protein separation |
| Real-Time PCR System | Bio-Rad | CFX96 | SCR_018064 |
| RIPA buffer | Bimake (Shanghai) | P0013C | cell lysis |
| SB203580 | Selleck Chemicals (Shanghai) | S1076 | p38 MAPK inhibitor |
| SP600125 | Selleck Chemicals (Shanghai) | S1460 | JNK inhibitor |
| SYBR Green | Bimake (Shanghai) | B21202 | For real-time quantitative |
| TRITC-conjugated goat anti-mouse IgG | Beyotime Biotechnology Co., Ltd | A0568 | AB_2893016 |
| TRITC-conjugated second antibody | Beijing Baiao Leibo Technology Co., Ltd. | ZN1992 | AB_3751143 |
| TRIzol Reagent | Invitrogen | 15596026 | total RNA isolation |
| Vinculin antibody | Signalway Antibody (Nanjing) | 41534 | AB_3751035 |