Wieloośrodkowa cytometria przepływowa dla ostrej białaczki szpikowej z wykrywalną chorobą rezydualną z LAIP/DfN oraz populacjami wzbogaconymi w komórki macierzyste białaczki CD34+CD38-

Podsumowanie

Ten protokół opisuje wieloośrodkowy przepływ przepływomierza cytometrii do ilościowego określania pozostałej choroby ostrej białaczki szpikowej przy użyciu analizy immunofenotypowej związanej z białaczką/różnej od normy (LAIP/DfN) oraz fenotypowo określonych populacji wzbogaconych w komórki macierzyste białaczki CD34⁺CD38⁻.

Streszczenie

Obserwacja pozostałej choroby (MRD) jest zalecana w celu oceny odpowiedzi na leczenie w badaniach klinicznych dotyczących ostrej białaczki szpikowej (AML) zgodnie z wytycznymi ELN 2025. Celem tego badania było wdrożenie standaryzowanej obserwacji pacjentów za pomocą zharmonizowanego podejścia flow cytometrycznego dotyczącego pozostałej choroby w 30 francuskich laboratoriach hematologicznych uczestniczących w badaniach klinicznych dotyczących AML. Aby uzyskać porównywalne wyniki, sieć ustanowiła zalecenia od procedur laboratoryjnych do raportów klinicznych. Zaprojektowaliśmy panel 3-rurkowy z obowiązkowymi 8-kolorowymi wspólnymi markerami na rurkę, zgodnie z zaleceniami ELN, aby zidentyfikować wzory immunofenotypowe/odbiegające od normy (LAIP/DfN) związane z białaczką w masie komórek i populacjach wzbogaconych w komórki macierzyste białaczki (LSC) w frakcji CD34⁺CD38⁻ . Zastosowano bazę CD34/CD38/CD45/CD117, uzupełnioną markerami linii komórkowych dla pierwszej рубки, markerami związanymi z LSC dla drugiej рубки i markerami monocytarnymi oraz różnicowania dla trzeciej рубки. Panel ten może być stosowany w formatach 8-, 10- i 12-kolorowych i implementowany na wielu konwencjonalnych platformach cytometrów przepływowych. Proponujemy ustawienia cytometru przepływowego dostosowane do każdej platformy.

Harmonizacja czułości między czterema platformami została przeprowadzona za pomocą 8-szczytowych tęczowych kul. Barwienie immunologiczne wykonano po lizacji masy. Aby wykryć różnice między platformami, indeks barwienia został przetestowany przy użyciu świeżych próbek zdrową szpiku kostnego równolegle na czterech platformach. Regularne próbki kontrolne jakości szpiku kostnego były udostępniane laboratoriom do przeprowadzenia mokrego zewnętrznego oceny jakości (EQA), aby zweryfikować wszystkie kroki protokołu. Wreszcie standardyzacja strategii analizy danych uzyskanych w centrach została oceniona za pomocą suchego EQA poprzez udostępnienie plików danych FCS MRD. Wykonalność tego wieloośrodkowego podejścia wymaga harmonizacji wrażliwości instrumentów i przygotowania próbek, a także szkolenia i systematycznej edukacji operatorów analitycznych.

Wprowadzenie

Choroba resztkowa wykrywalna (MRD) odnosi się do niewielkiej liczby komórek białaczkowych, które utrzymują się w trakcie lub po leczeniu i są niewykrywalne metodami morfologicznymi, szczególnie w przypadku pełnej remisji z mniej niż 5% blastów w rdzeniu kostnym. Monitorowanie MRD jest zalecane do oceny odpowiedzi na leczenie w klinicznych badaniach dotyczących ostrej białaczki szpikowej (AML) zgodnie z wytycznymi ELN 2025¹. Oprócz metod biologii molekularnej, w tym odwrotnej transkryptazy PCR (RT-qPCR) i sekwencjonowania nowej generacji (NGS), często stosowanym podejściem jest wieloparametrowa cytometria przepływowa (MFC)².

Aby uzyskać spójne wyniki MRD, szczególnie w badaniach klinicznych, istnieją dwie możliwe strategie: centralizacja pomiaru MRD w jednym laboratorium lub wdrożenie protokołu, który zapewnia odtwarzalność między różnymi laboratoriami zaangażowanymi w oznaczanie MRD. Liczba próbek, wielkość badania i zdolność laboratoriów do przetwarzania większych lub mniejszych objętości próbek mogą wpłynąć na wybór między tymi strategiami. Jeśli wybrana zostanie wieloośrodkowa strategia, należy wziąć pod uwagę różnice między platformami cytometrów i potrzebę porównywalnej analizy w różnych miejscach.

W tym celu opisujemy znormalizowany wieloośrodkowy i wieloplatformowy podejście do MRD za pomocą cytometrii przepływowej łączący analizę immunofenotypów związanych z białaczką/odmiennych od normalnych (LAIP/DfN) oraz fenotypowo zdefiniowaną wykrywalność komórek macierzystych białaczki (LSC) wzbogaconych w CD34⁺CD38⁻, wdrożone w 30 francuskich laboratoriach hematologicznych na podstawie zaleceń ELN i wcześniejszych raportów^3,4.

Cytometria przepływowa pozwala na zdefiniowanie, w momencie diagnozy, "podpisu" białaczki, który obejmuje specyficzne występowanie markerów na blastach pacjenta: LAIP. Po leczeniu, MRD przepływowy pozwala na monitorowanie LAIP zidentyfikowanych w momencie diagnozy. Ponieważ blasty białaczkowe mogą ewoluować i modyfikować swój immunofenotyp pod wpływem leczenia, należy systematycznie wdrożyć drugą strategię: podejście DfN, które opiera się na identyfikacji komórek o cechach, które różnią się od normalnej hemopoezy. Technika ta może również wykryć pojawienie się nowych markerów na blastach w trakcie przebiegu choroby i jej leczenia.

W francuskiej grupie badań przepływowych AML, projekt panelu opierał się na wcześniej opublikowanym badaniu HOVON dotyczącym definicji wzorców komórek białaczkowych. Nie ma uniwersalnego markera LSC lub LAIP, dlatego zaprojektowaliśmy trzyrurowy panel umożliwiający jednoczesne identyfikowanie LAIP, DfN oraz populacji LSC wzbogaconych w CD34⁺CD38⁻. Wszystkie rury zawierały bazę na CD34/CD38/CD45/CD117, uzupełnioną markerami pochodzenia w pierwszej rurze, markerami związanymi z LSC w drugiej rurze oraz markerami pochodzenia monocytowego lub różnicowania w trzeciej rurze, aby uzupełnić definicję LAIP w AML z blastami monocytowymi. Wszystkie trzy rury są pobierane w momencie diagnozy i w próbkach kontrolnych.

Biorąc pod uwagę patofizjologię leukemogenezy, uwaga przesunęła się od badania masy blastów do identyfikacji najmniej dojrzałych frakcji jako populacji wzbogaconych w komórki macierzyste białaczki. Dick i współpracownicy wykazali heterogeniczność białaczki, opisując CD34⁺CD38⁻ komórki LSC, które mają potencjał do wywoływania białaczki u myszy z niedoborem odporności^5,6. W kwestii ilościowego określania LSC w momencie diagnozy i kontroli, podejmowane są wysiłki w celu standaryzacji paneli przeciwciał i strategii analizy w ramach grupy roboczej ELN DAVID^1,7. Obecnie dwa panele, HOVON i ALFA, wykorzystują dichotomiczne markery LSC do odróżnienia populacji wzbogaconych w LSC od normalnych komórek macierzystych krwiotwórczych w przestrzeni CD34⁺CD38^−8,9.

Opisana tutaj metoda łączy znormalizowaną preparację próbek, wspólny projekt panelu przeciwciał, ustawienia czułości dostosowane do platformy, analizę LAIP/DfN i LSC wzbogaconych w CD34⁺CD38⁻, zewnętrzną ocenę jakości oraz zharmonizowane raportowanie kliniczne dla wieloośrodkowego monitorowania MRD przepływowego w AML.

Protokół

Protokół przestrzega zaleceń i wytycznych komitetów etycznych francuskich szpitali uniwersyteckich. Wszyscy pacjenci podpisali pisemną zgodę świadomie i dobrowolnie zgodnie z francuskim prawodawstwem. Protokół badania został zatwierdzony przez Komitet Etyczny CHU Lyon oraz Komitet Etyczny Instytutu Przeglądu Instytucjonalnego CHU Lille zgodnie z Deklaracją Helsińskiej (HDF-AML observatory, CNIL 2214454v0). W przypadku allogennego przeszczepu, dawców włączono do europejskiej bazy danych internetowej ProMISE i uzyskali pisemną zgodę na zbieranie ich danych osobowych. Wyodrębnianie i analiza danych przeprowadzano zgodnie z wymaganiami lokalnego Komitetu Etycznego (CNIL2093819). Wszystkie pliki FCS używane do przeglądu sieci zostały w pełni anonimizowane za pomocą skryptu Python.

1. Ustawienia cytometru

1. Określ wartości docelowe dostosowane do każdego cytometru za pomocą 8-szczytowych tęczowych kul.
2. Ustaw każdą maszynę zgodnie z wartościami docelowymi przedstawionymi w Tabeli 1. Upewnij się, że każdy kanał osiąga wartość docelową ± 5%. Weryfikuj to ustawienie systematycznie, aby zachować ciągłą wrażliwość każdej platformy.
3. Ustal macierz kompensacji za pomocą pojedynczych wybarwionych probówek dla każdego przeciwciała, używając kul kompensacujących i/lub komórek zgodnie z każdą platformą.
4. Zapisz ustawienie i macierz kompensację jako test lub protokół zidentyfikowany jako MRD LAIP/DfN, LSC i MonoGran (T1, T2, T3). Użyj tego testu lub protokołu do nabywania danych dla ilościowego wyznaczania MRD AML w przeglądzie przepływowym.

2. Procedura laboratoryjna

1. Aspirator szpiku kostnego
   1. Zbierz 1-2 mL EDTA szpiku kostnego w momencie rozpoznania oraz w punktach kontrolnych, w tym MRD1, MRD2, MRD3, MRD4 i nawrotu.
   2. Wyślij probówki do referencyjnego laboratorium przepływowego w ciągu 24-48 godzin.
2. Przygotowanie wymazów szpiku kostnego do badania morfologicznego
   1. Umieść kroplę aspiratu szpiku kostnego na szklanej szklance. Delikatnie rozprowadź próbkę za pomocą szkiełka okrywającego lub innej szklanej szklanki.
   2. Po 30 minutach suszenia wybarwić wymaz May-Grünwald-Giemsa (Dodatek 1).
3. Lizys masowa
   1. Dodaj 15 mL roztworu lizująco-amonochlorkowego amonu do 1-2 mL próbki szpiku kostnego. Delikatnie wymieszaj i inkubatyuj przez 10 minut w temperaturze pokojowej.
   2. Centryfuguj przez 5 minut w temperaturze pokojowej z prędkością 450 × g i wyrzuć nadstan.
   3. Resuspenduj pelet komórkowy w 10 mL PBS/0,1% BSA. Cenryfuguj z prędkością 450 × g w temperaturze pokojowej przez 5 minut i wyrzuć nadstan.
   4. Resuspenduj pelet komórkowy w koncentracji 30 × 10⁶ WBC/mL w PBS.
4. Imunobarwienie zawiesiny komórkowej
   1. Rozprowadź przeciwciała monoklonalne w probówkach T1, T2 i T3 zgodnie z platformą (Tabela 2). Podaj klony, objętości, referencje katalogowe i dostawców dla każdego przeciwciała w tabeli przeciwciał.
      UWAGA: Dla każdej probówki używającej jaskrawo fluoryzowanych barwników, użyj buforu barwników przed dodaniem przeciwciał.
   2. Dodaj 2-3 ×10⁶ lizowanych komórek na probówkę w 100 µL zawiesiny komórkowej. Inkubatyuj komórki z przeciwciałami przez 15 minut w ciemności w temperaturze pokojowej.
   3. Przepłucz komórki 3 mL PBS. Cenryfuguj przez 5 minut z prędkością 450 × g i wyrzuć nadstan.
   4. Resuspenduj wybarwione komórki w 300 µL PBS.
      UWAGA: Można używać wstępnie zmieszanych koktajli przeciwciał lub walidowanych suchych tub przeciwciał.

3. Nabywanie danych cytometru przepływowego

1. Otwórz test MRD lub protokół nabywania z dostosowanymi ustawieniami i macierzą kompensację dla pomiaru MRD LAIP/DfN i LSC.
2. Zdobądź minimum 500 000 do 1 000 000 WBC w każdej probówce w momencie rozpoznania i w próbkach kontrolnych MRD, aby poprawić grupowanie komórek MRD i pewność niskich poziomów MRD.
   UWAGA: Dla pomiaru LSC uzyskaj minimum 1 000 000 WBC w probówce 2, aby uzyskać odpowiednią wrażliwość dla ilościowego wyznaczania LSC (LOQ 0,002% i LOD 0,001%)^10,11.
3. Zapisz pliki danych FCS z próbek diagnostycznych i MRD. Zapisz datę nabywania i identyfikator pacjenta, aby

Wyniki

Lustrzane odbicie platformy

W celu wstępnego porównania dwóch platform, CANTO i NAVIOS, ustawienia napięcia dostosowano poprzez akwizycję niekompensowanych kuleczek tęczowych 8-peak w celu osiągnięcia zdefiniowanych docelowych wartości MFI. Wartości docelowe z referencyjnej platformy CANTO przeniesiono na drugą platformę NAVIOS, stosując następującą konwersję: nowa wartość docelowa MFI = referencyjna wartość docelowa MFI/256²². Aby wykryć różnice między platformami, równolegle przebadano 10 świeżych próbek regeneracyjnego szpiku kostnego w EDTA. Indeks barwienia między populacjami pozytywnymi a negatywnymi porównano pomiędzy próbkami i platformami, co wykazało porównywalną separację (Supplemental File-Figure S3).

W trakcie badania platformy były stopniowo aktualizowane z konfiguracji 8- i 10-kolorowych na konfiguracje LYRIC oraz DxFLEX 12- i 13-kolorowe (Supplemental File 1). Odzwierciedlenie (mirroring) rozszerzono na cztery platformy, wykorzystując 8-szczytowe koraliki tęczowe (rainbow beads) oraz barwiony zdrowy szpik kostny pobrany z użyciem tego samego panelu. Nakładanie się szczytów sprawdzono poprzez regulację wyłącznie logarytmicznych skal reprezentacji. Po zastosowaniu zdefiniowanych ustawień wzorce barwienia komórek pokrywały się, a główną różnicą było przesunięcie chmur komórkowych wzdłuż skal logarytmicznych (Figure 6 oraz Supplemental File-Figure S4 and Figure S5).

Ocena jakości i powtarzalność pomiędzy laboratoriami cytometrii przepływowej

Po wdrożeniu początkowej standardowej procedury operacyjnej oraz jej aktualizacji podczas modernizacji platformy, regularnie przeprowadzano zewnętrzną ocenę jakości (EQA) na świeżych próbkach referencyjnych szpiku kostnego, udostępnianych między uczestniczącymi ośrodkami. EQA służyła do weryfikacji procedur laboratoryjnych, ustawień platformy oraz wspólnej strategii analizy bramkowania. Raportowane populacje obejmowały komórki MNC CD34⁺ w mianowniku WBC CD45⁺ oraz komórki P6 CD34⁺CD38⁻ w mianowniku WBC CD45⁺. Wyniki analizowano za pomocą wskaźnika z-score i/lub reprezentacji graficznej (Rycina 7).

Od 2017 roku przeprowadzono pięć serii zewnętrznej oceny jakości (EQA) typu „wet”, w których uczestniczyło odpowiednio 22, 15, 17, 26 i 25 laboratoriów. Dla % komórek CD34⁺CD38⁻ w WBC CD45⁺ oraz % komórek MNC CD34⁺ w WBC CD45⁺ wyniki były następujące: EQA1, wartości średnie 0,015% i 1,01% (SD 0,09% i 0,24%); EQA2, 0,09% i 1,02% (SD 0,046% i 0,36%); EQA3, 0,097% i 1,46% (SD 0,024% i 0,32%); EQA4, 0,024% i 2,16% (SD 0,015% i 0,59%); oraz EQA5, 0,027% i 1,9% (SD 0,008% i 0,45%).

Aby zapewnić standaryzację strategii analizy MRD w różnych ośrodkach, mokra kontrola jakości zewnętrznej (EQA) została uzupełniona o suchą EQA z wykorzystaniem wspólnych plików FCS do diagnostyki, monitorowania MRD oraz badania referencyjnego szpiku kostnego. Ponad 90% lokalnie analizowanych danych mieściło się w scentralizowanym przedziale opartym na średniej z serii ± 2 SD: 95,6% i 91,3% dla DryEQA2017, przy udziale 22 z 23 laboratoriów, oraz 100% dla DryEQA2024, przy udziale 24 z 25 laboratoriów (Rycina 8). Przeprowadzono dwie rundy suchej EQA dla %MRD LAIP w WBC CD45⁺ oraz %MRD LSC CD34⁺CD38⁻ w WBC CD45⁺. DryEQA2017 wykazała średnią wartość LAIP wynoszącą 11,9% (SD 1,35%) i średnią wartość LSC wynoszącą 0,16% (SD 0,05%). DryEQA2024 wykazała średnią wartość MRD LAIP wynoszącą 0,35% (SD 0,26%) i średnią wartość MRD LSC CD34⁺CD38⁻ wynoszącą 0,18% (SD 0,06%).

Przykład multimodalnego pomiaru MRD w AML metodą cytometrii przepływowej z wykorzystaniem strategii LAIP/DfN oraz LSC

W celu ilościowego oznaczenia MRD systematycznie zastosowano trzy podejścia. Pierwsze podejście polegało na opracowaniu kartografii LAIP blastów białaczkowych w momencie diagnozy z wykorzystaniem bramowania Booleanowskiego, a następnie zastosowano tę kartografię do analizy próbek szpiku kostnego pobranych podczas obserwacji (Rysunek 9A). Drugie podejście wykorzystywało analizę DfN do identyfikacji nieprawidłowych komórek o atypowych wzorcach ekspresji, których nie zaobserwowano w obszarach „pustych okien” zdefiniowanych na podstawie prawidłowego różnicowania mieloidalnego (Rysunek 9B). Trzecie podejście służyło do ilościowego oznaczenia komórek wzbogaconych w LSC we frakcji CD34⁺CD38⁻ przy użyciu dychotomicznych markerów LSC oraz bramowania Booleanowskiego (Rysunek 10).

Referencyjne próbki szpiku kostnego

Zbadano łącznie 135 referencyjnych próbek szpiku kostnego, w tym 25 próbek szpiku od zdrowych dawców, 34 próbek szpiku w stanie zapalnym oraz 76 próbek szpiku w fazie regeneracji. Szpik od zdrowych dawców pobrano od ochotników, których mediana wieku wynosiła 31 lat (zakres 21–49 lat). Szpik w stanie zapalnym pobrano od pacjentów skierowanych z powodu cytopenii, w tym anemii, neutropenii lub trombocytopenii, u których aspiraty szpiku nie wykazały nowotworu hematologicznego; mediana wieku wynosiła 52 lata (zakres 25–82 lata). Szpik w fazie regeneracji pobrano podczas obserwacji po leczeniu AML w różnych punktach czasowych chemioterapii, w tym po indukcji lub konsolidacji, przy ujemnym wyniku oceny molekularnej MRD dla transkryptów NPM1 lub CBF; mediana wieku wynosiła 54 lata (zakres 18–65 lat).

Jakość tych próbek została potwierdzona badaniem mikroskopowym. Obliczono również oczekiwany teoretyczny procent komórek CD34⁺ w nierozcieńczonych próbkach szpiku kostnego przy użyciu wzoru Brooimansa, a wyniki wyniosły >90% dla wszystkich próbek. Próbki te wykorzystano do ustalenia progów dla analizy LAIP/DfN oraz LSC, a także do obliczenia wzoru na hemodylucję i czystość. Zmienność MFI ekspresji markerów w zależności od stanu szpiku kostnego zbadano dla próbek szpiku od zdrowych dawców, szpiku zapalnego oraz regenerującego się (Supplemental File-Figure S6). Wyznaczono wartości referencyjne dla najważniejszych parametrów, w tym %MNC CD34⁺ z WBC, %P6 CD34⁺CD38⁻ w MNC CD34⁺, %P7 CD34⁺CD38^dim w MNC CD34⁺ oraz %P8 CD34⁺CD38^high w MNC CD34⁺ (Supplemental File-Figure S6).

Ocena czułości i liniowości

Czułość oceniono dla bramkowania specyficznego dla LAIP/DfN oraz LSC poprzez pomiar liczby zdarzeń nieprawidłowych w zestawie referencyjnych próbek szpiku kostnego, obejmującym szpik regenerujący, zapalny oraz szpik od zdrowego dawcy. W celu weryfikacji granicy oznaczalności oraz liniowości pomiaru MRD zastosowano seryjne rozcieńczenia znanej liczby blastów w zdrowym szpiku kostnym (Rysunek 11 oraz Rysunek 12).

Rycina 1: Strategia bramkowania dla analizy MRD LAIP w AML z wykorzystaniem markerów prymitywnych (CD34⁺/CD117⁺) w probówce 1. Pierwszy rząd: sekwencyjne bramkowanie czasu, żywych komórek na podstawie FSC względem SSC, pojedynczych komórek na podstawie FSC-W względem FSC-H, leukocytów WBC CD45⁺ na wykresie CD45 względem SSC, blastów na CD45^dim/SSC, komórek mononuklearnych (MNC) na FSC-A/SSC-A, komórek MNC CD34⁺ na wykresie CD45 względem CD34 oraz bramki markerów prymitywnych na wykresie CD34 względem CD117. Drugi i trzeci rząd: stałe biparametryczne wykresy kropkowe użyte do zdefiniowania najbardziej istotnych bramek LAIP (LAIP1–LAIP8). MRD LAIP zdefiniowano przy użyciu następującej strategii Boole'a: czas ORAZ żywe komórki ORAZ pojedyncze komórki ORAZ (blasty LUB MNC CD34⁺) ORAZ markery prymitywne (CD34^+/−CD117^+/−) ORAZ LAIP1 ORAZ LAIP2 ORAZ LAIP3 ORAZ LAIP4 ORAZ LAIP5 ORAZ LAIP6 ORAZ LAIP7 ORAZ LAIP8. W przedstawionym przypadku MRD stanowiło 6,8% WBC CD45⁺, w porównaniu do 0,04% ± 0,03 w zdrowym szpiku kostnym. Po prawej: back-gating końcowej bramki MRD użytej do kwantyfikacji, umożliwiający usunięcie zdarzeń nieswoistych, erytroblastów i debris. Skróty: AML = ostra białaczka szpikowa; MRD = mierzalna choroba resztkowa; LAIP = immunofenotyp związany z białaczką; FSC = rozproszenie przednie; SSC = rozproszenie boczne; WBC = białe krwinki (leukocyty); MNC = komórki mononuklearne; hBM = zdrowy szpik kostny. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.

Rysunek 2: Strategia bramkowania dla analizy MRD LAIP w AML z wykorzystaniem dojrzałych blastów (CD34⁻CD117⁻) w probówce 3. Pierwszy rząd: sekwencyjne bramkowanie czasu, żywych komórek na podstawie FSC względem SSC, pojedynczych komórek na podstawie FSC-W względem FSC-H, komórek WBC CD45⁺ na wykresie CD45 względem SSC, blastów na CD45^dim/SSC, komórek mononuklearnych (MNC) na FSC-A/SSC-A, komórek MNC CD34⁺ na wykresie CD45 względem CD34 oraz bramki dojrzałych blastów na wykresie CD34 względem CD117.
Drugi i trzeci rząd: stałe biparametryczne wykresy kropkowe użyte do zdefiniowania najistotniejszych bramek LAIP (LAIP1–LAIP8). MRD LAIP zdefiniowano przy użyciu następującej strategii Boole'a: czas ORAZ żywe komórki ORAZ pojedyncze komórki ORAZ blasty ORAZ blasty CD34⁻CD117⁻ ORAZ LAIP1 ORAZ LAIP2 ORAZ LAIP3 ORAZ LAIP4 ORAZ LAIP5 ORAZ LAIP6 ORAZ LAIP7 ORAZ LAIP8. W przedstawionym przypadku MRD wynosiło 15% WBC CD45⁺, w porównaniu do 0,09% ± 0,02 w zdrowym szpiku kostnym.
Prawo: back-gating końcowej bramki MRD użytej do ilościowego oznaczenia, umożliwiający usunięcie zdarzeń nieswoistych. Skróty: AML = ostra białaczka szpikowa; MRD = mierzalna choroba resztkowa; LAIP = immunofenotyp związany z białaczką; FSC = rozproszenie przednie; SSC = rozproszenie boczne; WBC = białe krwinki; MNC = komórki mononuklearne; hBM = zdrowy szpik kostny. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.

Rysunek 3: Strategia bramkowania dla prawidłowych hematopoetycznych komórek macierzystych (nHSCs) oraz komórek wzbogaconych w leukemiczne komórki macierzyste (LSC) we frakcji CD34⁺CD38⁻ (probówka 2). (A) Prawidłowe hematopoetyczne komórki macierzyste (nHSCs) oraz (B) komórki wzbogacone w leukemiczne komórki macierzyste (LSC) we frakcji CD34⁺CD38⁻ (probówka 2). Pierwszy rząd: sekwencyjne bramkowanie czasu, żywych komórek na podstawie FSC względem SSC, pojedynczych komórek na podstawie FSC-W względem FSC-H, komórek WBC CD45⁺ na wykresie CD45 względem SSC, blastów na CD45dim/SSC, komórek mononuklearnych (MNC) na FSC-A/SSC-A oraz komórek MNC CD34⁺ na wykresie CD45 względem CD34.
Drugi do czwartego rzędu: stałe biparametryczne wykresy kropkowe użyte do zdefiniowania P6 (CD34⁺CD38⁻), P7 (CD34⁺CD38^low) i P8 (CD34⁺CD38^high), wraz z najbardziej istotnymi dychotomicznymi markerami LSC, w tym MIX (CLL1/TIM3/CD97), CD123 i CD45RA. MRD LSC zdefiniowano przy użyciu następującej strategii logicznej (Boolean): czas AND żywe komórki AND pojedyncze komórki AND blasty AND MNC AND MNC CD34+ AND P6 AND (P6 LSC MIX⁺ OR P6 LSC CD123⁺ OR P6 LSC CD45RA⁺).
Po prawej: back-gating końcowej bramki MRD LSC użytej do kwantyfikacji, umożliwiający usunięcie zdarzeń nieswoistych.
(A) nHSCs w próbce zdrowego szpiku kostnego: nHSCs (zdarzenia fioletowe) były CD34⁺CD38⁻, MIX⁻ (CLL1/TIM3/CD97), CD45RA⁻, CD123⁻, CD117⁺, HLA-DR⁺, CD36⁻ i CD90⁺. Frakcja nHSC CD34⁺CD38⁻ stanowiła 0,02% WBC CD45⁺, a komórki LSC CD34⁺CD38⁻ były ujemne. Zgłoszone progi analizy to LOQ 0,0001% i LOD 0,001%.
(B) Komórki wzbogacone w LSC w próbce AML: komórki wzbogacone w LSC (zdarzenia pomarańczowe) były CD34⁺CD38⁻, MIX⁺ (CLL1/TIM3/CD97), CD45RA⁺, CD123⁺, CD117⁺, HLA-DR⁺, CD36⁻ i CD90⁺. Frakcja LSC CD34⁺CD38⁻ stanowiła 3,7% WBC CD45⁺. Skróty: nHSCs = prawidłowe hematopoetyczne komórki macierzyste; LSC = leukemiczna komórka macierzysta; MNC = komórki mononuklearne; WBC = białe krwinki; SSC = rozproszenie boczne; MIX = CLL1/TIM3/CD97; HLA-DR = ludzki antygen leukocytarny-DR; LOQ = granica oznaczalności; LOD = granica wykrywalności. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Rycina 4: Wyznaczenie progu CD38⁻ w populacji CD34⁺ z wykorzystaniem kanału kontrolnego FMO (fluorescence-minus-one) dla CD38. Pierwszy rząd: bramkowanie populacji referencyjnych, w tym blastów na wykresie CD45/SSC, komórek MNC CD19⁺ oraz komórek MNC CD34⁺.
Drugi rząd: poziom sygnału w kanale FMO dla CD38. Pierwsza linia przedstawia blasty, druga linia komórki MNC CD19⁺, a trzecia linia komórki MNC CD34⁺. Pomarańczowa linia wskazuje próg definiujący bramkę P6 CD34⁺CD38⁻.
Trzeci rząd: poziom sygnału CD38 PE-Cy7. Pierwsza linia przedstawia blasty, druga linia komórki MNC CD19⁺ z poziomem hematogonów CD38 służącym do definicji P8 CD34⁺CD38^high, a trzecia linia komórki MNC CD34⁺, gdzie komórki P6 CD34⁺CD38⁻ zaznaczono na pomarańczowo, komórki P7 CD34⁺CD38^low na zielono, a komórki P8 CD34⁺CD38^high na niebiesko. Skróty: FMO = fluorescence minus one; MNC = komórki mononuklearne; SSC = rozproszenie boczne; PE-Cy7 = fykoerytryna-cyjanina 7; P6 = frakcja CD34+CD38−; P7 = frakcja CD34+CD38low; P8 = frakcja CD34+CD38high. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Rycina 5: Ocena reprezentatywności próbki szpiku kostnego na podstawie komórek MNC CD34⁺. (A) Strategia bramkowania dla komórek MNC CD34⁺ oraz parametry użyte do obliczeń według wzoru: n, liczba komórek MNC CD34⁺; L, liczba komórek WBC CD45⁺; s, proporcja komórek MNC CD34⁺ w prawidłowej krwi obwodowej; oraz m., proporcja komórek MNC CD34⁺ zaobserwowana w referencyjnym prawidłowym szpiku kostnym. (B) Schematyczne przedstawienie wpływu rozcieńczenia szpiku kostnego (BM) krwią obwodową (PB) na pochodzenie komórek CD34⁺ w próbkach BM. (C) Kryteria stosowane do interpretacji czystości BM. Skróty: BM = szpik kostny; PB = krew obwodowa; MNC = komórki mononuklearne; WBC = białe krwinki. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Rysunek 6: Porównanie wzorców ekspresji na czterech platformach cytometrycznych.
Normalną próbkę szpiku kostnego (BM) przebadano jednocześnie na czterech platformach cytometrycznych, stosując zdefiniowane ustawienia dla każdej platformy oraz korektę skali. Pierwszy wiersz przedstawia komórki MNC na wykresie kropkowym CD45/CD33; drugi wiersz przedstawia komórki MNC na wykresie kropkowym prymitywnych markerów CD34/CD117; trzeci wiersz przedstawia blasty na wykresie kropkowym CD34/CD38; a czwarty wiersz przedstawia komórki P6 CD34⁺CD38⁻ na wykresie kropkowym CD45RA/CD90. Skróty: BM = szpik kostny; MNC = komórki mononuklearne; P6 = frakcja CD34⁺CD38⁻. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Rysunek 7: Powtarzalność EQA w laboratorium (wet-lab) w uczestniczących laboratoriach cytometrii przepływowej. (A) Wykres skrzypcowy przedstawiający rozkład % komórek P6 CD34⁺CD38⁻ w komórkach WBC CD45⁺ w pięciu rundach EQA w laboratorium oraz w uczestniczących laboratoriach cytometrii przepływowej. (B) Wykres skrzypcowy przedstawiający rozkład % komórek MNC CD34⁺ w komórkach WBC CD45⁺ w pięciu rundach EQA w laboratorium oraz w uczestniczących laboratoriach cytometrii przepływowej. Skróty: EQA = zewnętrzna ocena jakości; P6 = frakcja CD34+CD38−; WBC = białe krwinki; MNC = komórki mononuklearne. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.

Rycina 8: Ocena Dry EQA w pomiarze LAIP/DfN oraz MRD LSC. (A) Ćwiczenie Dry EQA2017 dla pomiaru LAIP/DfN i MRD LSC z wykorzystaniem sześciu udostępnionych plików FCS z grupy paneli 8-kolorowych, obejmujących pliki diagnostyki AML, MRD AML oraz referencyjne pliki normalnego szpiku kostnego dla analizy LAIP w probówce 1 i LSC w probówce 2. Ćwiczenie zostało udostępnione 23 uczestniczącym laboratoriom. (B) Ćwiczenie Dry EQA2024 dla pomiaru LAIP/DfN i MRD LSC z wykorzystaniem sześciu udostępnionych plików FCS z grupy paneli 12-kolorowych, obejmujących pliki diagnostyki AML, MRD AML oraz referencyjne pliki normalnego szpiku kostnego dla analizy LAIP w probówce 1 i LSC w probówce 2. Ćwiczenie zostało udostępnione 24 uczestniczącym laboratoriom. (C) Porównanie międzyplatformowe % komórek MNC CD34⁺ oraz % komórek nHSC P6 CD34⁺CD38⁻ w komórkach WBC CD45⁺ zmierzonych podczas Wet EQA2025, udostępnione 25 uczestniczącym laboratoriom. Wartości oczekiwane wynosiły 1,6% dla komórek MNC CD34⁺ oraz 0,02% dla komórek nHSC P6 CD34⁺CD38⁻. Skróty: EQA = zewnętrzna ocena jakości; LAIP = immunofenotyp związany z białaczką; DfN = różniący się od normy; LSC = białaczkowa komórka macierzysta; MRD = mierzalna choroba resztkowa; FCS = standard cytometrii przepływowej; AML = ostra białaczka szpikowa; MNC = komórki mononuklearne; nHSC = normalna hematopoetyczna komórka macierzysta; WBC = białe krwinki. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Rysunek 9: Reprezentatywny pomiar MRD z zastosowaniem podejść LAIP/DfN. (A) Przykład pomiaru MRD z wykorzystaniem metody LAIP/DfN. Po lewej stronie przedstawiono kartografię LAIP komórek białaczkowych w próbce diagnostycznej, a po prawej stronie zastosowanie tej samej kartografii LAIP do próbki kontrolnej, gdzie populacja MRD zaznaczona jest kolorem czarnym. (B) Przykład pomiaru MRD z wykorzystaniem metody DfN. Każda para wykresów kropkowych porównuje zdrowy szpik kostny (hBM; norma, wykres lewy) z próbką szpiku kostnego z kontroli MRD (DfN, wykres prawy). Obszar „pustego okna” (empty box) definiuje się na podstawie normalnego szpiku kostnego, a następnie ocenia obecność komórek białaczkowych w tym oknie w próbce kontrolnej, przy czym populacja nieprawidłowa zaznaczona jest kolorem czarnym. Skróty: MRD = minimalna choroba resztkowa; LAIP = immunofenotyp związany z białaczką; DfN = odmienne od normy; hBM = zdrowy szpik kostny. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Rycina 10: Reprezentatywny pomiar komórek wzbogaconych w LSC CD34⁺CD38⁻ w momencie diagnozy i podczas obserwacji. (A) Przykład pomiaru komórek wzbogaconych w LSC w próbce diagnostycznej AML. Lewa strona przedstawia profil wzbogacony w LSC, w którym pomarańczowa populacja w obrębie frakcji CD34⁺CD38⁻ wykazuje ekspresję MIX (CLL1/TIM3/CD97), CD123, CD45RA, CD117, HLA-DR oraz CD36.
(B) Próbka z obserwacji tego samego pacjenta wykazująca obecność MRD komórek wzbogaconych w LSC o tym samym profilu immunofenotypowym (pomarańczowa populacja). Skróty: LSC = białaczkowa komórka macierzysta; AML = ostra białaczka szpikowa; MRD = mierzalna choroba resztkowa; MIX = CLL1/TIM3/CD97; HLA-DR = ludzki antygen leukocytarny DR. Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny.

Rycina 11: Czułość analityczna detekcji LSC. (A) Ocena granicy wykrywalności tła (LOB) dla detekcji LSC. Po lewej stronie przedstawiono ilościowe oznaczenie zdarzeń CD34⁺CD38⁻ w połączeniu pięciu plików FCS z pięciu próbek zdrowego szpiku kostnego (pozyskano 5 148 000 zdarzeń WBC). Po prawej stronie pokazano liczbę zdarzeń należących do bramki Boole'a dla LSC, przeniesioną wstecznie na wykres kropkowy CD45/SSC (14 zdarzeń), co odpowiada LOB na poziomie <0,0005% (5 × 10^-6). (B) Ocena liniowości dla kwantyfikacji LSC. Po lewej stronie przedstawiono rozcieńczenia seryjne poprzez dodanie komórek wzbogaconych w LSC do próbki zdrowego szpiku kostnego. Po prawej stronie pokazano korelację między zmierzonymi wartościami MRD a wartościami teoretycznymi, co odpowiada granicy oznaczalności (LOQ) wynoszącej 2 × 10^-5 (0,002%). Skróty: LSC = leukemiczna komórka macierzysta; LOB = granica wykrywalności tła; FCS = standard cytometrii przepływowej; WBC = białe krwinki; MRD = mierzalna choroba resztkowa; LOQ = granica oznaczalności. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.

Rycina 12: Liniowość i zakres kwantyfikacji pomiaru MRD LAIP. (A) Ocena liniowości kwantyfikacji MRD LAIP poprzez seryjne rozcieńczanie blastów o różnych LAIP w zdrowym szpiku kostnym, wykazująca korelację między zmierzonymi wartościami MRD a wartościami teoretycznymi, ze zmiennym LOQ w zależności od różnych LAIP oraz LOQ <0.1%. (B) Zakres kwantyfikacji w zależności od różnych LAIP. Czerwona linia oznacza próg kliniczny 0.1%. LOQ osiągnął próg kliniczny dla wszystkich badanych LAIP. Skróty: MRD = minimalna choroba resztkowa; LAIP = immunofenotyp związany z białaczką; LOQ = granica kwantyfikacji. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Fluoro chrom	Kolec	LYRIC12c	Szczyt	DxFlex13c	Pik	NAVIOS10c	Szczyt	CANTO8c
FITC	P8	44618	P6	89916	P7	104	P8	56316
PE	P8	84008	P6	110652	P7	136	P8	88803
detekcja elektrochemiczna	Proszę podać tekst źródłowy do tłumaczenia.	Proszę podać tekst źródłowy do przetłumaczenia.	P6	153011	P7	150	Proszę podać tekst źródłowy do tłumaczenia.	Proszę podać tekst źródłowy do tłumaczenia.
PerCPcy5,5 /PEcy5,5	P7	63610	P6	101791	P7	85	P7	75717
PC7/PEcy7	P8	32412	P6	21381	P8	88	P8	32003
APC	P7	111628	P6	192708	P6	181	P7	143946
AA700/AP CR700	P7	25958	P6	237374	P7	182	Proszę podać tekst źródłowy do tłumaczenia.	Proszę podać tekst źródłowy do przetłumaczenia.
A7A750/ APCH7	P8	77444	P6	158729	P7	150	P8	98311
BV421	P6	62031	P6	239208	P6	268	P6	68315
KO/V500	P7	159941	P6	293917	P6	179	P7	124919
BV605	P7	31688	P6	65337	Proszę podać tekst źródłowy do tłumaczenia.	Proszę podać tekst źródłowy do tłumaczenia.	Proszę podać tekst źródłowy do przetłumaczenia.	Proszę podać tekst źródłowy do przetłumaczenia.
BV711/ V660	P8	21816	P6	12107	Proszę podać tekst źródłowy do przetłumaczenia.	Proszę podać tekst źródłowy do przetłumaczenia.	Proszę podać tekst źródłowy do tłumaczenia.	Proszę podać tekst źródłowy do przetłumaczenia.
BV786	P8	17560	P6	3795	Proszę podać tekst źródłowy do przetłumaczenia.	Proszę podać tekst źródłowy do przetłumaczenia.	Proszę podać tekst źródłowy do tłumaczenia.	Proszę podać tekst źródłowy do przetłumaczenia.

Tabela 1: Wartości docelowe dla każdej platformy z wykorzystaniem kulek tęczowych 8-peak. Przedstawiono konkretne wartości docelowe dla każdej platformy cytometrycznej (Canto, Lyric, Navios, DxFlex). Wybrane piki są zbliżone do MFI obserwowanego dla blastów. Jest to szczególnie istotne w przypadku cytometrów opartych na PMT, gdzie intensywność sygnału nie wzrasta liniowo wraz ze zwiększaniem napięcia PMT. Z kolei w cytometrach opartych na APD intensywność sygnału wzrasta liniowo wraz z wzmocnieniem, co pozwala na wykorzystanie tego samego piku dla wszystkich detektorów, podczas gdy w cytometrach opartych na PMT dla każdego kanału wymagane są różne piki. Skróty: MFI = median fluorescence intensity; PMT = photomultiplier tube; APD = avalanche photodiode. Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.

CANTO 8C /NAVIOS 8c

FITC

PE

ECD

PerCPC y5,5

PECy7

APC

APC-R700 /AA700

APCH7

BV421

V500

BV605

BV711

BV786

Probetka 1 LAIP 8c

CD7 5 µL /CD56 5 µL

CD13 5 µL

CD33 10 µL

CD38 5 µL

CD34 5 µL

CD19 5 µL

CD117 5 µL

CD45 5 µL

Probetka 2 LSC 8c

CD90 5 µL

MIX3(2 0,5 µL/Ac)

CD123 5 µL

CD38 5 µL

CD34 5 µL

CD45RA 5 µL

CD117 5 µL

CD45 5 µL

T3 Supple komentarz Gran 8c

CD15 5 µL

CD56 5 µL

HLADR 10 µL

CD38 5 µL

CD34 5 µL

CD11b 5 µL

CD117 5 µL

CD45 5 µL

Suplementacja T3 całkowity - Monos 8c

CD36 5 µL

CD64 5 µL

CD14 10 µL

HLADR 5 µL

CD34 5 µL

CD4 5 µL

CD117 5 µL

CD45 5 µL

MIX3Ac =97 +TIM3+ CLL1

LYRIC 10-12c

FITC

PE

ECD

PerCPCy5,5

PECy7

APC

APC-R700

APCH7

BV421

V500

BV605

BV711

BV786

Probówka 1LAIP 12c

CD7 5 µL

CD13 5 µL

CD33 10 µL

CD38 5 µL

CD34 5 µL

HLADR (5 µL)

CD19 5 µL

CD117 5 µL

CD45 5 µL

CD56 5 µL

CD10 2 µL

CD36 2 µL

Probówka 2 LSC 12c

CD90 5 µL

MIX3(2. 5µL/Ac)

CD123 5 µL

CD38 5 µL

CD34 5 µL

HLADR (5 µL)

CD45RA 5 µL

CD117 5 µL

CD45 5 µL

CD200 5 µL

CD19 5 µL

CD36 2 µL

Suplement T3 komentarz 12c-Monos

CD15 5 µL

CD64 5 µL

CD33 10 µL

CD38 5 µL

CD34 5 µL

HLADR (5 µL)

CD4 5 µL

CD117 5 µL

CD45 5 µL

CD14 5 µL

CD11b 5 µL

CD36 2 µL

MIX3Ac =97+ TIM3+ CLL1

NAVIOS 10c

FITC

PE

ECD

PEcy5,5

PECy7

APC

AA700

AA750

BV421/PB

V500/KO

BV605

BV711

BV786

T1 Navios 10c

CD7 10 µL

CD13 10 µL

HLADR 5 µL

CD33 5 µL

CD38 5 µL

CD34 5 µL

CD56 10 µL

CD19 5 µL

CD117 5 µL

CD45 5 µL

T2 Navios 10c

CD90 5 µL

MIX3(2,5 µL/Ac)

CD19 5 µL

CD123 5 µL

CD38 5 µL

CD34 5 µL

CD36 5 µL

CD45RA 5 µL

CD117 5 µL

CD45 5 µL

T3 Supple komentarz 10c monocyty

CD15 5 µL

CD4 5 µL

HLADR 5 µL

CD33 5 µL

CD11b 5 µL

CD34 5 µL

CD36 5 µL

CD14 5 µL

CD117 5 µL

CD45 5 µL

MIX3Ac =97+ TIM3+ CLL1

DxFLEX 10 -12/13C

FITC

PE

ECD

PEcy5,5

PECy7

APC

AA700

AA750

BV421/PB

V500/KO

BV605

BV650

BV786

T1 DxFLEX 12-13c

CD7 10 µL

CD13 10 µL

HLADR 5 µL

CD33 5 µL

CD38 5 µL

CD34 5 µL

CD56 10 µL

CD19 5 µL

CD117 5 µL

CD45 5 µL

CD36 5 µL

CD10 2 µL

/

T2 DxFLEX 12-13c

CD90 5 µL

MIX3(2.5 µL/Ac)

CD19 5 µL

CD123 5 µL

CD38 5 µL

CD34 5 µL

CD36 5 µL

CD45RA 5 µL

CD117 5 µL

CD45 5 µL

/

CD200 5 µL

HLADR snv786 (3 µL)

T3 Supple Komentarz 12c Monos

CD15 5 µL

CD4 5 µL

HLADR 5 µL

CD33 5 µL

CD38 5 µL

CD34 5 µL

CD36 5 µL

CD14 5 µL

CD117 5 µL

CD45 5 µL

CD64 5 µL

CD11b 5 µL

/

Tabela 2: Konfiguracje paneli przeciwciał do analizy LAIP/DfN w MRD AML oraz analizy LSC. Tabela podsumowuje konfiguracje paneli 8-, 10-, 12- i 13-kolorowych w zależności od platformy cytometrycznej. Probówka 1 jest używana do analizy LAIP/DfN, probówka 2 do analizy komórek wzbogaconych w LSC CD34⁺CD38⁻, a probówka 3 do markerów różnicowania monocytowego/granulocytowego. Objętości przeciwciał i przypisania fluorochromów są przedstawione dla każdej platformy. MIX3 odpowiada CD97, TIM3 i CLL1. Skróty: AML = ostra białaczka szpikowa; MRD = mierzalna choroba resztkowa; LAIP = immunofenotyp związany z białaczką; DfN = odmienny od normy; LSC = białaczkowa komórka macierzysta; MIX3 = CD97/TIM3/CLL1. Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.

Całkowita utrata markerów zazwyczaj wyrażanych na prekursorach mieloidalnych

CD13++CD33-/CD34+ lub CD117+

CD13-CD33++/CD34+ lub CD117+

CD13+HLADR-/CD34+

CD13+CD117+CD34-

Ekspresja markerów limfoidalnych linii krzyżowej na prekursorach mieloidalnych

CD7+CD13+/CD34+ lub CD117+

CD7+CD33+/ CD34+ lub CD117+

CD56+CD13+/ CD34+ lub CD117+

CD56+CD33+/ CD34+ lub CD117+

CD19+CD117+/ lub CD13+ lub CD33+

Nadekspresja na prekursorach mieloidalnych

CD34++/CD117+

CD117++/CD13+CD33+

Zmniejszona ekspresja na prekursorach mieloidalnych

CD38loCD34+CD33+CD117+

Tabela 3: Definicje „pustych pól” DfN oparte na LAIP. W tabeli wymieniono zdefiniowane wzorce „pustych pól” różnych od normy (DfN), służące do identyfikacji nieprawidłowych populacji prekursorów mieloidalnych. Kategorie obejmują całkowitą utratę markerów zazwyczaj ekspresjonowanych, ekspresję markerów limfoidalnych w obrębie innej linii, nadekspresję markerów oraz zmniejszoną ekspresję markerów na prekursorach mieloidalnych. Skróty: LAIP = immunofenotyp związany z białaczką; DfN = różne od normy. Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.

Holdrinet i wsp.17
Broolmans i wsp.15
Czystość szpiku kostnego = (1 − (GRMO/GRSG) x (GBSG/GBMO)) x 100	>80%
Björlund i wsp.19	średnia ocen > 15%
	CD3 < 20%
Loken i wsp.18	CD16wysoki < 30%
Theunissen i wsp.20; Dworzak i wsp.21
Cytologia przepływowa lub z rozcieńczeniem kontrolnym: PNN < 40%, Ebl > 5%, Ly < 20%	CD16++ CD11b++ < 40%
	średnia ocen > 5%
	CD3 < 20%
czystość BM %: MNC 34+/WBC45+	czystość BM 100-10%

Tabela 4: Metody kontroli rozcieńczenia szpiku kostnego dla raportowania MRD w AML metodą przepływową. Tabela podsumowuje opublikowane metody kontroli rozcieńczenia i reprezentatywności szpiku kostnego, które mogą być stosowane w klinicznych raportach MRD w AML. W celu wsparcia interpretacji wyników MRD należy zastosować co najmniej jedną metodę kontroli rozcieńczenia. Podejście określające czystość szpiku kostnego CD34/WBC45⁺ zostało uwzględnione jako uzupełniająca ocena jakości. Skróty: AML = ostra białaczka szpikowa; MRD = mierzalna choroba resztkowa; BM = szpik kostny; WBC = białe krwinki; CD34/WBC45⁺ = komórki CD34⁺ wśród białych krwinek CD45⁺. Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.

Plik uzupełniający 1: Dodatkowe informacje wstępne, harmonizacja platform, referencyjny szpik kostny i materiały wspierające prognozowanie. Ten plik uzupełniający zawiera pomocnicze rysunki i tabele związane z identyfikacją LSC, heterogenicznością fenotypową AML, odzwierciedleniem międzyplatformowym, optymalizacją specyficzną dla platformy, profilami ekspresji markerów w referencyjnym szpiku kostnym, ewolucją paneli w czasie oraz progiem prognostycznym stosowanym do ilościowego oznaczania LSC w momencie diagnozy. Materiały te dostarczają dodatkowego kontekstu dla wieloośrodkowego schematu pracy cytometrii przepływowej MRD, w tym uzasadnienia dla oceny komórek wzbogaconych w LSC CD34⁺CD38⁻, podstaw technicznych harmonizacji platform oraz danych wspierających wykorzystanych do interpretacji tła referencyjnego szpiku, migracji paneli i wyboru progu klinicznego.Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Dyskusja

Krytyczne kroki w protokole

Jakość próbki jest kluczowa dla dokładnego iloczynu minimalnej choroby (MRD) i ilości leukocytów pnia (LSC). Świeże próbki szpiku kostnego powinny być transportowane w temperaturze pokojowej i przetwarzane najlepiej w ciągu 24–48 h, a jeśli to konieczne, w ciągu 72 h po pobraniu²³. Hemodilucję należy oceniać w każdym punkcie czasowym i uwzględniać w raporcie przepływu klinicznego. Klinik powinien określić punkt czasowy leczenia, na przykład po indukcji, konsolidacji, ukierunkowanej immunoterapii, mniej intensywnym leczeniu, takim jak azacytydyna/wenetoklaks lub allotransplantacji. Krajobraz różnicowania jest ściśle związany z leczeniem i punktem czasowym i jest ważny do zintegrowania interpretacji MRD. Podczas długotrwałego nadzoru należy utrzymywać tę samą czułość instrumentu i niezawodność analizy poprzez regularne sprawdzanie wartości docelowych za pomocą tęczy kontrolnej, regularne EQA i kolegialne przeglądanie plików FCS w całym badaniu.

Wysoki poziom standaryzacji i międzyośrodkowej niezawodności ilościowej MRD przepływu utrzymywany jest poprzez regularne szkolenia edukacyjne w grupie przepływowej. Co najmniej jedna sesja szkoleniowa internetowa miesięcznie była przeprowadzana, a ponad 100 przypadków ilościowej MRD LAIP/DfN, MRD LSC lub diagnostycznej ilościowej LSC było omawianych i przeglądanych w ciągu tych lat. Ta edukacja ciągła jest ważna, ponieważ interpretacja danych przepływowych wymaga wysoko wykwalifikowanego biologa, szczególnie dla niskiej ilości MRD, fizjologicznych populacji tła, odradzającego się szpiku i zmian fenotypowych podczas leczenia.

Iloscjonowanie populacji wzbogaconych LSC CD34⁺CD38⁻ jest kolejnym krytycznym krokiem. Nie ma uniwersalnego markera do uchwycenia normalnych komórek macierzystych krwiotwórczych lub LSC. Grupa HOVON wprowadziła monitorowanie LSC w diagnostyce i nadzorze AML, używając 8-kolorowej paneli, w tym zestawu odpowiednich "dychotomicznych" markerów LSC³. Markery dychotomiczne są definiowane jako wykazujące brak ekspresji w normalnych komórkach macierzystych krwiotwórczych, ale dodatnią ekspresję w populacjach wzbogaconych LSC, z ciemnymi, średnimi, wysokimi, heterogenicznymi lub dwuskładnikowymi wzorami. Istnieje zainteresowanie uwzględnieniem mieszanki specyficznych dychotomicznych markerów LSC, takich jak CLL1, TIM3 i CD97, w jednym kanale, ponieważ jeśli tylko jeden jest dodatni, wzbogacone LSC komórki nadal mogą być wykryte. Inne markery powinny być używane osobno w określonych kanałach, ponieważ ich ekspresja może nakładać się na ekspresję normalnych komórek macierzystych krwiotwórczych, w zależności od stanu szpiku, w tym odradzającego się lub zestresowane szpiku²⁴. Kompletna definicja komórek wzbogaconych LSC opiera się na operatorach Boole'a, w tym aberracyjnej ekspresji markerów w frakcji CD34⁺CD38⁻. Ponieważ to nadal jest definicja fenotypowa, populacja powinna być interpretowana jako komórki LSC wzbogacone CD34⁺CD38⁻ zamiast funkcjonalnie udowodnionych LSC w każdej próbce. Ten panel LSC jest również stosowany u pacjentów z przewlekłym szpikiem z nadmierną liczbą blastów i AML MRC, stosując ten sam protokół.

Modyfikacje i rozwiązywanie problemów metody

Podczas ewolucji platformy i panelu, podejście standardyzacyjne/harmonizacyjne musi być utrzymywane w sieci laboratorium, szczególnie podczas przejścia od 8- do 10-kolorowych paneli do 12- do 13-kolorowych paneli. Wraz z ewolucją maszyn, istnieje potrzeba zachowania wspólnej podstawy przeciwciał i tej samej czułości w wykrywaniu anomalii fenotypowych w całym badaniu klinicznym. Podczas ewolucji platformy, fluorochromy przeciwciał w podstawie pozostają stabilne i wspólne dla wszystkich maszyn (CD34/CD38/CD45/CD117). Jednak dla niektórych kanałów, zmiana fluorochromów jest konieczna ze względu na maszynę-specyficzną bank optyczny, co wymaga podejścia harmonizacyjnego. Podczas przełączania się z cytometru detektora PMT na cytometr detektora APD, należy wziąć pod uwagę wysoką czułość detektorów APD na wysokich długościach fal. Dlatego w niektórych przypadkach, wybór fluorochromów dla niektórych przeciwciał musi zostać dostosowany, aby zachować ten sam indeks barwienia i uniknąć nadmiernego rozproszenia między kanałami, stosując w ten sposób podejście optymalizacyjne. Obecne kliniczne cytometry obsługują panele 12- do 13-kolorowe, zwiększając specyficzność w wykrywaniu LAIP i poprawiając interpretację poprzez dodanie markerów, które eliminują zanieczyszczające komórki w bramie MRD. Jednak to również zwiększa złożoność analizy²³.

Ulepszenie z 8-kolorowych do 12-kolorowych paneli poprawiło czułość i specyficzność oceny MRD w niektórych przypadkach (Plik uzupełniający 1). W Probie 1, dodano HLA-DR, CD36, CD10 i CD56, oddzielone od CD7. W Probie 2, dodano HLA-DR, CD36, CD200 i CD19. W Probie 3, dodano

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Antibodies (CANTO 8C-LYRIC12C)	Fluorochrome	Company	Catalog Number
CD90	FITC	BD Pharmingen	555595
CD7	FITC	BD Bioscience	332773
CD13	PE	BD Bioscience	347406
CD33	PerCPCy5,5	BD Bioscience	333146
CD117	BV421	BD Bioscience	563856
CD38	PeCy7	BD Bioscience	335825
CD34	APC	BD Bioscience	345804
CD45RA	APCH7	BD Pharmingen	560674
CD19	APCH7	BD Bioscience	641395
CD45	V500	BD Bioscience	560777
CD97	PE	BD Pharmingen	555774
TIM3(CD366)	PE	BD Pharmingen	563422
CLL1(CD371)	PE	BD Pharmingen	562566
CD123	PerCPcy5.5	BD Pharmingen	558714
CD15	FITC	BD Bioscience	332778
CD64	PE	BD Pharmingen	558592
CD11b	BV711	BD Bioscience	740771
CD4	APCH7	BD Bioscience	641398
HLADR	APC-R700	BD Horizon	565127
CD56	BV605	BD Horizon	562780
CD14	BV605	BD Horizon	564054
CD200	BV605	BD Biosciences	562853
CD10	BV711	BD Biosciences	740770
CD36	BV786	BD Biosciences	745554
CD19	BV711	BD Biosciences	563036
Antibodies (NAVIOS 10C/DxFlex 12C/13C)	Fluorochrome	Company	Catalog Number
CD90	FITC	BD Pharmingen	555595
CD7 FITC	FITC	BC iotest	A07755
CD13	PE	BC iotest	A07762
CD33	PC5.5	BC iotest	B36289
CD117	SNV428	BC iotest	C76813
CD38	PEcy7	BDBioscience	335825
CD34	APC	BC iotest	IM2472
CD45RA	APCH7	BDBioscience	560674
CD19	AA750	BC iotest	A94681
CD45	KromeOrange	BC iotest	B36294
CD97	PE	BD Pharmingen	555774
TIM3(CD366)	PE	BD Pharmingen	563422
CLL1(CD371)	PE	BD Pharmingen	562566
CD123	PC5.5	BC iotest	B20022
HLADR	ECD	BC iotest	B92438
CD36	AA700	BC iotest	B46022
CD19	ECD	BC iotest	A07770
CD4	PE	BC iotest	A07751
CD11b	BV650	Bdhorizon	569704
CD14	AA750	BC iotest	B92421
HLADR	SNV786	BC iotest	C78087
CD56	AA700	BC iotest	B92446
CD64	BV605	Bdoptibuild	569172
CD36	BV605	BD Horizon	563518
CD10	BV650	Bdoptibuild	745390
CD15	FITC	BD	332778
CD200	BV650	Bdoptibuild	743085
BD FACSCanto II  (8-color, blue/red/violet)		BD Bioscience	338962
BD FACSLyric 3-Laser 12-Color Instrument		BD Bioscience	662383
BC NAVIOSNavios 10 Colors, 3 Lasers, B5-R3-V2 Configuration		Beckman Coulter	B47905
BC DxFLEX  13-Colors, 13 Detectors, 3 Laser,  B5-R3-V5		Beckman Coulter	C78505
BC Kaluza Software v 3.1		Bekman Coulter	A82959
BD FACSuite Software v1.6		BD  Bioscience	651360
BD FACSDiva software v 8.0.3 (Win 7 32 bit OS)		BD  Bioscience	659523
BD CST Beads		BD  Bioscience	656505
Multicolor COMPBEADS		BD  Bioscience	552843
Sphero Rainbow Calibration Particles (8 peaks), 3.0 - 3.4 µm		BD  Bioscience	559123
ClearL Lab Compensation Beads		Beckman Coulter	B99883
PharmLyse NH4Cl 100ml10x conc		BD  Bioscience	555899
DPBS, 1X		CORNING	21-031-CV
Brillant Stain Buffer Plus		BD  Bioscience	566385
MGG (May-Grünwald-Giemsa)		Sigma Aldrich	1014242500