Skuteczne Techniki Identyfikacji Odmian 61 Herbaty Olejkowej (Camellia Oleifera Abel) Za Pomocą Strategii MCID i Markerów DNA

Podsumowanie

Niniejsze badanie wykorzystało ręczny schemat identyfikacji odmian (MCID) uzyskanych z pasm Random Amplified Polymorphic DNA (RAPD) w celu skutecznego i powtarzalnego identyfikowania 61 odmian Camellia oleifera Abel dla wykorzystania zasobów genetycznych i identyfikacji odmian herbaty olejkowej.

Streszczenie

Istotnym jest zidentyfikowanie materiałów Camellia oleifera Abel [Herbaty (Ot)] i odmian do oceny zasobów zarodkowych i oceny mechanizmów ochrony odmian Ot. W badaniu zastosowano zoptymalizowaną technikę RAPD poprzez zwiększenie długości primerów RAPD i przesiewanie temperatury annealingu PCR, co pozwoliło na zidentyfikowanie 61 odmian Ot z różnych regionów. Ponadto, opracowano MCID do projektowania efektywnych markerów RAPD do identyfikacji odmian. Z 80 dowolnych 11-nukleotydowych primerów RAPD, 10 primerów wytwarzających wyraźne polimorficzne pasma (PB) zostało wybranych do analizy PCR 61 odmian. Co więcej, strategia MCID została zastosowana do manualnego odróżniania 61 odmian na podstawie PB zaobserwowanych w odciskach palców DNA z 10 primerów, co skutkowało wygenerowaniem diagramu identyfikacji odmian Ot (Ot-CID). Ten Ot-CID wskazywał każdą odmianę indywidualnie, wykorzystując PB do identyfikacji odmian, z odpowiednimi primerami dokładnie umieszczonymi na Ot-CID. Strategia MCID zapewnia prosty i praktyczny podejście do identyfikacji roślin za pomocą markerów DNA. Co więcej, to podejście zapewnia praktyczną i efektywną metodę identyfikacji odmian. Wynikający z tego Ot-CID 61 odmian Ot skutecznie odróżnił warianty Ot za pomocą markerów RAPD, ułatwiając różnicowanie odmian w celu ochrony praw odmianowych i wczesnej identyfikacji sadzonek w przemyśle szkółkarskim.

Wprowadzenie

Camellia oleifera Abel [Oil tea (Ot)] is among the most crucial woody edible oil tree species in the world¹. China is considered the origin and diversity hub for Ot, with abundant germplasm resources². The ancient tradition of Ot, vegetative propagation, and diverse global breeding programs has resulted in the emergence of numerous cultivars³. The widespread global cultivation of Ot culture has resulted in cultivars with homonyms (distinct cultivars with the same name) and synonyms (cultivars with more than 1 name)⁴. Therefore, it is crucial to develop techniques for managing a vast range of Ot germplasm and accurately distinguishing various cultivars^3,5.

Despite the application of DNA-based molecular markers in cultivar characterization, genetic research, and Ot identification, which can elucidate genetic diversity and differentiate plant individuals, no study has successfully identified a substantial number of Ot cultivars or provided a reliable basis for cultivar differentiation^6,7,8,9. The lack of reliable methods is the primary limitation for the application of DNA markers in plant crop identification. This might be because the analytical techniques used for DNA fingerprints cannot yield pertinent information that distinctly specifies primers and polymorphic markers for differentiating the cultivars that require identification. The analytic techniques for DNA banding patterns (called cluster analyses) are unsuitable for effectively distinguishing cultivars or species.

Although DNA molecular identification cards (IDs) have been developed for over 200 Ot cultivars utilizing SNP markers^2,3,10,11, there are still several challenges: (1) The Ot genome is complex, with the majority of cultivated camellias being hexaploid, while the reference genome utilized for constructing the DNA molecular IDs is triploid, which may result in certain inaccuracy³. (2) Whole-genome sequencing is expensive, specifically for laboratories with limited facilities, preventing its widespread application for large-scale variety analysis. Furthermore, PCR amplification products necessitate sequencing or fluorescence detection, further complicating process¹². (3) In the absence of distinguishing markers for new varieties, it is necessary to develop new marker primers, which will also require the re-coding of ID card codes for existing types. This results in an overwhelming quantity of code positions, diminishing the efficacy of variety differentiation. Therefore, it is essential to employ technique that provides easy, reliable, referable, and practical verification of Ot cultivars for the Ot nursery sector, agricultural business, plant patent protection, and the conservation and assessment of genetic resources⁵.

Traditional strategies for cultivar identification relied on morphological, physiological, and agronomic characteristics, but these characteristics have limits as they are susceptible to environmental influences and require a comprehensive evaluation of fully developed plants^13,14. Furthermore, molecular markers have the distinct benefit of being unaffected by environmental variables, thus serving as an efficient tool for the accurate characterization of cultivars^14,15. Recently, various DNA-based indices have been established for assessing fingerprinting, genetic diversity, cultivar, and purity^{16,17,18,19,20,21,22}. The RAPD marker is advantageous for cultivar analysis because of its simplicity, efficiency, and the non-requirement of previous sequence data^23,24. The RAPD approach can be enhanced by selecting 11-nucleotide (nt) primers along with their specified PCR annealing temperature for its application in plant fingerprinting, therefore establishing RAPD as a preferable method for plant variety identification and genetic diversity evaluation^25,26. These markers have been extensively utilized in crop differentiation and genetic correlation studies of various plant species, including apricot²⁷, Ornamental peach²⁸, pomegranate²⁹, landraces²⁰, and walnut³⁰(Çilesiz et al., 2025). Despite their widespread use, many DNA marker-based approaches remain insufficiently practical or streamlined for routine plant variety identification.

Therefore, this study utilized a novel analytical technique for the reproducible identification of various Ot cultivars. The MCID derived from RAPD banding patterns differentiated 61 Ot cultivars for germplasm resource utilization and cultivar identification.

The RAPD-MCID strategy described herein (Figure 1) is most appropriate for small- to medium-scale germplasm characterization in laboratories with standard PCR and gel electrophoresis infrastructure but limited access to sequencing facilities. It is also well-suited for rapid, cost-effective preliminary screening before more detailed genetic analysis. The method’s primary operational limits include its reliance on dominant markers and the need for careful standardization of PCR conditions to ensure across-laboratory reproducibility. For large-scale germplasm banks or legal variety registration, complementary use of co-dominant markers such as SSRs or SNPs is recommended.

Protokół

1. Materiał roślinny

1. Zbierz młode liście ze zdrowych, aktywnie rosnących pędów każdego kultywaru herbaty roślinnej z Narodowego Zbioru Genotypów Kamelii, Hrabstwo Shucheng, Prowincja Anhui.
2. Skorzystaj z Tabeli 1 w celu poznania nazw i pochodzenia tych kultywarów.

2. Ekstrakcja genomowej DNA

1. Ekstrahowaną całkowitą genomową DNA za pomocą zestawu do ekstrakcji DNA roślinnej zgodnie z instrukcjami producenta.
2. DNA zostało elucyjne buforem 1× TE. Po elucji upewnij się, że wyekstrahowany roztwór DNA wygląda klarownie i bezbarwnie. Zmierz stężenie DNA za pomocą mikrowolumenowego spektrofotometru.
3. Dostosuj stężenie DNA do 30 ng·μL^-1 buforem 1× TE i przechowuj dostosowany roztwór DNA w temperaturze -20 °C.

3. Selekcja primerów RAPD

1. Opracuj 80 losowych primerów dla analizy RAPD i przeanalizuj je u kilku genotypów. Wybierz 11-nukleotydowe primery RAPD, które produkują jasne i jednoznaczne wzorce pasm wśród wszystkich przebadanych genotypów.
2. Użyj wybranych primerów do genotypowania, aby zwiększyć wiarygodność amplifikowanej fragmentów. Wybierz 10 dobrze rozdzielonych primerów z powtarzalnymi pasmami do dalszej analizy, jak wymieniono w Tabeli 2.

4. Polimorficzne DNA amplikowane losowo (RAPD) PCR

1. Przygotuj reakcje amplifikacyjne, lekko modyfikując wcześniej opisanyą metodę²³. Przygotuj roztwory reakcji zgodnie z składem wymienionym w Tabeli S1.
2. Przeprowadź PCR za pomocą termocyklera w następujących warunkach: pre-denaturacja w 94 °C przez 5 min; 42 cykli denaturacji w 94 °C przez 30 s, hybrydyzacja przez 1 min w zoptymalizowanej temperaturze wymienionej w Tabeli 2, oraz ekstensja w 72 °C przez 2 min; i końcowa ekstensja w 72 °C przez 10 min.

5. Wykrywanie i analiza produktów PCR

1. Oddziel amplifikowany fragment DNA przez elektroforezę w żelu przy 100 V w 1,3% agarozy (w/v) przygotowanej w buforze 1× TAE zawierającym 0,001 M EDTA i 0,04 M Tris-octanu o pH 8,0. Wybarw żele bromkiem etydyny w stężeniu 0,5 μg·μL^-1.
   UWAGA: Bromek etydyny jest silnym mutagenem. Podczas pobierania roztworów bromku etydyny lub wybarwionych żeli należy używać odpowiedniego sprzętu ochrony osobistej.
2. Uruchom żel przy stałym napięciu 100 V przez 45–60 min, lub do momentu, gdy przód barwnika bromofenolu przemieścił się około dwie trzecie długości żelu. Po wybarwieniu i usunięciu barwnika obserwuj żel pod UV transiluminacją.
   UWAGA: Upewnij się, że odrębne pasma DNA są wyraźnie widoczne pod UV transiluminacją. Upewnij się, że drabinka DNA wykazuje ostre, dobrze rozdzielone pasma w zakresie od 100 bp do 2000 bp.
3. Zarejestruj polimorficzne pasma (PB) kultywarów w oparciu o ich obecność lub nieobecność pod światłem ultrafioletowym.
4. Przeprowadź każdą amplifikację PCR potrójnie, aby zapewnić powtarzalność. Oznacz tylko pasma, które są konsekwentnie obecne lub nieobecne we wszystkich trzech niezależnych repliktach dla analizy dółstrumiowej. Upewnij się, że wskaźnik zgodności oznaczania pasm między repliką przekracza 95%.

6. Analiza danych

1. Oznacz pasma dla identyfikacji kultywarów na podstawie ich obecności lub nieobecności, przypisując „+ o” do wyraźnie widocznych pasm i „– ” do nieobecnych pasm na odpowiedniej pozycji rozmiaru molekularnego we wszystkich kultywarach. Uwzględnij tylko pasma, które są konsekwentnie obserwowane we trzech niezależnych replik.
2. Sklasyfikuj kultywary z odrębnymi pasmami w odciskach palców wyprodukowanymi przez pojedynczy primer niezależnie. Sklasyfikuj kultywary o identycznych wzorach pasm w tym samym podgrupie. Różnicuj wszystkie kultywary herbaty roślinnej stopniowo i całkowicie na podstawie tych parametrów.

7. Zastosowanie i efektywność diagramu w identyfikacji kultywarów

1. Losowo wybierz dwie grupy kultywarów herbaty roślinnej z wewnątrz i między grupami, aby zweryfikować zastosowanie i funkcjonalność diagramu ilustrującego 61 kultywarów herbaty roślinnej. Przeprowadź selekcję manualnie, odwołując się do różnych gałęzi diagramu Ot-CID, bez użycia jakiegokolwiek oprogramowania.
   UWAGA: Losowo wybrano 2 grupy kultywarów Ot w celu zweryfikowania zastosowania i funkcjonalności diagramu ilustrującego 61 kultywarów Ot.
2. Oznacz dwie wybrane grupy jako „A” i „B”. Przesiej odpowiednie primery dla każdej grupy z Ot-CID.

8. Wytyczne dotyczące usuwania niebezpiecznych odpadów

<

Wyniki

Przedstawione tu wyniki reprezentatywne ilustrują kompletny przepływ pracy strategii RAPD-MCID, od początkowego przesiewania primerów przez hierarchiczną dyskryminację odmian do ostatecznej walidacji. Proces dyskryminacji krok po kroku jest dokumentowany w Rysunek 2, Rysunek 3, Rysunek 4, Rysunek 5,

Dyskusja

Markery DNA są mocnymi narzędziami służącymi do identyfikacji odmian i gatunków roślin²⁴. Markery te zostały opracowane i wykorzystane w tysiącach badań nad analizą genetyczną, identyfikacją odmian itd.; jednakże nie są one ani łatwe, ani powszechnie wykorzystywane w genotypowaniu^24,31. Jest to spowodowane brakiem wydajnych i prostych metod, które wykorzystywałyby markery DNA do identyfikacji odmian, drzew filogenetycznych lub lin...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Centrifuge	Eppendorf,Germany	5427R	Używany do ekstrakcji genomowej DNA z liści herbaty olejkowej
Hi-DNAsecure Plant Kit	Tiangen, China	DP350	Używany do ekstrakcji genomowej DNA z liści herbaty olejkowej
Instrument do amplifikacji genowej PCR	Monad, China	MP60901	Używany do amplifikacji PCR
SolarRed Agarose LE	Solarbio, China	A8202	Używany do elektroforezy fragmentów PCR
TAE	Tsingke, China	TSG001	Używany do elektroforezy fragmentów PCR
TaKaRa Ex Taq	Takara, Japan	RR001A	Używany do amplifikacji PCR
Spektrofotometr Thermo Scientific NanoDrop 2000C	ABI,USA		Używany do oznaczania stężenia RNA